Här presenterar vi ett detaljerat protokoll av (A) identifieringen av en naturlig produkt med antibiotisk aktivitet, (B) rening av föreningen, (C) den första modellen av dess biosyntes, (D) genom sekvensering / -mining och ( E) kontroll av den biosyntetiska genklustret.
Streptomyces-stammar är kända för sin förmåga att producera en mängd olika föreningar med olika bioaktiviteter. Odling under olika förhållanden leder ofta till produktion av nya föreningar. Därför är produktions kulturer av stammarna extraherades med etylacetat och de råa extrakten analyserades med HPLC. Vidare är extrakten testas för deras bioaktivitet genom olika analyser. För struktur belysning föreningen av intresse renas genom en kombination av olika kromatografiska metoder.
Genome sekvense i kombination med genombrytning möjliggör identifiering av en naturlig produkt biosyntetiska genkluster med olika dataprogram. För att bekräfta att den korrekta genklustret har identifierats, geninaktivering experiment måste utföras. De resulterande mutanterna analyseras med avseende på produktion av den specifika naturliga produkten. När korrekt genklustret har inaktiverats, denstammen skulle misslyckas att framställa föreningen.
Arbetsflödet visas för den antibakteriella föreningen polyketomycin produceras av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Cirka tio år sedan, när genomsekvense var fortfarande mycket dyra, kloningen och identifieringen av ett genkluster var en mycket tidskrävande process. Snabb genomsekvense kombination med genombrytning accelererar rättegången mot kluster identifiering och öppnar upp nya sätt att utforska biosyntes och att generera nya naturliga produkter av genetiska metoder. Protokollet som beskrivs i detta dokument kan tilldelas någon annan förening som härrör från en Streptomyces-stam eller en annan mikroorganism.
Naturliga produkter från växter och mikroorganismer har alltid varit en viktig källa för klinisk läkemedelsutveckling och forskning. Den första antibiotikum Penicillin upptäcktes 1928 från en svamp av Alexander Fleming ett. Numera är många fler naturliga produkter som används i klinisk behandling.
Ett släkte känd för sin förmåga att producera olika typer av sekundära metaboliter med olika bioaktiviteter är Streptomyces. Streptomyces är grampositiva bakterier och tillhör klassen av aktinobakterier och ordningen Actinomycetales. Nästan två tredjedelar av de kliniskt använda antibiotika härrör från Actinomycetales, främst från Streptomyces, som amfotericin 2, daptomycin tre eller tetracyklin 4. Två Nobelpris har delats ut inom Streptomyces antibiotikaforskning. Den första gick till Selman Waksman för upptäckten av streptomycin, den första entibiotic effektiva mot tuberkulos. 5 År 2015, som en del av Nobelpriset i fysiologi och medicin, upptäckten av avermektin från S. avermitilis fick också. Avermektin används för behandling av parasitsjukdomar 6,7.
Den traditionella metoden för upptäckten av naturliga produkter i mikroorganismer såsom Streptomyces involverar generellt odling av stammen under olika tillväxtbetingelser, samt extraktion och analys av sekundära metaboliter. Bioaktivitetsanalyser (t.ex. analyser för antibakteriell och anticanceraktivitet) utförs för att detektera aktiviteten hos föreningen. Slutligen är föreningen av intresse isoleras och den kemiska strukturen belyses.
Strukturerna av naturprodukter ofta består av enskilda delar som bildar komplexa molekyler. Det finns några, men begränsade, stora biosyntetiska vägar som leder till att bygga blockks, som används för biosyntesen av naturliga produkter. De stora biosyntetiska vägar är polyketid vägar, vägar som leder till terpenoider och alkaloider, vägar med hjälp av aminosyror, och vägar som leder till sockerdelar. Varje väg kännetecknas av en uppsättning av specifika enzymer 8. Baserat på strukturen av föreningen, kan dessa biosyntetiska enzymer förutsägas.
Numera kan en detaljerad strukturell analys av en förening i kombination med nästa generations sekvensering och bioinformatisk analys bidra till att identifiera den ansvariga biosyntetiska genklustret. Kluster informationen öppnar nya vägar för vidare forskning naturprodukt. Detta inkluderar heterologt uttryck för att öka utbytet av den naturliga produkten, målinriktad förening modifiering av gendeletion eller förändring och kombi biosyntesen med gener från andra vägar.
Polyketomycin isolerades oberoende från odlingsbuljong avtvå stammar, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 och Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. Strukturen belysas med NMR och röntgenanalys. Polyketomycin är sammansatt av en tetracyklisk decaketid och en dimetyl salicylsyra, förenade genom de två deoxysugar molekyldelar p-D-amicetose och α-L-axenose. Den visar cytotoxiska och antibiotisk aktivitet, även mot grampositiva multiresistenta stammar såsom MRSA 11.
Ett genomiskt kosmidbibliotek från S. diastatochromogenes Tü6028 genererades och screenades för många år sedan. Använda specifik gen sonder polyketomycin genen kluster med en storlek på 52,2 kb, innehållande 41 gener identifierades efter flera månader av intensivt arbete 12. Nyligen var ett utkast till genomsekvens av S. diastatochromogenes erhållna leder till snabb identifiering av polyketomycin biosyntetiska genklustret. I denna översikt, en metod att hjälpa till att idenderrätta en naturlig produkt och belysa dess biosyntetiska genklustret kommer att beskrivas, med hjälp av polyketomycin som ett exempel.
Här förklarar vi de enskilda åtgärder som leder från en naturlig produkt till dess biosyntetiska genkluster visas för polyketomycin produceras av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Protokollet innefattar identifiering och rening av en naturlig produkt med antibiotiska egenskaper. Ytterligare strukturanalys och jämförelse med resultat från genombrytning leder till identifieringen av den biosyntetiska genklustret. Detta förfarande kan tillämpas på någon annan förening härledd från en Streptomyces-stam eller någon annan mikroorganism.
In this lab a genomic cosmid library of Streptomyces diastatochromogenes was generated and screened many years ago, resulting in the identification of the polyketomycin gene cluster through an extremely time-consuming process. Characterization of single genes were possible using targeted gene deletions and analysis of the resulting mutants12. Recently, a draft genome sequence of S. diastatochromogenes was obtained allowing the fast identification of the polyketomycin biosynthetic gene cluster. We could easily detect the biosynthetic genes, although the draft genome sequence contains still many contigs. The described process can be achieved within months. However, the procedure comprises many steps. Single steps may fail several times, preventing progression to subsequent steps:
The genus Streptomyces is known for its capacity to produce bioactive compounds. While they carry often more than 20 biosynthetic gene clusters, usually only one or two compounds are produced under laboratory conditions. The application of the OSMAC approach (cultivation of one strain under different conditions) to wake up silent gene clusters may sometimes not be enough. Genetic manipulation of regulatory genes, such as the pleiotropic regulator genes adpA44 and bldA45,46, is also an effective method to activate the production of other secondary metabolites.
For the elucidation of the compound's structure, e.g. by NMR analysis, usually more than 2 mg of purified compound is necessary. Therefore, fermentation of more than 10 L culture is often required. Without a fermenter that is able to maintain oxygen, pH and temperature conditions, it might be challenging in a small lab to handle this amount of culture and subsequent extraction. During purification, the compound may be changed due to oxidation, radiation or temperature. Also, the more purification steps are used, the higher the chance of degradation.
When analyzing the structure of the natural product, and the clusters in the genome, sometimes it is not that easy to identify the appropriate cluster. Firstly, if there is only a draft genome sequence some part of the cluster may be missing. Secondly, not all genes which are required for the biosynthesis are in the cluster. Thirdly, sometimes a cluster is split into two parts separated from each other by many kilobases. Fourthly, it may be difficult to decide which one is the appropriate gene cluster. In case of large PKS type I or NRPS systems, where it is possible to calculate the number of extender units based on the number of modules, or even identify the single extender units by analysis of the selecting domains, it turns up easily. However, in the case of iteratively working enzymes the prediction of the synthesized compounds is often not possible, especially if the strain has more than 40 gene clusters. Fifthly, nature is highly complex and full of yet unknown compounds. Often the biosynthesis is a mixture of different pathways. If the new compound is not identified yet, or not related to another compound, it may be difficult to identify the cluster, to propose a biosynthesis model and to prove it.
Once the cluster is identified, the single crossover technique is a good and quick method to verify the hypothesis. PCR, cloning into a suicide vector, conjugation, selection of positive clones, and production assay are the only steps required. One disadvantage of this technique is that the integration of the vector into the chromosome is not stable due to further recombination events. Therefore, in order to further analyze single genes, precise gene deletions are required. Also it may be tricky to manipulate Streptomyces strains on the genetic level.
The described procedure can be assigned to any other compound produced by a Streptomyces strain or another microorganism. The knowledge about a biosynthetic gene cluster and its synthesized compound gives us further opportunities to modify already existing molecules with the aim of improving them for the fight against multidrug-resistant pathogens.
The authors have nothing to disclose.
S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of Tübingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).
agar | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5210.4 | |
agarose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6352.4 | |
D-mannitol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4175.1 | |
glucose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | |
LB | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X964.3 | |
malt extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X976.2 | |
MgCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2189.1 | |
Peptone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | ||
soy flour | W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany | Hensec-Vollsoja | |
tryptic soy broth | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X938.3 | Caso-Bouillon |
yeast extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Solvents | |||
Acetic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3738.5 | |
Acetone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9372.2 | |
Acetonitrile | Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands | JT-9012-03 | |
Dichlorofrom | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 1530754 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | |
DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D | ARMAR Chemicals, Döttingen, Switzerland | 15200.204 | |
Ethyl acetate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6784.4 | |
Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6331.4 | |
Methanol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 7342.1 | |
Enzymes | |||
restriction enzymes | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
polymerase | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment | Promega GmbH, Mannheim, Germany | ||
Antibiotics | |||
apramycin | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A7682.0005 | |
fosfomycin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany | P5396-50G | |
kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Plasmid/Vectors | |||
pKC1132 | Bierman et al. 1992 | ||
Primer | |||
pokPI_for | TGATGGTGCCGCTGGCCATGG | Primer to amplify fragment containing pokPI gene | |
pokPI_rev | AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC | ||
Bacterial strains | |||
Bacillus subtilis COHN ATCC6051 | Gram-positive test strain | ||
Escherichia coli ET12567 pUZ8002 | MacNeil et al., 1992 | strain for conjugation | |
Escherichia coli XL1 Blue | Agilient Technologies, Santa Clara, USA | Gram-negative test strain + cloning host | |
Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 | Paululat et al., 1999 | Polyketomycin producer | |
Online services | |||
antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell) | http://antismash.secondarymetabolites.org/ | Detection of secondary metabolite gene cluster | |
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | finds regions of similarity between biological sequences | |
GenDB | https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb | Annotation of ORFs | |
MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) | http://mibig.secondarymetabolites.org/ | Database of biosyntetic gene clusters | |
NaPDoS | http://napdos.ucsd.edu/ | Detection of seconary metabolite gene cluster | |
NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ | Annotation of ORFs | |
NRPSpredictor | http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ | Detection of NRPS domains | |
Prokka (rapid prokaryotic genome annotation) | http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml | Annotation of ORFs | |
RAST (rapid annotation using subsystems technology) | http://rast.nmpdr.org/ | Annotation of ORFs | |
other programs | |||
Chem Station Rev. A.09.03 | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | Handling program for HPLC | |
Clone Manager Suite 7 | Scientific and Educational Software, Cary, USA | Designing Cloning Experiment | |
Newbler v2.8 | Roche Diagnostics | Alignment of sequencing reads | |
Machines | |||
Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | ||
HPLC/MS | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Autosampler: G1313A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Column:Xbridge C18 (100 mm × 4.6 mm; Particle size: 3.5 μm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Degasser: G1322A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quarternary pump: G1311A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Diode array detector (DAD )G1315B (λ = 254 nm and 400 nm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
rotary evaporator | |||
_heating bath Hei-VAP Value/G3 | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany | ||
_vacuum pump system SC 920 G | KNF Global Strategies AG, Sursee, Switzerland | ||
other material | |||
Sephadex LH20 | GE Healthcare, | ||
Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 µm; filter Ø15 mm) | MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Germany | ||
SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g) | Waters GmbH, Eschborn, Germany | ||
E. coli | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Bacillus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Streptomyces sp. | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
for agar plates add 2 % agar |