Her presenterer vi en detaljert protokoll av (A) identifisering av et naturlig produkt med antibiotisk aktivitet, (B) rensingen av forbindelsen, (C) den første modellen av dens biosyntese, (D) genomsekvensering / -mining og ( E) verifisering av den biosyntetiske gen-klynge.
Streptomyces-stammer som er kjent for sin evne til å produsere en rekke forskjellige forbindelser med forskjellige bioaktivitet. Dyrking under forskjellige betingelser fører ofte til fremstilling av nye forbindelser. Derfor er produksjons kulturer av stammene ble ekstrahert med etylacetat og de urene ekstrakter analysert ved HPLC. Videre er ekstraktene testet for deres bioaktivitet ved forskjellige analyser. For klarlegging struktur forbindelsen av interesse renses ved en kombinasjon av forskjellige kromatografiske metoder.
Genomsekvensering kombinert med genomet gruvedrift tillater identifikasjon av et naturlig produkt biosyntetiske gen-klynge bruke forskjellige dataprogrammer. For å bekrefte at den korrekte clusteret har blitt identifisert, geninaktivering eksperimenter må utføres. De resulterende mutanter blir analysert for produksjon av det spesielle naturprodukt. Når riktig clusteret er blitt inaktivert, ibelastning skulle svikte for å fremstille forbindelsen.
Arbeidsflyten er vist for den antibakterielle sammensatte polyketomycin produsert av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Rundt ti år siden, da genomsekvense var fortsatt veldig dyrt, kloning og identifisering av et gen klynge var en svært tidkrevende prosess. Fast genomsekvensering kombinert med genom gruvedrift akselererer rettssaken mot klyngen identifikasjon og åpner opp for nye måter å utforske biosyntese og å generere nye naturlige produkter av genetiske metoder. Protokollen som er beskrevet i denne artikkelen kan tilordnes en hvilken som helst annen forbindelse avledet fra en Streptomyces-stamme eller en annen mikroorganisme.
Naturlige produkter fra planter og mikroorganismer har alltid vært en viktig kilde for klinisk narkotika utvikling og forskning. Den første antibiotika penicillin ble oppdaget i 1928 av en sopp av Alexander Fleming 1. I dag er mange mer naturlige produkter som brukes i klinisk behandling.
En slekten kjent for sin evne til å produsere ulike typer sekundære metabolitter med forskjellige bioaktivitet er Streptomyces. Streptomyces er Gram-positive bakterier og tilhører klassen av aktinobakterier og rekkefølgen Actinomycetales. Nesten to tredjedeler av klinisk brukt antibiotika er hentet fra Actinomycetales, hovedsakelig fra Streptomyces, som amfotericin 2, daptomycin 3 eller tetracyklin 4. To Nobelpriser er tildelt innen Streptomyces antibiotika forskning. Den første gikk til Selman Waksman for oppdagelsen av streptomycin, den første entibiotic effektiv mot tuberkulose. 5 I 2015, som en del av Nobelprisen i fysiologi og medisin, oppdagelsen av avermectin fra S. avermitilis ble tildelt som tillegg. Avermectin brukes for behandling av parasittsykdommer 6,7.
Den tradisjonelle tilnærming til oppdagelsen av naturlige produkter i mikroorganismer så som Streptomyces innebærer generelt dyrking av stammen under forskjellige vekstbetingelser, så vel som ekstraksjon og analyse av sekundære metabolitter. Bioaktiviteten assays (f.eks analyser for antibakteriell og anticancer aktivitet) er utført for å detektere aktiviteten til forbindelsen. Endelig er forbindelsen av interesse isoleres og den kjemiske strukturen er klarlagt.
Strukturene av naturlige produkter er ofte sammensatt av enkeltdelene som danner komplekse molekyler. Det er noen få, men begrenset, store biosyntetiske veier som fører til å bygge blokkenks, som brukes for biosyntesen av naturlige produkter. De store biosyntetiske reaksjonsveier er de polyketide veier, veier som fører til terpenoider og alkaloider, trasé ved hjelp av aminosyrer og veier som fører til sukkerdeler. Hver vei er preget av et sett av spesifikke enzymer 8. Basert på strukturen til forbindelsen, kan disse biosyntetiske enzymer forutsies.
I dag kan det detaljert strukturell analyse av en forbindelse i kombinasjon med neste generasjon sekvensering og analyse bioinformatiske bidra til å identifisere den ansvarlige biosyntetiske gen-klynge. Klyngen informasjon åpner opp nye måter for videre naturprodukt forskning. Dette omfatter heterolog ekspresjon for å øke utbyttet av det naturlige produkt, målrettet forbindelse modifikasjon av genet delesjon eller endringer og kombinatoriske biosyntesen med gener fra andre veier.
Polyketomycin ble isoleres uavhengig fra dyrkningsbuljongento stammer, Streptomyces sp. MK277-AF1 9 og Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 10. Strukturen ble undersøkt ved NMR og røntgenanalyse. Polyketomycin er sammensatt av et tetracyklisk decaketid og en dimetyl-salicylsyre, forbundet med de to molekyldelene deoxysugar p-D-amicetose og α-L-axenose. Den viser cytotoksisk og antibiotisk aktivitet, også mot grampositive multiresistente stammer slik som MRSA 11.
Et genomisk bibliotek av kosmid S. diastatochromogenes Tü6028 ble dannet og undersøkt for mange år siden. Ved hjelp av spesifikke gener i polyketomycin genet cluster med en størrelse på 52,2 kb, som inneholder 41 gener ble identifisert etter flere måneder med intens jobbing 12. Nylig ble et utkast genomsekvens S. diastatochromogenes innhentet fører til rask identifisering av polyketomycin biosyntetiske genet klynge. I denne oversikten, en metode bidrar til Idensere et naturlig produkt og belyse dens biosyntetiske gen-klynge bli beskrevet, ved hjelp av polyketomycin som et eksempel.
Her forklarer vi de enkle trinn som fører fra et naturlig produkt av sin biosyntetiske genet klynge vist for polyketomycin produsert av Streptomyces diastatochromogenes Tü6028. Protokollen omfatter identifisering og rensing av et naturlig produkt med antibiotiske egenskaper. Ytterligere strukturell analyse og sammenligning med resultatene fra genomet gruvedrift føre til identifikasjon av de biosyntetiske gen-klynge. Denne fremgangsmåten kan anvendes på en hvilken som helst annen forbindelse avledet fra en Streptomyces-stamme eller en hvilken som helst annen mikroorganisme.
I denne prøve et genomisk cosmid bibliotek av Streptomyces diastatochromogenes ble generert og vist for mange år siden, noe som resulterer i identifikasjonen av polyketomycin-klyngen gjennom en meget tidkrevende prosess. Karakterisering av enkeltgener var mulig ved hjelp av målrettede genet slettinger og analyse av de resulterende mutanter 12. Nylig ble et utkast genomsekvens S. diastatochromogenes innhentet tillater rask identifisering av polyketomycin biosyntetiske genet klynge. Vi kunne lett gjenkjenne biosyntetiske gener, selv om utkastet genomsekvens inneholder fortsatt mange contigs. Den beskrevne fremgangsmåte kan oppnås i løpet av måneder. Imidlertid omfatter fremgangsmåten mange trinn. Enkle trinn kan mislykkes flere ganger, og hindrer progresjon til påfølgende trinn:
Slekten Streptomyces er kjent for sin evne til å produsere bioaktive forbindelser. Mens de bærer ofte mer enn 20 biosynthetic gensamlingene, vanligvis bare en eller to forbindelser som er fremstilt under laboratoriebetingelser. Anvendelsen av OSMAC metoden (dyrking av en stamme under forskjellige betingelser) for å vekke opp stille gensamlingene noen ganger kan det ikke være nok. Genetisk manipulering av regulatoriske gener, slik som de pleiotrope regulatoriske gener ADPA 44 og bldA 45,46, er også en effektiv metode for å aktivere produksjonen av andre sekundære metabolitter.
For klarlegging av den sammensatte struktur, for eksempel ved NMR-analyse, er nødvendig vanligvis mer enn 2 mg av renset forbindelse. Derfor er gjæring av mer enn 10 l kultur ofte nødvendig. Uten en fermenter som er i stand til å opprettholde oksygen, pH og temperaturforhold, kan det være utfordrende i et lite laboratorium for å håndtere denne mengden av kultur og påfølgende utvinning. Under rensing, kan forbindelsen bli endret på grunn av oksydasjon, bestråling eller temperatur.Dessuten er flere rensetrinn anvendes, jo høyere er sjansen for degradering.
Ved å analysere strukturen av det naturlige produktet, og de klynger i genomet, noen ganger er det ikke så lett å finne passende klynge. For det første, hvis det bare er et utkast genomsekvens noen del av klyngen kan mangle. For det andre, ikke alle gener som er nødvendige for biosyntesen er i klyngen. For det tredje, noen ganger i en klynge er delt i to deler adskilt fra hverandre ved hjelp av flere kilobaser. For det fjerde kan det være vanskelig å avgjøre hvilken som er den riktige genet klyngen. Ved stor PKS type I eller NRPS systemer, hvor det er mulig å beregne antall extender enhetene basert på antall av moduler, eller til å identifisere de enkelte extender enhetene ved analyse av velge domener, viser det seg lett. Imidlertid, i tilfelle av gjentatte arbeidsenzymene prediksjonen av de syntetiserte forbindelsene er ofte ikke mulig, særlig hvis strai mer enn 40 gensamlingene. For det femte er naturen svært kompleks og full av ukjente forbindelser. Ofte biosyntesen er en blanding av ulike baner. Hvis den nye forbindelsen ikke er identifisert ennå, eller ikke er knyttet til en annen forbindelse, kan det være vanskelig å identifisere klyngen, å foreslå en modell biosyntese og å påvise den.
Når klyngen er identifisert, er det enkelt crossover teknikken en god og rask metode for å bekrefte hypotesen. PCR, kloning inn et selvmord vektor, konjugasjon, valg av positive kloner, og produksjon analysen er de eneste skritt som kreves. En ulempe med denne teknikken er at integrasjonen av vektoren i kromosomet er ikke stabil grunnet ytterligere rekombinasjonshendelser. Derfor, for ytterligere å analysere enkeltgener, er nøyaktige gendelesjoner nødvendig. Også det kan være vanskelig å manipulere Streptomyces stammer på genetisk nivå.
Den beskrevne fremgangsmåte kan tildeles to en hvilken som helst annen forbindelse fremstilt ved en Streptomyces-stamme eller en annen mikroorganisme. Kunnskapen om en biosyntetiske gen-klynge og dens syntetiserte sammensatte gir oss ytterligere muligheter til å modifisere allerede eksisterende molekyler med det formål å forbedre dem for kampen mot multiresistente patogener.
The authors have nothing to disclose.
S. Zhang is funded by China Scholarship Council. The authors are very grateful to former people working on polyketomycin project in this lab and Prof. Dr. Hans-Peter Fiedler, University of Tübingen, for providing the polyketomycin producer. The research was supported by the DFG (RTG 1976).
agar | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 5210.4 | |
agarose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6352.4 | |
D-mannitol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4175.1 | |
glucose | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6780.1 | |
LB | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X964.3 | |
malt extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X976.2 | |
MgCl2 | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2189.1 | |
Peptone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | ||
soy flour | W.Schoenemberger GmbH, Magstadt, Germany | Hensec-Vollsoja | |
tryptic soy broth | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | X938.3 | Caso-Bouillon |
yeast extract | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 2363.2 | |
Solvents | |||
Acetic acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 3738.5 | |
Acetone | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 9372.2 | |
Acetonitrile | Avantor Performance Materials B.V., Deventer, The Netherlands | JT-9012-03 | |
Dichlorofrom | Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Germany | 1530754 | |
DMSO (Dimethyl sulfoxide) | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 4720.1 | |
DMSO-d6 (Dimethyl sulfoxide-d6) 99.9atom%D | ARMAR Chemicals, Döttingen, Switzerland | 15200.204 | |
Ethyl acetate | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6784.4 | |
Hydrochloric acid | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 6331.4 | |
Methanol | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | 7342.1 | |
Enzymes | |||
restriction enzymes | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
polymerase | New England Biolabs GmbH, Frankfurt am Main, Germany | ||
DNA Polymerase I Large (Klenow) Fragment | Promega GmbH, Mannheim, Germany | ||
Antibiotics | |||
apramycin | AppliChem GmbH, Darmstadt, Germany | A7682.0005 | |
fosfomycin | Sigma-Aldrich Chemie GmbH, Taufkirchen, Germany | P5396-50G | |
kanamycin | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | T832.2 | |
Plasmid/Vectors | |||
pKC1132 | Bierman et al. 1992 | ||
Primer | |||
pokPI_for | TGATGGTGCCGCTGGCCATGG | Primer to amplify fragment containing pokPI gene | |
pokPI_rev | AGCGTTCACTGTTCCGCCCGAC | ||
Bacterial strains | |||
Bacillus subtilis COHN ATCC6051 | Gram-positive test strain | ||
Escherichia coli ET12567 pUZ8002 | MacNeil et al., 1992 | strain for conjugation | |
Escherichia coli XL1 Blue | Agilient Technologies, Santa Clara, USA | Gram-negative test strain + cloning host | |
Streptomyces diastatochromogenes Tü6028 | Paululat et al., 1999 | Polyketomycin producer | |
Online services | |||
antismash (Antibiotics and Secondary Metabolite Analysis Shell) | http://antismash.secondarymetabolites.org/ | Detection of secondary metabolite gene cluster | |
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) | http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi | finds regions of similarity between biological sequences | |
GenDB | https://www.uni-giessen.de/fbz/fb08/Inst/bioinformatik/software/gendb | Annotation of ORFs | |
MiBIG (Minimum Information about a Biosynthetic Gene cluster) | http://mibig.secondarymetabolites.org/ | Database of biosyntetic gene clusters | |
NaPDoS | http://napdos.ucsd.edu/ | Detection of seconary metabolite gene cluster | |
NCBI Prokaryotic Genome Annotation Pipeline | http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/annotation_prok/ | Annotation of ORFs | |
NRPSpredictor | http://nrps.informatik.uni-tuebingen.de/ | Detection of NRPS domains | |
Prokka (rapid prokaryotic genome annotation) | http://www.vicbioinformatics.com/software.prokka.shtml | Annotation of ORFs | |
RAST (rapid annotation using subsystems technology) | http://rast.nmpdr.org/ | Annotation of ORFs | |
other programs | |||
Chem Station Rev. A.09.03 | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | Handling program for HPLC | |
Clone Manager Suite 7 | Scientific and Educational Software, Cary, USA | Designing Cloning Experiment | |
Newbler v2.8 | Roche Diagnostics | Alignment of sequencing reads | |
Machines | |||
Centrifuge Avanti J-6000, Rotor JA-10 | Beckman Coulter GmbH, Krefeld, Germany | ||
HPLC/MS | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Autosampler: G1313A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Pre-column: XBridge C18 (20 mm x 4.6 mm; Particle size: 3.5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Column:Xbridge C18 (100 mm × 4.6 mm; Particle size: 3.5 μm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Pre-Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 150 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_semi-prep Column: Zorbax B-C18 (9.4 x 20 mm; Particle size: 5 µm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Degasser: G1322A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quarternary pump: G1311A | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Diode array detector (DAD )G1315B (λ = 254 nm and 400 nm) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
_Quadrupole mass detector (MSD) G1946D(2-3000 m/z) | Agilent Technologies, Waldbronn, Germany | ||
rotary evaporator | |||
_heating bath Hei-VAP Value/G3 | Heidolph Instruments GmbH & Co.KG, Schwabach, Germany | ||
_vacuum pump system SC 920 G | KNF Global Strategies AG, Sursee, Switzerland | ||
other material | |||
Sephadex LH20 | GE Healthcare, | ||
Chromafil PVDF-45/15MS (pore size 0.45 µm; filter Ø15 mm) | MACHEREY-NAGEL GmbH & Co. KG, Düren, Germany | ||
SPE column Oasis HLB 20 35 cc (6g) | Waters GmbH, Eschborn, Germany | ||
E. coli | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Bacillus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: LB, Composition: LB, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
Streptomyces sp. | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: TSB, Composition: CASO Boullion, Amount to 1 L H2O: 30 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Yeast extract, Amount to 1 L H2O: 10 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Peptone, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
fungus | Carl Roth GmbH + Co. KG, Karlsruhe, Germany | Medium: YPD, Composition: Glucose, Amount to 1 L H2O: 20 g | |
for agar plates add 2 % agar |