Abstract
Skeletspieren bestaan uit myofibers, de grootste cellen in het lichaam van een zoogdier en een van de weinige syncytia. Hoe het complex en evolutionair geconserveerde structuren die zij bestaat geassembleerd verder onderzocht. Hun grootte en fysiologische functies beperken vaak manipulatie en imaging-toepassingen. De cultuur van geïmmortaliseerde cellijnen wordt algemeen gebruikt, maar het kan alleen repliceren de vroege stappen van differentiatie.
We beschrijven een protocol dat eenvoudige genetische manipulatie van spiervezels afkomstig van primaire myoblasten muis maakt. Na een week van differentiatie, de spiervezels weer contractiliteit, uitgelijnd sarcomeren en triaden, en perifere kernen. Het gehele differentiatieproces zal door levende imaging of immunofluorescentie. Dit systeem combineert de voordelen van de bestaande ex vivo en in vitro protocollen. De mogelijkheid van eenvoudige en efficiënte transfectie ende gemakkelijke toegang tot alle differentiatiestadia verbreedt de toepassingsmogelijkheden. Spiervezels kan vervolgens worden gebruikt niet alleen relevant ontwikkelings- en celbiologie vragen te beantwoorden, maar ook spierziekte fenotypes vermenigvuldigen voor klinische toepassingen.
Introduction
Skeletspier samenstelt tot 40% van het lichaamsgewicht 1. Spier-geassocieerde stoornissen vormen een immense gezondheid en de economische last 2. Hoe deze uiterst complexe en georganiseerde weefsel wordt gevormd, onderhouden, en geregenereerd vormt een uitgebreid en goed gevestigde onderzoeksgebied. Afhankelijk van de specifieke wetenschappelijke interesse, kan de meest geschikte benadering van eenvoudige myotube culturen complex in vivo modellen 3-6.
Het doel van dit protocol is om een in vitro systeem dat zorgt voor de bewaking van myogenesis via live beeldvorming en immunofluorescentie bieden. Vergeleken met traditionele methoden, biedt dit systeem een compleet en dynamisch inzicht in de muis myogene proces. Cellen kunnen worden gevolgd vanaf de myoblast etappe naar de rijpe, meerkernige myofiber weergeven van transversale triades en perifere kernen 7. Deze rijping niveau kanworden bereikt met gewone celkweek apparatuur zonder omslachtige stimulerende of mechanische inrichtingen. Hoewel enkele succesvolle in vitro systemen gerapporteerd 8,9, voor zover wij weten, is dit het enige protocol genereren van volwassen muis myovezels met T-tubuli transversaal gekoppeld sarcoplasmatisch reticulum (SR). Aldus kan dit in vitro systeem worden gebruikt om de moleculaire mechanismen van triade vormen, die nog steeds slecht begrepen 10 bestuderen.
Een verder voordeel van dit systeem is de beschikbaarheid van gevalideerde-muis specifieke middelen, zoals antilichamen, geneesmiddelen en RNAi gereedschappen. De relatief eenvoudig protocol niet moeizame stappen, hoogopgeleide manipulatie, of dure en speciale apparatuur. Gerijpt spiervezels start verschijnen na 5 d van de cultuur differentiatie 7, het weergeven van contractiliteit in combinatie met calcium vonken (ongepubliceerde gegevens). In één week, de verschillende ontwikkelingal fasen van een van de meest complexe cellen in het zoogdierlichaam kunnen worden onderzocht in combinatie met verschillende in vitro assays.
Protocol
LET OP: Een muis opbrengsten voldoende myoblasten voor ongeveer twee 35 mm gerechten of twee live-imaging gerechten, dus plan matten, dissectie en coating (stap 2.6) dienovereenkomstig. Sinds myoblasten zijn geïsoleerd door middel van sequentiële centrifugeren en preplating, moet het protocol worden uitgevoerd in batches van 5-10 dieren.
Alle procedures waarbij proefdieren werden goedgekeurd door de Animal Ethics Committee bij Instituto de Medicina Moleculaire en de Universiteit Pierre et Marie Curie
1. Dissectie van pasgeboren muizen Hind ledematen Spieren
- Bereid alle oplossingen van tevoren (Materialen Table) en steriliseer door middel van filtratie (0,22 pm filter). Of alle media bij 37 ° C vóór toevoeging aan de cellen, behalve de formuleringen die basaalmembraan matrix (bijv Matrigel).
- Steriliseer de dissectie materiaal (een van elk van: gebogen schaar, rechte schaar, gewone pincet,en fine-tip pincet) en de werkbank door ze af te vegen met 70% ethanol.
- Bereid een 100 mm petrischaal met 5 ml Dulbecco's fosfaat gebufferde zoutoplossing (DPBS) voor spier verzamelen en houden op ijs tot het hakken stap.
- Onthoofden P6 - P8 muizen met rechte schaar en steriliseren de huid met 70% ethanol.
- Maak een insnijding in de rug huid en trek het voorzichtig in de richting van de achterste ledematen, totdat het wordt verwijderd, volledig bloot de achterpoten ledematen spiermassa.
- Gebruik de tang om vetweefsel te verwijderen zonder beschadiging van de spieren.
- Om de dorsale achterste ledematen spieren te verwijderen, houdt het been gestrekt en buig de poot aan de hiel pezen bloot te leggen. Gebruik de gebogen schaar om aparte spier uit het bot, uitgaande van de pezen, door zachtjes te schuiven en naar boven te snijden. Accijnzen de spieren en plaats ze in ijskoude DPBS.
- Isoleer de quadriceps door afklemmen van de spier met fijne punt pincet en snijden rond het zonder beschadiging van de femur of het kniegewricht.
- Na het ontleden van alle dieren, ga dan naar een steriele laminaire stroming celkweek kap, waar alle volgende stappen moeten worden uitgevoerd.
2. myoblast Isolation
- Verwijder de overmaat aan DPBS. Hak het weefsel met gesteriliseerd gebogen schaar om een massa te verkrijgen.
- Verzamel de gehakt weefsel in een 50 ml conische centrifugebuis via 5 ml digestie mix en incubeer met agitatie bij 37 ° C gedurende 90 min.
- Stop de digestie door het toevoegen van 6 ml dissectie medium en centrifugeer de suspensie gedurende 5 minuten bij 75 xg het restmateriaal pelleteren.
- het verzamelen van de supernatant voorzichtig. Zorg ervoor dat u niet het verzamelen van weefsel puin. Centrifugeer bij 350 xg gedurende 5 minuten; hersuspenderen in 5 ml dissectie medium.
- Filter de celsuspensie door een 40 um cel zeef. Voeg 25 ml dissectie medium en preplate in een 150 mm schaal van 4 uur in een celkweek incubator (37 ° C en 5% CO 2 </ Sub>) om de fibroblasten te houden.
- Terwijl preplating, laag gerechten met 500 pi van basaalmembraan matrix verdund 1: 100 in IMDM koude gedurende 1 uur bij kamertemperatuur. Was eenmaal met DPBS en onmiddellijk het bord van de cellen (stap 2.8) of verlaten met groeimedium tot plating.
- Na preplating, verzamel de supernatant en Centrifugeer bij 350 xg gedurende 10 min.
- Resuspendeer in groeimedium en tel de cellen op een hemocytometer. Stel het volume zo dat er tussen de 150.000 en 250.000 cellen worden uitgeplaat per basaal membraan-matrix gecoate schaal. Houd de cellen in een celkweek incubator.
3. myofiber Differentiatie
Opmerking: Na 3 d, moeten de cellen beginnen te smelten en vormen myotubes bij ongeveer 70% confluentie (Figuur 1B).
- Op dit punt transfecteren van de cellen, indien gewenst, met een siRNA of DNA van belang. Als de cellen niet te transfecteren, verandert direct naar differentiatiemedium en skip naar stap 3,4.
- Transfecteren met transfectie reagens volgens de instructies van de fabrikant. Incubeer de cellen gedurende 5 uur met siRNA-lipidecomplexen (20 nM + 1 pi reagens) of DNA-lipidecomplexen (1 ug + 1 pi reagens). Optimaliseren van de siRNA en DNA concentraties indien nodig.
- Was ze eenmaal met differentiatie medium en dan overschakelen naar nieuwe differentiatie medium.
- De volgende dag verdunnen basaalmembraan matrix 1: 2 in ijskoude differentiatiemedium. Verwijder de bestaande medium en voeg 200 ul ijskoude matrix elk gerecht.
- Incubeer gedurende 30 min in een celkweek incubator.
- Supplement de differentiatie medium met agrine (100 ng / ml) en voorzichtig 2 ml aan de cellen.
- Zorgvuldig wijzigen helft van het medium elke 2 d, altijd vullen met agrine tot een uiteindelijke concentratie van 100 ng / ul.
- Monitor celdifferentiatie en de levensvatbaarheid. Afhankelijk van een aantal factoren (zoals FBS en cHicken embryo extract oorsprong), de cellen zou kunnen nemen tussen 5-10 differentiatie d tot volle rijping (Figuur 2) te bereiken.
4. Immunokleuring in Glas-bottom Dishes
- Voor immunokleuring op elk tijdpunt plaats, was de cellen één keer met DPBS en bevestig ze met 4% PFA bij kamertemperatuur gedurende 10 min.
- Was ze tweemaal met DPBS. Op dit punt kunnen de cellen worden opgeslagen bij 4 ° C.
- Doorlaatbaar ze met 0,5% Triton X-100 gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Was ze tweemaal met PBS en geblokkeerd met blokkeeroplossing gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer ze met primair antilichaam verdund in blokkeeroplossing O / N bij 4 ° C.
- 3x wassen met DPBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Incubeer ze met het secundaire antilichaam en 0,2 ug / ml DAPI gedurende 1 uur bij kamertemperatuur.
- 3x wassen met DPBS gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur.
- Voeg 200 ul van fixeermiddel en overgaan tot beeldvorming.
Representative Results
De omvang van spiervezeloriėntaties ontwikkeling wordt vooral bepaald door de zuiverheid en de levensvatbaarheid van de geïsoleerde myoblasten. De hechting, proliferatie en fusie-capaciteit kan worden empirisch toegang tot die parameters (figuur 1 A, B). Bij proliferatie D2, moeten myoblasten hebben gehandeld en dienen de typische fusiform vorm te geven. Proliferatie wordt verwacht uitvoerig gebeuren in dit stadium, wat leidt tot spontane vorming myotube de volgende dag (Figuur 1B).
Cel confluentie nodig zou kunnen hebben kleine aanpassingen. Er dient te worden verhoogd als myoblasten nemen meer dan 3 d te laten groeien en de zekering. Moet worden verlaagd als spiervezels niet kunnen groeien en langwerpige relatief recht door hun dichtheid. Confluentie vermindert gewoonlijk vanuit het midden naar de omtrek van de schaal, zodat de beste spiervezels worden gevonden naar de buitengebieden.
Myotubes zal snel verlengen en weergave van meerdere centraal uitgelijnde kernen (figuur 1C). Door D5, sommige cellen beginnen te verwerven strepen en hun kernen verplaatsen naar de periferie. Het aantal spiervezels met gerijpte karakteristieken zullen toenemen met de tijd en met celdikte (figuur 1D).
De mate van differentiatie kan verder worden waargenomen door immunofluorescentie. Spiervezels op differentiatie D8 huidige transversale triades vast. Dit kan worden bevestigd door grafische elementen van de T-tubuli (DPHR) en SR (triadin), die naar verwachting colocalize de triaden (figuur 2).
De functionaliteit van spiervezels kan worden aangepakt door levende imaging. Vanaf differentiatie D3 verder, de cellen weer spontaan trillen. Door het transfecteren van een calcium sensor (bv., GCaMP6f 11), kan men zien dat de weeën gekoppeld met calcium pieken (figuur 3).
Met behulp van dit systeem, waren we in staat om een nieuwe moleculaire route die wordt verstoord in centronuclear myopathieën en myotone dystrofie, die dus een nieuw doelwit voor innovatieve moleculaire therapieën 7 kan identificeren. We hebben ook aangepast deze methode om de ontwikkeling van neuromusculaire overgang (NMJ) 12 bestuderen. Door de co-cultuur met ratten ruggenmerg explantaten, hebben we een rol voor dynein beschreven in NMJ formatie 13.
Figuur 1: ontwikkelingsstadia van de myoblast Culture. A) Bij proliferatie D2, myoblasten zijn toegetreden en begon uitdijende. B) Bij Prolifking D3 een confluentie van 60-80% is bereikt en myoblasten fuseren spontaan beginnen. C) Bij differentiatie D3, myotubes met centraal gelegen kernen overheersen. D) Vanaf differentiatie D5 ingang (bv, dag 8), spiervezels beginnen vertonen strepen en perifere kernen en beginnen te dikken. Schaal bar: 50 pm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Vertegenwoordiger confocale Beeld van een D8 myofiber Immunostain. A) Immunokleuring voor dihydropyridine receptor (DHPR, bovenste paneel) en triadin (TRDN, middelste paneel). Een overlay van de DHPR, TRDN en DAPI kanalen toont colocalization van de triade componenten. B) Een intensiteit profiel van de gele lijn getrokken in A. C) Een 3D-beeld van het volume rendering van spiervezels gekleurd voor α-actinine (groen) en DAPI (blauw). Schaal bar en grid breedte: 5 micrometer. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Live-Imaging van calciumgehalte in spiervezels met Spontane spiertrekkingen. A) High-speed time-lapse (20 ms frames) microscopie van een calcium vonk in een spiertrekkingen myofiber. Calcium werd ontdekt door de expressie van GCaMP6f (Addgene plasmide # 40755). B) Kwantificatie van de fluorescentie-intensiteit in de tijd voor de calcium sensor in panel A._blank "> Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Discussion
Het gebruik van dit protocol voor de kweek van primaire myoblasten ontstaat een speciale niche die sterk voedt de ontwikkeling van spiervezels. Dit is deels te wijten aan andere celtypen die ook in zeer geringe aantallen. Een evenwicht tussen myoblasten concentratie en zuiverheid cultuur moet worden bereikt. Een goede celkweek hangt ook af van de kwaliteit van de voor de mediumformulering producten. Alle producten afkomstig van dierlijke bronnen moet grondig worden getest. In onze ervaring, zou de spijsvertering voorwaarden ook worden gecontroleerd.
Zoals gebruikelijk voor primaire kweken, kunnen experimentele variabiliteit hoger dan in studies met geïsoleerde vezels of vereeuwigd myoblasten zijn. Deze variabiliteit kan worden verminderd met de standaardisatie van de medium en de spijsvertering componenten, muizen, leeftijd en grootte, en de tijdstippen voor cultuur manipulatie en resultaten collectie. Niettemin is het voordeel van loep onvertraagd ingewikkelde mechanismendie nodig zijn voor de ontwikkeling van spiervezeloriėntaties sterk overtreft de variabiliteit nadeel.
Dit protocol geeft de voordelen van in vitro benaderingen zonder dat celdifferentiatie. Myovezels rijpen totdat triaden worden gevormd en contracties worden gekoppeld met calcium vonken. Deze functionele uitgangen zijn toegankelijk in verschillende experimentele omstandigheden. Bovendien kunnen er vele technische variaties die in het protocol. Myoblasten kan worden geoogst uit neonatale muizen met mutaties van belang met betrekking tot spierontwikkeling. Cellen kunnen worden gelyseerd voor biochemische analyse op verschillende tijdstippen differentiatie. Calcium indicatoren kunnen aan de kweek worden toegevoegd om de dynamiek te volgen. Optogenetische constructen kunnen worden gebruikt om bepaalde signaalwegen dwingen of aan specifieke lokale induceren. Tenslotte kan de spiervezels worden gekweekt samen met andere celtypen hun interacties te bestuderen.
Disclosures
De auteurs hebben niets te onthullen.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
- Janssen, I., Heymsfield, S. B., Wang, Z., Ross, R. Skeletal muscle mass and distribution in 468 men and women aged 18-88 yr. J Appl Physiol. 89 (1), 81-88 (2000).
- Manring, H., Abreu, E., Brotto, L., Weisleder, N., Brotto, M. Novel excitation-contraction coupling related genes reveal aspects of muscle weakness beyond atrophy-new hopes for treatment of musculoskeletal diseases. Front Physiol. 5, 37 (2014).
- Yaffe, D., Saxel, O. Serial passaging and differentiation of myogenic cells isolated from dystrophic mouse muscle. Nature. 270 (5639), 725-727 (1977).
- Pasut, A., Jones, A. E., Rudnicki, M. A. Isolation and Culture of Individual Myofibers and their Satellite Cells from Adult Skeletal Muscle. J Vis Exp. (73), (2013).
- Meng, H., Janssen, P. M. L., et al. Tissue Triage and Freezing for Models of Skeletal Muscle Disease. J Vis Exp. (89), (2014).
- Demonbreun, A. R., McNally, E. M. DNA Electroporation, Isolation and Imaging of Myofibers. J Vis Exp. (106), (2015).
- Falcone, S., Roman, W., et al. N-WASP is required for Amphiphysin-2/BIN1-dependent nuclear positioning and triad organization in skeletal muscle and is involved in the pathophysiology of centronuclear myopathy. EMBO Mol Med. 6 (11), 1455-1475 (2014).
- Flucher, B. E., Phillips, J. L., Powell, J. A. Dihydropyridine receptor alpha subunits in normal and dysgenic muscle in vitro: expression of alpha 1 is required for proper targeting and distribution of alpha 2. J Cell Biol. 115 (5), 1345-1356 (1991).
- Cooper, S. T., Maxwell, A. L., et al. C2C12 co-culture on a fibroblast substratum enables sustained survival of contractile, highly differentiated myotubes with peripheral nuclei and adult fast myosin expression. Cell Motil Cytoskeleton. 58 (3), 200-211 (2004).
- Al-Qusairi, L., Laporte, J. T-tubule biogenesis and triad formation in skeletal muscle and implication in human diseases. Skelet Muscle. 1, 26 (2011).
- Vilmont, V., Cadot, B., Ouanounou, G., Gomes, E. R. A system to study mechanisms of neuromuscular junction development and maintenance. Development. , (2016).
- Vilmont, V., Cadot, B., Vezin, E., Le Grand, F., Gomes, E. R. Dynein disruption perturbs post-synaptic components and contributes to impaired MuSK clustering at the NMJ: implication in ALS. Sci Rep. 6, 27804 (2016).
