Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
कंकाल की मांसपेशियों myofibers, स्तनधारी शरीर में सबसे बड़ी कोशिकाओं और कुछ syncytia में से एक से बना रहे हैं। कैसे जटिल और evolutionarily संरक्षित संरचनाओं कि यह रचना इकट्ठा कर रहे हैं जांच के तहत बनी हुई है। उनके आकार और शारीरिक सुविधाओं अक्सर हेरफेर और इमेजिंग अनुप्रयोगों को विवश। अमर सेल लाइनों की संस्कृति को व्यापक रूप से इस्तेमाल किया जाता है, लेकिन यह केवल भेदभाव के प्रारंभिक चरणों नकल कर सकते हैं।
यहाँ, हम एक प्रोटोकॉल है कि प्राथमिक माउस myoblasts से होने वाले myofibers की आसान आनुवंशिक हेरफेर के लिए सक्षम बनाता का वर्णन है। भेदभाव के एक सप्ताह के बाद, myofibers सिकुड़ना, गठबंधन sarcomeres और तीनों के साथ-साथ परिधीय नाभिक प्रदर्शित करते हैं। पूरे भेदभाव प्रक्रिया रहते इमेजिंग या immunofluorescence द्वारा पीछा किया जा सकता है। इस प्रणाली के मौजूदा पूर्व vivo की और इन विट्रो प्रोटोकॉल में लाभों को जोड़ती है। आसान और कुशल अभिकर्मक की संभावना के रूप में अच्छी तरह सेसभी भेदभाव चरणों के लिए उपयोग में आसानी के संभावित अनुप्रयोगों के broadens। Myofibers बाद में न केवल प्रासंगिक विकास और कोशिका जीव विज्ञान सवालों को संबोधित करने के लिए, लेकिन यह भी नैदानिक अनुप्रयोगों के लिए मांसपेशियों की बीमारी phenotypes पुन: पेश करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
कंकाल की मांसपेशी मानव शरीर के वजन 1 से 40% तक composes। स्नायु जुड़े विकारों एक विशाल स्वास्थ्य और आर्थिक बोझ 2 प्रतिनिधित्व करते हैं। कैसे इस बेहद जटिल और संगठित ऊतक, का गठन किया है बनाए रखा है, और पुनर्जीवित एक व्यापक और अच्छी तरह से स्थापित अनुसंधान के क्षेत्र का गठन किया। 6 – विशिष्ट वैज्ञानिक ब्याज पर निर्भर करता है, सबसे अनुकूल दृष्टिकोण विवो मॉडल 3 में जटिल करने के लिए सरल myotube संस्कृतियों से लेकर कर सकते हैं।
इस प्रोटोकॉल का लक्ष्य इन विट्रो प्रणाली है कि लाइव इमेजिंग और immunofluorescence के माध्यम से myogenesis की निगरानी के लिए अनुमति देता है प्रदान करना है। पारंपरिक तरीकों की तुलना में, इस प्रणाली माउस myogenic प्रक्रिया में एक बहुत ही पूर्ण और गतिशील अंतर्दृष्टि प्रदान करता है। प्रकोष्ठों परिपक्व, multinucleated myofiber आड़ा तीनों और परिधीय नाभिक 7 प्रदर्शित करने के लिए myoblast मंच से पीछा किया जा सकता। यह परिपक्वता के स्तर सकते हैंजटिल उत्तेजक या यांत्रिक apparatuses के लिए आवश्यकता के बिना नियमित रूप से सेल संस्कृति उपकरण का उपयोग कर प्राप्त किया जा। हालांकि इन विट्रो प्रणालियों में कुछ सफल 8,9 सूचित किया गया है, हमारे ज्ञान के लिए, यह केवल प्रोटोकॉल टी-नलिकाओं transversally sarcoplasmic जालिका (एसआर) के साथ रखा के साथ परिपक्व माउस myofibers पैदा कर रहा है। इस प्रकार, इस लिए इन विट्रो प्रणाली है जो अभी भी खराब समझ रहे हैं 10 त्रय गठन की आणविक तंत्र, अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
इस प्रणाली का उपयोग करने का एक और लाभ यह ऐसी एंटीबॉडी, दवाओं, और आरएनएआई उपकरण के रूप में मान्य माउस-लक्षित संसाधनों की उपलब्धता है। अपेक्षाकृत सरल प्रोटोकॉल श्रमसाध्य कदम, अत्यधिक कुशल हेरफेर, या महंगा और समर्पित उपकरण की आवश्यकता नहीं है। परिपक्व myofibers के बाद संस्कृति भेदभाव 7 के 5 डी प्रदर्शित होने शुरू, कैल्शियम Sparks (अप्रकाशित डेटा) के साथ मिलकर सिकुड़ना प्रदर्शित। एक सप्ताह में, अलग-अलग विकासस्तनधारी शरीर में सबसे जटिल कोशिकाओं में से एक के अल चरणों में इन विट्रो assays की एक किस्म के साथ संयोजन में अध्ययन किया जा सकता है।
प्राथमिक myoblasts की खेती के लिए इस प्रोटोकॉल के उपयोग के लिए एक विशेष जगह है कि बहुत myofibers के विकास के पाले को जन्म देता है। यह आंशिक रूप से अन्य प्रकार की कोशिकाओं को भी बहुत कम संख्या में मौजूद हैं के कारण है। myoblast एकाग्रता और संस्कृति पवित्रता के बीच एक संतुलन हासिल किया जाना चाहिए। एक अच्छा सेल संस्कृति भी मध्यम तैयार करने के लिए इस्तेमाल किया उत्पादों की गुणवत्ता पर निर्भर करता है। पशु स्रोतों से प्राप्त सभी उत्पादों को अच्छी तरह से परीक्षण किया जाना चाहिए। हमारे अनुभव में, पाचन की स्थिति भी निगरानी की जानी चाहिए।
प्राथमिक संस्कृतियों के लिए हमेशा की तरह, प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता अलग फाइबर या अमर myoblasts के साथ पढ़ाई की तुलना में अधिक हो सकता है। इस परिवर्तनशीलता मध्यम और पाचन घटकों, चूहों की उम्र और आकार, और संस्कृति में गड़बड़ी और परिणाम संग्रह के लिए समय अंक के मानकीकरण के द्वारा कम किया जा सकता है। फिर भी, जटिल तंत्र वास्तविक समय में छानबीन का लाभmyofiber विकास के लिए आवश्यक बहुत परिवर्तनशीलता दोष से बढ़कर है।
इस प्रोटोकॉल सेल भेदभाव समझौता किए बिना इन विट्रो दृष्टिकोण में करने के फायदे प्रदान करता है। Myofibers परिपक्व होने तक तीनों का गठन कर रहे हैं और संकुचन कैल्शियम स्पार्क्स के लिए मिलकर कर रहे हैं। इन कार्यात्मक outputs के विभिन्न प्रयोगात्मक शर्तों में पहुँचा जा सकता है। इसके अलावा, वहाँ कई तकनीकी प्रोटोकॉल के लिए किए गए बदलाव हो सकते हैं। Myoblasts मांसपेशियों के विकास से संबंधित हित के परिवर्तन के साथ नवजात चूहों से काटा जा सकता है। कोशिकाओं को अलग भेदभाव समय बिंदुओं पर जैव रासायनिक विश्लेषण के लिए lysed जा सकता है। कैल्शियम संकेतकों अपनी गतिशीलता का पालन करने की संस्कृति से जोड़ा जा सकता है। Optogenetic निर्माणों कुछ संकेत दे रास्ते को लागू करने के लिए या विशिष्ट स्थानीय प्रतिक्रियाओं को प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, myofibers उनकी बातचीत का अध्ययन करने के लिए अन्य कोशिकाओं प्रकार के साथ cocultured जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Dispase II | Gibco | 17105041 | |
Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions and Media | |||
Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
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Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
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Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |