Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

Replikation af genomet forekommer under S-fasen af ​​cellens cyklus i et stærkt reguleret proces, der sikrer nøjagtigheden af ​​DNA overlapning. Hvert genomisk region replikeres på et bestemt tidspunkt under S-fasen ved samtidig aktivering af flere replikationsstartsteder. Tidspunkt for replikation (ToR) korrelerer med mange genomiske og epigenetiske egenskaber og er knyttet til mutationsrater og kræft. Forståelsen den fulde genomiske udsigt over replikation programmet, sundhed og sygdom er en stor fremtid mål og udfordring.

Denne artikel beskriver i detaljer "Kopier Antal Ratio af S / G1 til kortlægning genomisk Time of Replication" metode (heri kaldet: CNR-ToR), en enkel metode til at kortlægge genomet brede ToR af pattedyrceller. Metoden er baseret på kopiantallet forskelle mellem S-fase celler og G1-fase celler. CNR-ToR fremgangsmåden udføres i 6 trin: 1. Fremstilling af celler og farvning med propidiumiodid (PI); 2. SorTing G1 og S-fase celler under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS); 3. DNA rensning; 4. Sonikering; 5. Bibliotek forberedelse og sekventering; og 6. Bioinformatik analyse. CNR-ToR metoden er en hurtig og nem fremgangsmåde, der resulterer i detaljerede replikations- kort.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Mammal DNA-replikation er stramt reguleret for at sikre den præcise replikation af hvert kromosom præcis én gang under cellecyklussen. Replication sker ifølge en stærkt reguleret ordre - flere store genomiske regioner (~ Mb) replikere i begyndelsen af S-fasen (tidligt replikerende domæner), mens andre genomiske regioner replikere senere på midten eller sent S fase (midterste og sene replikerende domæner) en. De fleste af genomet replikerer samtidigt i alle væv (konstitutive TOR domæner), mens 30% - 50% af genomet, ændrer sin ToR mellem væv 2, under differentiering 3, 4 og i mindre grad også under kræft transformation 5 . Desuden er visse genomiske regioner replikere asynkront 6, 7, 8, nemlig der er en forskeli referencerammerne mellem de to alleler.

ToR korrelerer med mange genomiske og epigenomic funktioner, herunder transskription niveauer, GC-indhold, kromatin tilstand, gen-tæthed mv 1, 9. ToR er også forbundet med mutationsrater og typer 10, 11 og derfor ikke overraskende, er forstyrrelser af replikationsprogrammet forbundet med kræft 12, 13. Den årsagssammenhæng mellem ToR og kromatin struktur er endnu ikke forstået. Det er muligt at åbne kromatin letter tidlig replikation. En alternativ model tyder dog på, at kromatin er samlet under replikation, og de forskellige kromatin regulatorer til stede ved begyndelsen og slutningen af S-fase bly til differential emballering af tidlig og sen replikerende områder 1, 14 11.

Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er den vigtigste metode til måling ToR på individuelt loci. Den udføres simpelthen ved at tælle procentdelen af S-fase celler, der udviser enkelt FISH signaler vs procentdelen af dubletter for en given allel 15, 16. En alternativ fremgangsmåde, består af pulsmærkning DNA'et med BrdU, sortering celler ifølge deres DNA indhold til forskellige tidspunkter langs S, immunpræcipitering DNA indeholdende BrdU, og kontrollere den overflod af udfældede DNA med qPCR 17.

Genomisk ToR kortlægning kan opnås ved to metoder. Den første metode er en genomisk version af BrdU-IP baseret metode beskrevet ovenfor, hvor kvantificeringen af ​​mængdenaf udfældede DNA i hver fraktion sker samtidigt til hele genomet gennem hybridisering til mikroarrays eller ved dyb sekventering. Den anden metode, CNR-referencerammer er baseret på måling af kopiantallet af hver genomisk region af S-fase celler og normalisering af DNA-indholdet i G1 celler. Ved denne fremgangsmåde er celler sorteres ved hjælp af FACS i ikke-replikerende (G1-fasen) og replikerende (S-fase) grupper (figur 1). Celler i G1 har samme kopital i alle genomiske regioner og dermed deres DNA-indhold bør være den samme. På den anden side er DNA-kopital i S afhænger af referencerammerne, idet tidlige replikerende områder undergik replikation i de fleste celler og derfor deres DNA-indhold fordobles, hvorimod sene replikerende områder ikke har replikeret endnu i de fleste celler og derfor deres DNA indhold vil svare til den af ​​G1 celler. Derfor S til G1-forhold på DNA-indholdet er tegn på kommissoriet. Mængden af ​​DNA til hver genomiske region måles enten ved hybridisering tilmicroarrays eller ved dyb sekventering 2, 8. Fordelene ved CNR-ToR metode vil blive yderligere diskuteret.

Dette papir beskriver CNR-ToR fremgangsmåde til genomisk ToR kortlægning som beskrevet i figur 2. Papiret diskuterer de fine detaljer i hele processen fra indsamling celler, indtil den grundlæggende analyse af resultaterne og oprettelsen af ​​genomiske TOR kort. Den i dette dokument protokol er blevet udført på forskellige celletyper dyrkes i kultur. Fremtidige forbedringer af denne protokol kan føre til kortlægning af kommissoriet in vivo og i sjældne celletyper.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Bemærk: ToR kan måles kun på vækst, usynkroniserede celler. Proceduren skal begynde med mindst 1 - 2 x 10 6 hurtigt voksende celler, som normalt vil resultere i ~ 1 x 10 5 celler i S-fasen (det hastighedsbegrænsende trin). Det anbefales at gennemføre hvert eksperiment under anvendelse af to eller tre gentagelser. Hele processen med CNR-ToR kan være afsluttet inden for en uge - to dage bør være dedikeret til alle trin op til biblioteket forberedelse, er der behov for en til to dage for sekventering og en ekstra dag er nødvendig for den indledende analyse af data.

1. Indsamling af Celler fra Kultur

BEMÆRK: Protokollen er skrevet for celler, der vokser i kultur i 10 cm plader (indeholdende ca. 2 - 5 x 10 6 celler), men kan let justeres til andre platforme.

  1. For celler, der blev dyrket i suspension, videre til fiksering (afsnit 2).
  2. For vedhæftende celler, aspireres og vask plspiste med 3 ml PBS uden Ca2 + og Mg2 +.
  3. Kassér PBS og inkuber cellerne i 5 minutter ved 37 ° C med 1 ml kommerciel trypsin-EDTA, indtil cellerne løsnes.
    BEMÆRK: Varigheden af ​​trypsinbehandling bør tilpasses hver celletype.
  4. Tilsæt 3 ml dyrkningsmedier for at neutralisere trypsin og indsamle celler i en 15 ml konisk rør eller en 5 ml polystyrenrør. Hold på is.

2. Fiksering

BEMÆRK: For denne del, bør gøres alle trin ved 4 ° C.

  1. Centrifugeres cellerne ved 300 x g i 5 min ved 4 ° C.
  2. Aspirér og vask cellerne to gange med 1 ml kold PBS.
  3. Resuspender celler i 250 pi (total) kold PBS.
  4. Under forsigtig omhvirvling af røret, tilsæt langsomt dråbevis 800 pi -20 ° C 100% ethanol. Dette fører til en endelig ethanol-koncentration på 70 - med 80%.
    BEMÆRK: Høj renhed ethanol anbefales på dette trin.
  5. Cellerne inkuberes på is for 30 min.
    BEMÆRK: På dette stadie celler kan opbevares i et par dage ved 4 ° C eller for et par måneder ved -20 ° C.

3. PI farvning

  1. Centrifugeres cellerne ved 500 x g i 10 min ved 4 ° C.
  2. Aspirere supernatanten omhyggeligt og vask cellerne to gange med 1 ml kold PBS.
  3. Aspirer og resuspender hver prøve med følgende blanding: 1 ml PBS, 5 pi 10 mg / ml RNaseA, 50 pi 1 mg / ml propidiumiodid (PI, bland flasken før brug). Juster koncentration op til ~ 2 x 10 6 celler / ml).
    BEMÆRK: Hold ud af lys - PI er lysfølsomt.
  4. Filtreres gennem 35 um mesh til en 5 ml polystyren rør, og tæt med Parafilm.
  5. Inkuber ved stuetemperatur i mørke, i 15 - 30 min.
    BEMÆRK: Celler er nu klar til FACS-analyse. Om nødvendigt kan de farvede celler opbevares i mindst 24 timer ved 4 ° C i mørke.

4. Sort

  1. Sorter celler under anvendelse af en FACS-maskine. Ose de 561 nm laser til at differentiere celler baseret på deres PI intensitet. Andre lasere i nærheden af ​​535 nm excitation maksimalt ligesom 488 nm eller 532 kan anvendes afhængigt af maskinens konfiguration FACS.
  2. For at opnå optimale resultater ved at bruge den mindste dyse anbefales til den specifikke celle størrelse (for de fleste celler 85 um). Prioriter renhed tilstande end udbyttet. Brug en stabil langsom strømning, sædvanligvis op til 300-500 begivenheder / s, med en kappe tryk på 45 psi.
  3. Ved hjælp af gating, diskriminere døde celler og subcellulære rester (lav FCS og høj SSC) ved at plotte FCS vs SSC. Fra de levedygtige celler diskriminere dubletter ved at afbilde SSC-Bredde (W) vs SSC-Højde (H) efterfulgt af en FSC-W vs. FSC-H mark og PI- W vs PI-H (dubletter vil have samme H-værdi men større W-værdi). For de levedygtige enkeltceller tegne et histogram af PI-området (A) intensitet, som repræsenterer DNA-indholdet af cellerne.
  4. Sorter celler i G1 og S faser, som vist i figur 1. Gating for S skal være brede og trænge ind i G1 og G2 faserne, mens G1 gating bør være smal og så langt fra S som muligt.

figur 1
Figur 1. cellecyklusfase bestemmelse baseret på PI intensitet. Histogram, som viser fordelingen af ​​det cellulære DNA-indhold (målt ved PI-området) af muse embryonale fibroblast (MEF) population. DNA indholdet anvendes til at sortere befolkningen i to delpopulationer i) G1 celler (2N DNA indhold) og ii) S-fase celler (2N - 4N DNA-indhold), ved hjælp af de markerede områder. Klik her for at se en større version af dette tal.

BEMÆRK: Formålet med indsamlingen af ​​G1 celler er at redegøre for skævheder i sekventering effektivitet mellem forskellige genomiske regioner. En alternativ appskalle er at bruge G1 standsede celler fra den samme celletype. Denne tilgang giver renere resultater (da det minimerer S forurening fase), men det kan indføre skævheder stammer fra genetiske forskelle mellem de anholdte celler og de målte celler.

  1. Sorter i kulde og indsamle sorterede celler i 1,5 / 2 ml rør. Hold rør på is efter sorteringen.
    BEMÆRK: For at forbedre DNA opsving, er det bedre at bruge lave bindende rør eller at anvende rør belagt med 4. - 5.% BSA til 1 - 3 timer ved 4 ° C 18.

5. DNA Oprensning

  1. For hver prøve (G1 og S) oprense DNA under anvendelse af et DNA-oprensningskit.
    BEMÆRK: Ved brug af kommercielle kit, der elueres med 400 uL elueringsbuffer i et 2 ml rør til højt udbytte, som anbefalet af producenten.
  2. Check DNA-koncentrationen under anvendelse fluorometer.
    BEMÆRK: Fra 100.000 pattedyrceller indsamlet af FACS, bør man få ~ 1 pg DNA. ENt dette stadium DNA kan opbevares i nogle dage ved 4 ° C eller ved -20 ° C i lang opbevaring.

6. Sonikering

  1. Overfør DNA i en 1,7 ml rør, der er forenelig med den magnetiske stativ anvendes.
  2. Koncentrat DNA under anvendelse 2x Spri perler ifølge producentens anvisninger ved hjælp af en magnetisk stativ, og eluer i 50 pi elueringspuffer.
  3. Shear DNA med en fokuseret ultralydsapparat til en gennemsnitlig target peak størrelse på 250 bp. Brug følgende indstillinger til en DNA-prøve 50 uL: 50 W, 20% Duty faktor, 200 Cykler pr brast, 20 ° C, 120 s.
  4. Kontrollere størrelsen af ​​den forskydningspåvirkede DNA ved elektroforese. Den anbefalede størrelsesfordeling er 200-700 bp med en top på ~ 250 bp.
    BEMÆRK: I denne fase DNA kan opbevares i nogle dage ved 4 ° C eller ved -20 ° C i lang opbevaring.

7. Bibliotek Forberedelse og sekventering

BEMÆRK: Mange bibliotek forberedelsesmateriale og adskillerent sekventering platforme bør arbejde på samme måde som dem, der bruges af os og nævnt i afsnittet materialer. Faktisk i fortiden, blev TOR kort genereres ved hjælp af en meget lignende metode med microarray platforme 2.

  1. Forbered biblioteker ved hjælp af enhver kommercielt bibliotek forberedelse kit.
  2. I slutningen af ​​biblioteket forberedelse, vælg størrelse ved hjælp af magnetiske perler til 300-800 bp.
  3. Efter udarbejdelsen biblioteker, måling af DNA-koncentration ved hjælp fluorometer.
  4. Mål DNA størrelse ved hjælp af elektroforese.
  5. Udfør sekventering på enhver platform.
    BEMÆRK: Sekventering mindst 10 M læser per prøve anbefales. Denne dybde svarer til et læse cirka hver 300 bp (for ~ 3 Gb størrelse genomer), og er tilstrækkelige til tor målinger med en opløsning på 50 - 100 kb. Forøgelse af dybden vil resultere i et fald i størrelsen af ​​vinduerne og vil således gøre det muligt at øge opløsning med højere sikkerhed. Parret ende sekventering er ikke nødvendigdenne protokol da kun dækning oplysninger indsamles. Det kan dog hjælpe med at løse placeringen af ​​læser, der indeholder repetitive sekvenser.

8. Analyse

BEMÆRK: Data Analysen er baseret på den metode, som A. Koren et al. 19.

  1. Kort sekventering data til den tilsvarende genom ved hjælp bowtie2 eller enhver pålidelig kort læse aligner. Definer varierende størrelse, lige-dækning kromosomale vinduer som segmenter er omfattet af 200 læser i G1 fraktion og tælle S fasen læser i de samme vinduer.
  2. Beregn S / G1-forholdet for hvert vindue. Dette skal generere et kort med store udsving i S / G1-forholdet langs genomet (figur 3). En god kontrol for pålideligheden af ​​kommissoriet målingerne er at sammenligne dette kort til G1 / G1-forhold (fra to separate målinger af G1), som bør være meget fladere.
  3. Normalisere data til 0 betyder, og en SD ved at trække fra hver value den gennemsnitlige værdi af alle vinduer (undtagen X-kromosomet) og dividere resultatet med standardafvigelsen af ​​S / G1 af alle vinduer. Dette gøres for at konvertere til Z-score og muliggøre sammenligning mellem forskellige eksperimenter.
  4. Fjern alle gap regioner opført af den UCSC genom browser samt hver resterende inter hul fragment indeholdende færre end 15 data vinduer.
  5. Glat de resterende fragmenter med en kubisk udjævning spline via Matlab funktionen csaps med en parameter på 10 - 16 og interpolere på sæt punkter hver 100 kb.
    BEMÆRK: Parametre for udjævning og interpolation bør justeres på grundlag af dybden af ​​dataene. Andre egnede udglattende metoder og funktioner findes og kan anvendes.
  6. Efter visuelt bekræfte pålideligheden af ​​hver gentagelse, flette alle de læser og beregne en dybere opløsning profil ved at udføre den samme proces beskrevet ovenfor på disse data.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En typisk ToR kort er vist i figur 3 for muse embryonale fibroblaster (MEF). Denne figur viser analyseprocessen, da det viser både de prikker, som er den normaliserede S / G1-forhold for enkelte vinduer (trin 8.3), samt den linje, der følger af den kubiske udjævning og interpolation (trin 8.5).

Sådanne kort fange organiseringen af ​​replikation programmet, som er et kludetæppe af to typer ToR domæner: i) store regioner (i størrelsesordenen en megabase), der kopierer samtidigt (CTR = konstante TOR regioner) på tidligt, midten eller slutningen af ​​S ; og ii) tidsmæssige overgangsregioner (TTRS), hvori ToR ændrer gradvist. CTR er forbundet til hinanden ved TTRS og sammen disse to typer af replikation organisation dækker hele genomet.

Trods den relativt lave sekventering c overdosering (én læse hver 300 bp), der anvendes til ToR kortlægning, de kort er ganske robust. Figur 4 viser reproducerbarheden af ToR kort mellem triplikater af MEF-celler sammenlignet med triplikater af muse præ-B-celler i samme region. Sammenligning mellem sådanne kort tillader identifikation af regioner med differentieret ToR der defineres som områder, hvor forskellene i TOR afbildninger mellem væv er betydeligt større end forskellene mellem replikater.

Figur 2
Figur 2: Protokol ordningen. Skematisk diagram, der beskriver proceduren for CNR-ToR-metoden. Klik her for at se en større version af dette tal.

57 / 55157fig3.jpg "/>
Figur 3: Repræsentant genomiske TOR kort. Vist er ToR for hele Kromosom 1 af MEF celler og et nærmere kig på en ~ 50 Mb region. Vist er de Z-score for S / G1 værdier i varierende størrelse vinduer (prikker) og udglattede data (optrukket linje). Høj S / G1 værdier svarer til tidlig replikation mens lave værdier svarer til sen replikation. Pile peger på eksempler på konstante TOR regioner (CTR, rød) og tidsmæssige overgangsregioner (TTRS, grøn). Klik her for at se en større version af dette tal.

Figur 4
Figur 4: Reproducerbarhed af gentagelserne. (A) Udglattet ToR af MEF tre eksemplarer (blå) i forhold til præ-B-tre eksemplarer (rød) i en 18 Mb region på mus kromosom 1. Orange pilepege på eksempler på differentierede regioner mellem cellelinierne. (B) Heat kort over Spearman korrelationer mellem de 6 prøver. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

CNR-ToR kan udføres i princippet på enhver eukaryot prolifererende cellepopulation, der kan divideres med FACS til S og G1 faser (gennemgået af Rhind N. og Gilbert 20 DM). Den her beskrevne fremgangsmåde er blevet justeret til pattedyrceller med et genom størrelse på ~ 3 Gb såsom mennesker og mus. Der er behov for små ændringer i CNR-ToR-protokol (i celle forberedelse og sekventering dybde), med henblik på at tilpasse den til andre eukaryoter. Man skal være opmærksom på indsamling af tilstrækkelige mængder af S-fase celler, da det er det hastighedsbegrænsende trin. Således bør udføres en indledende FACS for cellecyklus at bekræfte, at forsøget kan gøres, og at validere mængden af ​​celler i S-fasen. For celler, som udviser uregelmæssige cellecyklusser, anbefales det at prestain cellerne med BrdU til påvisning delende celler, og følg Anti-BrdU producent protokol indtil FACS trin. Normalt celler farves med 10-20 uM BrdU i 30 min.

6 celler) anbefales for hver gentagelse for at få> 1 x 10 5 celler i S-fasen. Dette beløb bør øges, når der arbejdes med langsomt voksende celler, idet procentdelen af ​​celler i S-fasen er lavere og dermed må man sortere flere celler for at få en tilstrækkelig mængde af celler i S.

Når sortering celler, er det vigtigt at opnå den bedst mulige separation af cellerne efter deres DNA-indhold og dermed anbefales en lav strømningshastighed. For at maksimere den tidsmæssige opløsning, er det vigtigt at indsamle cellerfra hele S-fasen. Dette opnås ved gating S så bredt som muligt (figur 1). På den anden side bør G1 gating være smalle (startende fra top G1 og til venstre, figur 1), for at undgå både sub-G1 og forureninger tidlige S-fase.

Lydbehandling kan udføres ved forskellige fremgangsmåder, men det anbefales at bruge en fokuseret ultralydsapparat, som muliggør en robust og let lydbehandling uden behov for kalibrering af hvert eksperiment. Ikke desto mindre, når først oprettelse protokollen i laboratoriet, anbefales det at kalibrere parametrene for at opnå en størrelsesfordeling på 200-700 bp.

Som forklaret i indledningen, er der to metoder til genom-dækkende ToR mapping - BrdU-IP og CNR-ToR. Begge metoder giver tilsvarende TOR kort (data ikke vist) trods forskellene mellem dem. Den CNR-ToR metoden er begrænset i sin berigelse sortiment siden den maksimale forskel between tidlig og sen regioner er dobbelt, hvorimod med opnås den BrdU-IP meget højere berigelse, da tidlige replikerende regioner vil indeholde BrdU næsten kun i den tidlige fraktion. På den anden side er fremgangsmåden beslutning BrdU-IP begrænset af antallet af S-fase opsamlede fraktioner. I sin mest almindelige anvendelse, er kun to fraktioner (tidligt versus sen S) sammenlignes, hvilket resulterer i et kompromis af bøden tidsmæssig opløsning. CNR-ToR metode giver imidlertid et kontinuerligt signal langs hele S-fasen. Desuden er BrdU-IP metode baseret på immunopræcipitation som normalt giver en meget højere baggrund end CNR-ToR metode. En anden fordel ved CNR-ToR metode er, at den kan anvendes efterfølgende til at udtrække ToR information fra sekventeringsdata af usynkroniserede kulturer som beskrevet for nylig 21. Endelig CNR-ToR metode er at foretrække på grund af sin enkelhed og på grund af det faktum, at det kan nedskaleret da den ikke er baseret på IMMUno-udfældning.

mangler at blive tydes rolle ToR i komplekst netværk af genomiske og epigenomic funktioner. Den relative lethed i CNR-ToR metode giver mulighed for udvidelse af de eksisterende tor data til at omfatte mange af de naturlige forhold, at celler erfaring og bør udforskes grundigt og genom bred. Dette omfatter forskellige replikation stress situationer, endoreduplikation samt forskellige kræft transformationer. Anvendelsen af ​​SNP data og højere sekventering dybde vil også kunne måle ToR af hver allel separat. Desuden vil det yderligere fald i sekventering omkostningerne muliggøre stigende i resolutionen af ​​ToR kort, som kan yderligere støtte i muliggøre identifikation af subtile ændringer mellem betingelser. Andre fremtidige applikationer kan opnås ved at forbedre de nuværende metoder og anvende ToR måling på et lille antal celler, som vil gøre det muligt at måle ToR in vivo.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

Vi takker Oriya Vardi for hjælp til at generere tal. Arbejde i IS-gruppen blev støttet af Israel Science Foundation (tilskud nr 567/10) og Det Europæiske Forskningsråd Starting Grant (# 281.306).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter