Genom-dækkende Bestemmelse af pattedyr Replication Timing ved DNA Content Measurement
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
Replikation af genomet forekommer under S-fasen af cellens cyklus i et stærkt reguleret proces, der sikrer nøjagtigheden af DNA overlapning. Hvert genomisk region replikeres på et bestemt tidspunkt under S-fasen ved samtidig aktivering af flere replikationsstartsteder. Tidspunkt for replikation (ToR) korrelerer med mange genomiske og epigenetiske egenskaber og er knyttet til mutationsrater og kræft. Forståelsen den fulde genomiske udsigt over replikation programmet, sundhed og sygdom er en stor fremtid mål og udfordring.
Denne artikel beskriver i detaljer "Kopier Antal Ratio af S / G1 til kortlægning genomisk Time of Replication" metode (heri kaldet: CNR-ToR), en enkel metode til at kortlægge genomet brede ToR af pattedyrceller. Metoden er baseret på kopiantallet forskelle mellem S-fase celler og G1-fase celler. CNR-ToR fremgangsmåden udføres i 6 trin: 1. Fremstilling af celler og farvning med propidiumiodid (PI); 2. SorTing G1 og S-fase celler under anvendelse af fluorescens-aktiveret cellesortering (FACS); 3. DNA rensning; 4. Sonikering; 5. Bibliotek forberedelse og sekventering; og 6. Bioinformatik analyse. CNR-ToR metoden er en hurtig og nem fremgangsmåde, der resulterer i detaljerede replikations- kort.
Introduction
Mammal DNA-replikation er stramt reguleret for at sikre den præcise replikation af hvert kromosom præcis én gang under cellecyklussen. Replication sker ifølge en stærkt reguleret ordre – flere store genomiske regioner (~ Mb) replikere i begyndelsen af S-fasen (tidligt replikerende domæner), mens andre genomiske regioner replikere senere på midten eller sent S fase (midterste og sene replikerende domæner) en. De fleste af genomet replikerer samtidigt i alle væv (konstitutive TOR domæner), mens 30% – 50% af genomet, ændrer sin ToR mellem væv 2, under differentiering 3, 4 og i mindre grad også under kræft transformation 5 . Desuden er visse genomiske regioner replikere asynkront 6, 7, 8, nemlig der er en forskeli referencerammerne mellem de to alleler.
ToR korrelerer med mange genomiske og epigenomic funktioner, herunder transskription niveauer, GC-indhold, kromatin tilstand, gen-tæthed mv 1, 9. ToR er også forbundet med mutationsrater og typer 10, 11 og derfor ikke overraskende, er forstyrrelser af replikationsprogrammet forbundet med kræft 12, 13. Den årsagssammenhæng mellem ToR og kromatin struktur er endnu ikke forstået. Det er muligt at åbne kromatin letter tidlig replikation. En alternativ model tyder dog på, at kromatin er samlet under replikation, og de forskellige kromatin regulatorer til stede ved begyndelsen og slutningen af S-fase bly til differential emballering af tidlig og sen replikerende områder 1, 14 </sup>. Vi har for nylig vist, at ToR former GC-indhold ved at påvirke den type af mutationer, der forekommer i forskellige genomiske regioner 11.
Fluorescens in situ hybridisering (FISH) er den vigtigste metode til måling ToR på individuelt loci. Den udføres simpelthen ved at tælle procentdelen af S-fase celler, der udviser enkelt FISH signaler vs procentdelen af dubletter for en given allel 15, 16. En alternativ fremgangsmåde, består af pulsmærkning DNA'et med BrdU, sortering celler ifølge deres DNA indhold til forskellige tidspunkter langs S, immunpræcipitering DNA indeholdende BrdU, og kontrollere den overflod af udfældede DNA med qPCR 17.
Genomisk ToR kortlægning kan opnås ved to metoder. Den første metode er en genomisk version af BrdU-IP baseret metode beskrevet ovenfor, hvor kvantificeringen af mængdenaf udfældede DNA i hver fraktion sker samtidigt til hele genomet gennem hybridisering til mikroarrays eller ved dyb sekventering. Den anden metode, CNR-referencerammer er baseret på måling af kopiantallet af hver genomisk region af S-fase celler og normalisering af DNA-indholdet i G1 celler. Ved denne fremgangsmåde er celler sorteres ved hjælp af FACS i ikke-replikerende (G1-fasen) og replikerende (S-fase) grupper (figur 1). Celler i G1 har samme kopital i alle genomiske regioner og dermed deres DNA-indhold bør være den samme. På den anden side er DNA-kopital i S afhænger af referencerammerne, idet tidlige replikerende områder undergik replikation i de fleste celler og derfor deres DNA-indhold fordobles, hvorimod sene replikerende områder ikke har replikeret endnu i de fleste celler og derfor deres DNA indhold vil svare til den af G1 celler. Derfor S til G1-forhold på DNA-indholdet er tegn på kommissoriet. Mængden af DNA til hver genomiske region måles enten ved hybridisering tilmicroarrays eller ved dyb sekventering 2, 8. Fordelene ved CNR-ToR metode vil blive yderligere diskuteret.
Dette papir beskriver CNR-ToR fremgangsmåde til genomisk ToR kortlægning som beskrevet i figur 2. Papiret diskuterer de fine detaljer i hele processen fra indsamling celler, indtil den grundlæggende analyse af resultaterne og oprettelsen af genomiske TOR kort. Den i dette dokument protokol er blevet udført på forskellige celletyper dyrkes i kultur. Fremtidige forbedringer af denne protokol kan føre til kortlægning af kommissoriet in vivo og i sjældne celletyper.
Protocol
Representative Results
Discussion
CNR-ToR kan udføres i princippet på enhver eukaryot prolifererende cellepopulation, der kan divideres med FACS til S og G1 faser (gennemgået af Rhind N. og Gilbert 20 DM). Den her beskrevne fremgangsmåde er blevet justeret til pattedyrceller med et genom størrelse på ~ 3 Gb såsom mennesker og mus. Der er behov for små ændringer i CNR-ToR-protokol (i celle forberedelse og sekventering dybde), med henblik på at tilpasse den til andre eukaryoter. Man skal være opmærksom på indsamling af…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Vi takker Oriya Vardi for hjælp til at generere tal. Arbejde i IS-gruppen blev støttet af Israel Science Foundation (tilskud nr 567/10) og Det Europæiske Forskningsråd Starting Grant (# 281.306).
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
- Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18 (1), 115-125 (2010).
- Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6 (7), e1001011 (2010).
- Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6 (10), (2008).
- Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25 (8), 1091-1103 (2015).
- Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22 (10), 1833-1844 (2012).
- Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18 (10), 1562-1570 (2008).
- Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24 (1), 64-69 (2014).
- Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10 (5), e1004319 (2014).
- McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25 (7), 647-656 (2003).
- Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
- Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44 (9), 4222-4232 (2016).
- Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
- Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
- Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4 (1), 25-32 (2003).
- Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11 (3), 1217-1225 (1992).
- Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
- Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401 (6756), 929-932 (1999).
- Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. , (1993).
- Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91 (6), 1033-1040 (2012).
- Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5 (8), a010132 (2013).
- Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159 (5), 1015-1026 (2014).
