Abstract
骨格筋は筋繊維、最大の哺乳類の体内の細胞と少数の合胞体の1で構成されています。どのようにそれを構成する複雑かつ進化的に保存された構造が組み立てられていることは調査中のまま。その大きさと生理的機能は、多くの場合、操作およびイメージングアプリケーションを制約します。不死化細胞株の培養物が広く使用されているが、それだけで、分化の初期段階を複製することができます。
ここでは、初代マウス筋芽細胞由来の筋線維の簡単な遺伝子操作を可能にするプロトコルを記述します。分化の1週間後、筋線維は収縮、整列サルコメアと三和音、ならびに末梢核を表示します。全分化プロセスは、ライブイメージングまたは免疫蛍光法によって追跡することができます。このシステムは、既存のex vivoでのおよびin vitroプロトコルにおける利点を兼ね備えています。簡単かつ効率的なトランスフェクションの可能性だけでなく、すべての分化段階へのアクセスの容易さは、潜在的な用途を広げます。筋線維は、その後、関連する発達および細胞生物学の問題に対処するだけでなく、臨床応用のための筋肉疾患の表現型を再現するだけでなく、使用することができます。
Introduction
骨格筋は、体重1の40％までを構成します。筋肉関連障害は、莫大な健康と経済的負担2を表します。この非常に複雑で組織化組織が、形成され維持され、再生されどのように広範かつ十分に確立された研究分野を構成しています。 6 -特定の科学的関心に応じて、最も適したアプローチは、単純な培養筋管からのin vivoモデル3 における複合体に及ぶことができます。
このプロトコルの目的は、ライブイメージングおよび免疫蛍光を通して筋形成の監視を可能にするin vitroのシステムを提供することです。従来のアプローチと比較すると、このシステムは、マウス筋原プロセスに非常に完全かつダイナミックな洞察を提供しています。細胞は、筋芽細胞の段階から横方向三和音と周辺核7を表示する成熟した、多核筋線維を追跡することができます。この成熟レベルすることができます複雑な刺激または機械的な装置を必要とせず、定期的な細胞培養装置を用いて達成することができます。 試験管内システムにおけるいくつかの成功が我々の知る限り、8,9を報告されているが、これは横方向に小胞体（SR）と対になったT管と成熟したマウスの筋線維を生成する唯一のプロトコルです。したがって、このインビトロ系ではまだ不十分10を理解されトライアド形成の分子メカニズムを研究するために使用することができます。
このシステムを用いることのさらなる利点は、このような抗体、薬物、およびRNAiツールとして検証マウスターゲットリソースの利用可能性です。比較的単純なプロトコルは面倒な手順、高度に熟練した操作、または高価で専用の機器を必要としません。成熟した筋線維は、カルシウムスパーク（未発表データ）に結合された収縮性を表示し、培養分化7の5日後に現れる開始します。 1週間では、さまざまな開発哺乳類の身体の中で最も複雑なセルの一つのアル段階は、 インビトロアッセイの様々な組合せで試験することができます。
Protocol
注：約2 35mm皿または2ライブイメージングの料理なので、計画mattings、解剖、それに応じてコーティングする（ステップ2.6）のための1匹のマウスの利回り十分な筋芽細胞。 10匹の動物 - 筋芽細胞は、シーケンシャル遠心分離し、プレめっきを介して分離されているので、プロトコルは5のバッチで行われるべきです。
動物を対象とするすべての手順は、研究所デMedicina分子と大学ピエールエマリー・キュリーで動物倫理委員会によって承認されました
新生児マウス後肢の筋肉の1解剖
- 事前（ 材料表 ）内のすべてのソリューションを準備し、濾過（0.22μmのフィルター）により滅菌します。すべてのメディアが基底膜マトリックス（ 例えば、マトリゲル）を含有する製剤を除き、細胞に添加する前に37℃であることを確認してください。
- 、湾曲はさみ、ストレートはさみ、定期的な鉗子：解剖材料（1のそれぞれを滅菌しますそして、先の細いピンセット）、70％エタノールでそれらを拭き作業台。
- 筋肉のコレクションのダルベッコのリン酸緩衝生理食塩水（DPBS）5mlで100ミリメートルペトリ皿を準備し、ミンチ工程まで氷上で保管してください。
- ストレートはさみでP8マウスおよび70％エタノールで皮膚を殺菌 - P6を刎ねます。
- 背中の皮膚の切開部を作成し、それが除去されるまで後肢に向かってゆっくりと引いて、完全に後肢の筋肉組織を露出させます。
- 筋肉を損傷することなく、脂肪組織を除去するために鉗子を使用してください。
- 背側後肢の筋肉を削除するには、伸ばし手足を維持し、かかとの腱を露出するように足を曲げます。静かにスライドさせて上向きに切断することにより、腱から出発し、骨から筋肉を分離するために湾曲したハサミを使用してください。筋肉を切除し、氷冷DPBSに配置します。
- 先の細いピンセットで筋肉をつまんおよび大腿骨または膝関節に損傷を与えることなく、その周りを切断することにより、大腿四頭筋を分離します。
- すべての動物を解剖した後、以下のすべてのステップが実行されるべき無菌層流細胞培養フード、に進みます。
2.筋芽細胞の単離
- DPBSの過剰を削除します。均一な塊を得るために、滅菌湾曲鋏で組織をミンチ。
- 消化ミックスの5ミリリットルを使用して50 mLコニカル遠心管中で細分化した組織を収集し、37℃で90分間攪拌しながら、それをインキュベートします。
- 解剖媒体の6ミリリットルを追加することによって、消化を停止し、残りの組織をペレットに75×gで5分間のサスペンションを遠心します。
- 注意深く上清を収集します。 組織破片を収集していないようにしてください 。 5分間350×gで、それを遠心。解剖培地5mLにそれを再懸濁します。
- 40μmのセルストレーナーを介して細胞懸濁液をフィルタリングします。 <解剖培地25mlを加え、細胞培養インキュベーター中で4時間、150 mmディッシュでそれをpreplate（37℃、5％CO 2/サブ>）の線維芽細胞が付着することを可能にします。
- 室温で1時間の冷IMDMで100：プレプレーティングが、基底膜マトリックスの500μLとコートの料理は1に希釈しました。 DPBSで1回洗浄し、直ちに（ステップ2.8）に細胞をプレーやメッキまで増殖培地で残します。
- プレプレーティングした後、上清を回収し、10分間、350×gでそれを遠心。
- 増殖培地中でそれを再懸濁し、血球計数器で細胞を数えます。 150,000および250,000細胞が基底膜マトリックスでコーティングしたシャーレごとにメッキされるように、音量を調整します。細胞培養インキュベーター中で細胞を保管してください。
3.筋線維の分化
注：3日後、細胞を、約70％の密集度（ 図1B）で筋管を融合し、形成するために開始する必要があります。
- 所望であれば、この時点では、関心対象のsiRNAまたはDNAで細胞をトランスフェクトします。細胞は、トランスフェクトされるべきではない場合は、分化培地とスキーに直接変更pが3.4に進みます。
- 製造者の指示に従ってトランスフェクション試薬を用いてトランスフェクトします。 siRNAの脂質複合体（20 nMの+試薬の1μL）またはDNA-脂質複合体（1μgの+試薬の1μL）で5時間細胞をインキュベートします。必要に応じて、siRNAおよびDNA濃度を最適化します。
- 分化培地で1回洗った後、新しい分化培地に切り替えます。
- 次の日、基底膜マトリックス1を希釈：2を氷冷分化培地中。既存の培地を除去し、各皿に氷のように冷たい行列の200μLを追加します。
- 細胞培養インキュベーター中で30分間インキュベートします。
- アグリン（100ng / mlの）と分化培地を補完し、慎重に細胞に2 mLを加え。
- 慎重に、常に100 ngの/μLの最終濃度にアグリンで補う、培地の半分ごとに2日を変更します。
- 細胞分化および生存率を監視します。このようなFBSおよびcなどの要因（の種類によって完全な成熟（ 図2）に到達するために10分化さd - hickenは胚芽抽出物起源）、細胞が5間がかかる場合があります。
ガラスボトムディッシュ4.免疫染色
- 免疫染色のために、目的の任意の時点で、DPBSで細胞を1回洗浄し、10分間室温で4％PFAで固定し。
- DPBSで二回、それらを洗ってください。この時点で、細胞を4℃で保存することができます。
- RTで5分間、0.5％トリトンX-100でそれらを透過。
- PBSで2回洗って、室温で30分間ブロッキング溶液でブロックします。
- ソリューションのO / N、4°Cでブロッキング希釈した一次抗体を用いて、それらをインキュベートします。
- 室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。
- 二次抗体と室温で1時間のためのDAPI0.2μgの/ mLでそれらをインキュベートします。
- 室温で5分間、DPBSで洗浄3倍。
- マウンティング培地200μLを追加し、イメージングに進みます。
Representative Results
筋線維の発達の程度は、主に単離された筋芽細胞の純度および生存率によって決定されます。接着、増殖、および融合能力は、経験的に、これらのパラメータ（ 図1 A、B）にアクセスするために使用することができます。増殖D2では、筋芽細胞が付着している必要があり、典型的な紡錘状の形状を表示する必要があります。増殖は、自発的な筋管形成翌日（ 図1B）につながる、この段階で広範囲に起こると予想されます。
細胞集密度は、微調整が必要になる場合があります。筋芽細胞が増殖し、融合する以上の3日間を取る場合は、それを大きくする必要があります。筋線維は、それらの密度まで成長し、比較的まっすぐ伸長する許可されていない場合は、減少させるべきです。最高の筋線維は、外側領域に向かって発見されるべきであるので、密集度は、典型的には、皿の中心部から周辺部に減少しています。
筋管はすぐに複数の中央に整列核（ 図1C）を細長くし、表示されます。 D5によって、いくつかの細胞が光条を取得し、周囲にそれらの核の移動を開始します。成熟した特性を持つ筋線維の数は、時間とともにだけでなく、セル厚（ 図1D）と増加します。
分化の程度は、さらに免疫蛍光によって観察することができます。分化D8存在横断トライアドに固定筋繊維。これは、トライアッド（ 図2）で共局在化することが期待されているT-細管（DPHR）及びSR（triadin）のイメージング成分によって確認することができます。
筋線維の機能は、ライブイメージングによって対処することができます。以降分化D3からは、細胞は、自発的なけいれんを表示します。カルシウムセンサーをトランスフェクションすることにより（ 例えば 、、GCaMP6f 11）は、収縮カルシウムピーク（ 図3）に結合されていることを観察することができます。
このシステムを使用して、我々はそのための革新的な分子療法7のための新規の対象となり得る中心核ミオパシーおよび筋緊張性ジストロフィーで破壊された新規分子経路を特定することができました。我々はまた、神経筋接合部（NMJ）12の開発を研究するために、この方法を適応しています。ラットの脊髄の外植片との共培養を通じ、我々はNMJ形成13におけるダイニンの役割を記載しています。
図1： 筋芽細胞文化の発達段階。 A）増殖D2では、筋芽細胞が付着し、増殖し始めています。 prolifではB）eration D3、60の密集度 - 80％に達し、筋芽細胞は、自然に融合し始めます。分化D3においてC）は 、中央に位置する核を含有する筋管が優勢です。以降分化D5（ 例えば、8日目）からD）、筋線維が展示条線と周辺の核を開始し、厚くし始めます。スケールバー：50μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図2：D8 筋線維イムノの代表的な共焦点画像。 A）ジヒドロピリジン受容体（DHPR、上部パネル）の免疫染色および（TRDN、中央のパネル）triadin。 DHPR、TRDN、およびDAPIチャンネルのオーバーレイは、トライアドの構成要素の共局在を示しています。 B） A. Cに描かれた黄色の線）αアクチニン（緑）およびDAPI（青）について染色した筋線維のボリュームレンダリングの3D画像の強度プロファイル。スケールバーとグリッド幅：5μmです。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図3： 自発けいれんと筋繊維内カルシウムレベルのライブイメージング。けいれんの筋線維中のカルシウムスパークのA）高速タイムラプス（20ミリ秒フレーム）顕微鏡。カルシウムはGCaMP6f（Addgeneプラスミド＃40755）の発現を介して検出されました。パネルA中のカルシウムセンサーの経時的な蛍光強度のB）定量_blank ">この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
Discussion
一次筋芽細胞の培養にこのプロトコルの使用を大幅に筋線維の発達を育む特別なニッチを生じさせます。これはまた、非常に少数で存在する他の細胞型に部分的に起因します。筋芽細胞濃度および培養純度のバランスが達成されなければなりません。良好な細胞培養はまた、培地製剤に使用される製品の品質に依存します。動物源由来すべての製品は、徹底的にテストする必要があります。我々の経験では、消化条件も監視する必要があります。
初代培養のためにいつものように、実験的な変動は、単離された繊維または不死化筋芽細胞を用いた研究に比べて高くすることができます。この変動は、培地、消化成分、マウスの年齢およびサイズ、および培養操作と結果の収集のための時間ポイントの標準化によって減少することができます。それにもかかわらず、複雑なメカニズムをリアルタイムで精査の利点筋線維の開発に必要な大幅に変動欠点を凌駕しています。
このプロトコルは、細胞分化を損なうことなく、インビトロのアプローチの利点を与えます。三和音が形成されており、収縮はカルシウムスパークに結合されるまで、筋線維が成熟します。これらの機能の出力は異なる実験条件でアクセスすることができます。また、プロトコルに作られた多くの技術的なバリエーションが存在し得ます。筋芽細胞は、筋肉の発達に関連する関心の変異を有する新生児マウスから採取することができます。細胞は、異なる分化時点で生化学分析のために溶解され得ます。カルシウムインジケーターは、そのダイナミクスを追跡するために培養物に添加することができます。光遺伝学の構築物は、特定のシグナル伝達経路を強制するか、特定のローカル応答を誘導するために使用することができます。最後に、筋線維は、それらの相互作用を研究するために、他の細胞型と共培養することができます。
Disclosures
著者らは、開示することは何もありません。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Dispase II | Gibco | 17105041 | |
| Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
| IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
| Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10 mg/mL and endotoxin result should be <1.5 |
| Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
| Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
| Penicillin/Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
| Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
| Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
| Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
| DPBS | Gibco | 14190094 | |
| Fetal Bovine Serum (FBS) | Eurobio | CVFSVF0001 | |
| Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
| Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
| Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
| 16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
| Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
| BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200 ng/µL |
| Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Solutions and Media | |||
| Digestion Mix | in DPBS 5 mg/mL collagenase 3.5 mg/mL dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
| Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin/Streptomycin sterile filtered |
||
| Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
| Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |
References
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