The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
Læring er baseret på dannelsen af hukommelse spor og deres vedligeholdelse. Det er almindeligt accepteret, at en underliggende mekanisme kan repræsentere en aktivitet-afhængig dannelse af nye og / eller omlægning af eksisterende synaptiske kontakter mellem neuroner. På det molekylære niveau har forskellige protein modifikationer, subcellulære relocalizations og ændringer i omsætningen af synaptiske proteiner blevet beskrevet 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). Men de fleste undersøgelser hidtil fokuseret på udvalgte proteiner i stedet for på det globale, men komplekse synaptisk proteom sammensætning. Den nuværende fremgangsmåde giver en fordomsfri screening for synaptiske proteom ændringer i mus områder af hjernen efter en lærende eksperiment. Den er velegnet til at gøre tid-point afhængige molekylære snapshots af læring-induceret reorganisering af den synaptiske arkitektur. Den beskrevne arbejdsgang kræver en særlig teamwork af forskellige specialister i dyreadfærd, protein biokemi, massespektrometri og Biolnformatics.
Den valgte læring paradigme, dvs. frekvens-moduleret tone forskelsbehandling (FMTD), er et godt karakteriseret auditive opgave diskrimination i gnavere 5. Læring og langtidshukommelse dannelse i denne shuttle box Go / No-Go-opgave involverer mekanismer afhængigt øget kortikal dopamin signalering og proteinsyntese. Derfor seneste proteomiske undersøgelser af ørkenrotter og mus afslørede dopamin- og læring-induceret plast omrokeringer af synaptiske komponenter i cortical, men også i mere basale områder af hjernen, der angiveligt interagerer under FMTD indlæring og hukommelse 6-8. Dette illustrerer, at hukommelsesdannelse involverer et komplekst samspil af forskellige hjerneregioner, og således kan være differentielt reguleret inden for disse områder på proteom niveau. Derfor er dissektion af udvalgte kortikale og subkortikale mus hjerneområder indgår i arbejdsgangen.
Endvidere pålidelig characterizatipå selv af svage ændringer i synaptisk proteinsammensætning kræver en berigelse af præ- og postsynaptiske rum snarere end analysen af homogenater eller rå membranfraktioner 9. Derfor er fremstillingen af synaptosomer udnytte etablerede protokoller inden proteomanalyse er beskrevet for at øge påvisningen niveau og det dynamiske område for synapse-specifikke proteiner 10,11.
En væsentlig forudsætning for at bruge mærket-fri høj opløsning massespektrometri til kvantitative formål er en høj grad af lighed af protein prøver. Som forventes at forekomme efter at lære, vil en etiket-fri tilgang være hensigtsmæssigt at sammenligne tilsvarende protein prøver fra uddannet og naive mus snarere mindre ændringer i synaptisk protein sammensætning. Alternativt tilstand-specifikke strategier proteiner / peptider under anvendelse af stabile isotoper (f.eks TMT, iTRAQ, ICPL og SILAC) samt MS2-baserede label fri qua labelntification (SKÅRSKÆRME) er anvendelige, men de er dyrere end den valgte label-free tilgang eller behov for særlig massespektrometrisk hardware.
Da proteomiske screeninger ofte give komplekse datasæt, anbefales bioinformatik behandling for passende data fortolkning. Yderligere metaanalyser kan understøtte en bedre forståelse af potentielle molekylære mekanismer bag paradigme-relaterede ændringer og identifikation af involverede vigtige cellulære processer og signalveje. Passende metoder er også beskrevet nedenfor.
Undersøgelsen præsenterer en metodisk arbejdsgang optimeret til en nøjagtig kvantitativ profilering af synaptiske protein udtryk forandringer under indlæring og hukommelse konsolidering i forskellige dele af hjernen hos mus. Opsætningen giver mulighed for at studere det protein udtryk på niveauet af et enkelt dyr på trods af det ønskede program af mindst tre tekniske replikater per prøve til massespektrometrisk analyse.
Metodikken tager hensyn til den særlige protein sammensætningen af præ- og postsynapse bestående af højmolekylære scaffold proteiner, men også af vigtig mediator proteiner bærende medium eller lavere molekylvægte. De i-løsning spaltningsprodukter af synaptosomale præparater resultere i en effektiv produktion og dermed en overrepræsentation af stillads-afledte peptider. Dette vil igen, kan undertrykke analyse af mindre eller lavere rigelige proteiner. Den foreslåede fremstilling af SDS-PAGE-fraktioner fra enaliquot af hver prøve kombineres med en i-gel fordøjelse procedure parallelt hermed letter analysen af mellem- og lav hyppighed proteiner og udgør en stærkt anbefales supplerende metode. Efter separat massespektrometrisk anvendelse af alle fraktioner afledt fra en prøve (fx i-opløsning fordøje, i-gel fordøje, kombinerede phospho-berigede fraktioner) de tilsvarende MS / MS datasæt kan kombineres og yderligere beregnet for proteinidentifikation og kvantificering med PEAKS software eller alternative populære softwarepakker.
Alternativt individuelle anvendelse af i-gel-fordøjelse-afledte fraktioner af en prøve (separat bearbejdede gel-områder af en prøve lane) og fraktioner genereret af den i opløsning fordøjet prøve (fx ved ionbytningskromatografi) til massespektrometri kan øge den analytiske dybde. Men dette udvidede arbejdsgang dramatisk øger den krævede tid for LS-MS / MS datafangst. For generation af en detaljeret molekylær sekvens af synaptiske protein omlejringer under indlæring og hukommelsesdannelse en specificeret tidsforløbet for proteomik profilering er påkrævet. Dette tidsforløb kan begynde umiddelbart efter eller selv under den første træning og dækker et tætmasket tidsramme indtil dyrenes præstationer nåede asymptotiske niveau indlæringskurve efter ca. 8 – 10 dages træning (se figur 2 for detaljer).
Analysen af phosphorylering ændringer i synaptiske proteiner kræver særlig fokus på de udvalgte tidsrammer under FMTD læring. På den ene side signalering kaskader initierende synaptiske protein omlejringer kendt for at være udløst af protein fosforyleringer og dephosphoryleringerne forventes på meget tidlige stadier af dyr uddannelse. På den anden side er der langvarige modifikationer af multiple phosphorylerede synaptiske proteiner kendt som regulerer konnektivitet og montage inden for synaptic arkitektur 19, 20. Disse posttranslationelle modifikationer forventes selv på senere tidspunkter hukommelse konsolidering.
De komplekse datasæt genereret af denne proteomisk arbejdsgang kræver bioinformatik behandling for at identificere de deltagende molekylære veje og centrale molekyler. Meta-analyse viser signifikante overrepræsenteret pathways, der spiller en rolle i indlæring og hukommelse processer.
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |