Muscle cells are among the most complex eukaryotic cells. We present a protocol for the in vitro differentiation of highly mature myofibers that allows for genetic manipulation and clear imaging during all developmental stages.
Skjelettmuskulatur er sammensatt av myofibers, de største cellene i pattedyrkroppen og en av de få syncytia. Hvordan de komplekse og evolusjonært konserverte strukturer som komponerer det er satt sammen er fortsatt under etterforskning. Deres størrelse og fysiologiske funksjoner ofte begrense manipulasjon og bildebehandlingsprogrammer. Den kultur av udødeliggjorte cellelinjer er mye brukt, men den kan bare gjenskape de tidlige trinnene for differensiering.
Her beskriver vi en protokoll som muliggjør enkel genetisk manipulering av myofibers stammer fra primære muse myoblasts. Etter en uke av differensiering, de myofibers viser kontraktilitet, justert sarcomeres og triader, samt perifere kjerner. Hele differensieringsprosessen kan etterfulgt av levende avbildning eller immunfluorescens. Dette systemet kombinerer fordelene ved de eksisterende ex vivo og in vitro-protokoller. Muligheten for enkel og effektiv transfeksjon i tilleggenkel tilgang til alle differensieringsstadier utvider mulige bruksområder. Myofibers senere kan brukes ikke bare for å løse relevante utviklings- og cellebiologi spørsmål, men også for å reprodusere muskelsykdom fenotyper for kliniske applikasjoner.
Skjelettmuskulatur komponerer opptil 40% av den menneskelige kroppsvekt 1. Muskel-forbundet lidelser representerer en enorm helse og økonomisk byrde to. Hvordan dette svært komplekse og organisert vev dannes, opprettholdes, og regenerert utgjør et omfattende og godt etablerte forskningsfelt. Avhengig av den spesifikke vitenskapelig interesse, kan den mest egnet tilnærming spenner fra enkle myotube kulturer til komplekse in vivo-modeller 3 – 6.
Målet med denne protokollen er å gi en in vitro system som gjør det mulig for overvåking av myogenesen gjennom live bildebehandling og immunfluorescens. Sammenlignet med tradisjonelle tilnærminger, har dette systemet en meget fullstendig og dynamisk innsikt i mus myogenisk prosessen. Celler kan følges fra myoblast scenen til den modne, multinucleated myofiber viser tverrgående triader og perifere kjerner 7. Denne modningsnivå kanoppnås ved hjelp av vanlige cellekulturer utstyr, uten behov for kompliserte stimulerende eller mekaniske anordninger. Selv om noen vellykkede in vitro systemer har blitt rapportert 8,9, så vidt vi vet, er dette den eneste protokollen generere modne muse myofibers med T-tubuli tvers paret med sarkoplasmatisk retikulum (SR). Således kan dette in vitro-system kan brukes til å studere de molekylære mekanismer for triaden formasjon, som fortsatt er dårlig forstått 10.
En ytterligere fordel ved å bruke dette systemet er tilgjengeligheten av validerte mus-målrettede ressurser, for eksempel antistoffer, medikamenter, og RNAi verktøy. Den relativt enkel protokoll krever ikke arbeidskrevende trinn, svært dyktig manipulering, eller dyrt og dedikert utstyr. Forfalt myofibers begynne å vises etter 5 d av kultur differensiering 7, viser kontraktilitet kombinert med kalsium gnister (upubliserte data). I en uke, de forskjellige utviklingsal stadier av en av de mest komplekse celler i pattedyrkroppen kan studeres i kombinasjon med et utvalg av in vitro analyser.
Bruken av denne protokoll for dyrking av primære myoblaster gir opphav til en spesiell nisje som i stor grad gir næring til utvikling av myofibers. Dette er delvis på grunn av andre celletyper som også er til stede i meget små mengder. En balanse mellom myoblast konsentrasjon og kultur renhet må oppnås. En god cellekultur er også avhengig av kvaliteten av de anvendte produkter for mediet formulering. Alle produkter som stammer fra dyr bør bli grundig testet. I vår erfaring, bør fordøyelsen forholdene også overvåkes.
Som vanlig for primærkulturer, kan eksperimentell variabilitet være høyere enn i studier med isolerte fibre eller udødelig myoblasts. Denne variasjonen kan bli redusert ved standardisering av mellomstore og fordøyelse komponenter, mus alder og størrelse, og tidspunktene for kultur manipulasjon og resultater samling. Likevel fordelen av saumfarer i sanntid intrikate mekanismernødvendig for myofiber utvikling i stor grad overgår variasjonen ulempe.
Denne protokollen overfører fordelene ved in vitro-metoder uten at det går celledifferensiering. Myofibers modnes inntil treklanger dannes og sammentrekninger er koplet til kalsium gnister. kan nås disse funksjonelle utgangene i forskjellige eksperimentelle betingelser. Videre kan det være mange tekniske variasjoner som er gjort i protokollen. Myoblasts kan høstes fra neonatale mus med mutasjoner av interesse knyttet til muskel utvikling. Celler kan bli lysert for biokjemiske analyser på forskjellige tidspunkter differensiering. Kalsium indikatorer kan legges til kultur for å følge dens dynamikk. Optogenetic konstruksjoner kan anvendes for å innføre visse signalveier eller for å indusere spesifikke lokale reaksjoner. Endelig kan myofibers bli cocultured med andre celletyper for å studere deres interaksjoner.
The authors have nothing to disclose.
This work was supported by the European Research Council (ERG) and EMBO installation (ERG) and by a PhD fellowship from the Fundação para a Ciência e Tecnologia (MP).
Dispase II | Gibco | 17105041 | |
Collagenase type V | Sigma-Aldrich-Aldrich | C9263 | |
IMDM, Glutamax supplemented | Gibco | 31980022 | |
Matrigel Growth reduced factor | Corning | 354230 | protein concentration of the lot should be around 10mg/ml and endotoxin result should be <1.5 |
Chicken Embryo Extract | MP biomedical | 2850145 | it is also possible to prepare in the lab (Danoviz ME, Yablonka-Reuveni Z. Methods Mol Biol (2012)) |
Recombinant rat agrin | R&D systems | 550-AG-100 | |
Penicillin-Streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
Horse Serum | GE Healthcare | 11581831 | |
Lipofectamine RNAiMAX | Invitrogen | 13778-150 | used to transfect siRNA |
Lipofectamine LTX | Invitrogen | 15338-100 | used to transfect DNA |
Lipofectamine 2000 | Invitrogen | 11668030 | used to transfect siRNA plus DNA |
DPBS | Gibco | 14190094 | |
Fetal Bovine Serum | Eurobio | CVFSVF0001 | |
Cell strainer | Corning | 21008-949 | |
Fluorodishes | World precision instruments | FD35-100 | dishes used to cultivate cells for live imaging |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T9284 | |
16% PFA (Paraformaldehyde) | Science Services GmbH | E15710 | |
Goat Serum | Sigma-Aldrich | G9023 | |
BSA (Bovine Serum Albumine) | Sigma-Aldrich | A7906 | |
Saponine | Sigma-Aldrich | 47036 | |
DAPI | Sigma-Aldrich | D9542 | use at 200ng/ul |
Fluoromount-G | SouthernBiotech | 0100-01 | |
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Solutions and Media | |||
Digestion Mix | in DPBS 5 mg/ml collagenase 3.5 mg/ml dispase sterile filtered, can be stored in working aliquotes for 2 weeks at -20 °C |
||
Dissection Medium | in IMDM Glutamax supplemented 10% FBS 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Growth Medium | in IMDM Glutamax supplemented 20% FBS 1% Chicken Embryo Extract 1% Penicillin-Streptomycin1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Differentiation Medium | in IMDM Glutamax supplemented 2% Horse Serum 1% Penicillin-Streptomycin sterile filtered |
||
Blocking Solution | in DPBS 10% Goat Serum 5% BSA add 0.1% saponine when incubating with primary and secondary antibodies |