डीएनए सामग्री माप द्वारा स्तनधारी प्रतिकृति समय के जीनोम चौड़ा निर्धारण
Summary
We describe here a relatively fast and simple approach for mapping genome-wide mammalian replication timing, from cell isolation to the basic analysis of the sequencing results. A genomic map of a representative replication program will be provided following the protocol.
Abstract
जीनोम की प्रतिकृति एक उच्च विनियमित प्रक्रिया है कि डीएनए दोहराव की निष्ठा सुनिश्चित में सेल चक्र के एस चरण के दौरान होता है। प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र प्रतिकृति के कई मूल के एक साथ सक्रियण के माध्यम से एस चरण के दौरान एक अलग समय पर दोहराया जाता है। प्रतिकृति (टीओआर) के समय में कई जीनोमिक और epigenetic सुविधाओं के साथ संबद्ध है और उत्परिवर्तन दर और कैंसर से जुड़ा हुआ है। प्रतिकृति कार्यक्रम के पूर्ण जीनोमिक देखें समझने, स्वास्थ्य और रोग में एक प्रमुख भविष्य के लक्ष्य और चुनौती है।
, जीनोम स्तनधारी कोशिकाओं की व्यापक टीओआर नक्शा करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण: यह लेख विधि "प्रतिकृति के जीनोमिक समय मानचित्रण के लिए एस / G1 की प्रतिलिपि संख्या अनुपात" (सीएनआर-टीओआर यहाँ कहा जाता है) में विस्तार से वर्णन है। विधि एस चरण कोशिकाओं और G1 चरण कोशिकाओं के बीच मतभेद प्रतिलिपि संख्या पर आधारित है। सीएनआर-टीओआर विधि 6 चरणों में किया जाता है: 1. propidium आयोडाइड (पीआई) के साथ कोशिकाओं को और धुंधला की तैयारी; 2. सोरटिंग G1 और एस चरण कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर (FACS); 3. डीएनए शुद्धि; 4. Sonication; 5. पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण; और 6. डीएनए विश्लेषण। सीएनआर-टीओआर विधि एक तेज और आसान तरीका है कि विस्तृत प्रतिकृति नक्शे में यह परिणाम है।
Introduction
स्तनधारी डीएनए प्रतिकृति ठीक एक बार सेल चक्र के दौरान प्रत्येक गुणसूत्र की सटीक प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए कसकर विनियमित है। प्रतिकृति एक उच्च विनियमित आदेश के अनुसार होता है – कई बड़े जीनोमिक क्षेत्रों (~ एमबी) एस चरण की शुरुआत में दोहराने (प्रारंभिक डोमेन नकल) जबकि अन्य जीनोमिक क्षेत्रों के मध्य या देर एस चरण (मध्य और देर से नकल डोमेन) पर बाद में दोहराने 1। जीनोम के अधिकांश सभी ऊतकों (टीओआर विधान डोमेन) में एक ही समय में प्रतिकृति है, जबकि 30% – जीनोम का 50%, ऊतकों 2 के बीच अपनी टीओआर परिवर्तन भी कैंसर परिवर्तन 5 के दौरान भेदभाव 3, 4 के दौरान और एक हद तक कम करने के लिए, । इसके अलावा, कुछ जीनोमिक क्षेत्रों को दोहराने asynchronously 6, 7, 8, अर्थात् वहाँ एक अंतर हैदो alleles के बीच टीओआर में।
टीओआर प्रतिलेखन के स्तर, जीसी सामग्री, क्रोमेटिन राज्य, जीन घनत्व, आदि 1, 9 सहित कई जीनोमिक और Epigenomic सुविधाओं के साथ संबद्ध। टीओआर भी उत्परिवर्तन दर और प्रकार 10, 11 और इसलिए हैरानगी साथ जुड़ा हुआ है, प्रतिकृति कार्यक्रम के perturbations कैंसर 12, 13 से जुड़ी हैं। टो और क्रोमेटिन संरचना के बीच कारण संबंध में अभी तक समझ नहीं है। ऐसा नहीं है कि खुले क्रोमेटिन जल्दी प्रतिकृति की सुविधा संभव है। हालांकि, एक वैकल्पिक मॉडल पता चलता है कि क्रोमेटिन, 14 प्रतिकृति के दौरान इकट्ठा किया जाता है और विभिन्न क्रोमेटिन नियामकों शुरुआत में वर्तमान और एस चरण नेतृत्व के अंत जल्दी और देर नकल क्षेत्रों 1 की पैकेजिंग करने के लिए अंतर </sup>। हमने हाल ही में पता चला है कि टीओआर आकार परिवर्तन है कि विभिन्न क्षेत्रों जीनोमिक 11 में होने के प्रकार को प्रभावित करने से जीसी सामग्री।
सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति व्यक्ति loci में टीओआर को मापने के लिए मुख्य विधि है। यह बस एस चरण कोशिकाओं है कि प्रदर्शन कर एक मछली संकेतों बनाम के लिए एक दिया एलील 15, 16 दोहरी का प्रतिशत का प्रतिशत की गणना के द्वारा किया जाता है। एक वैकल्पिक तरीका, BrdU के साथ डीएनए लेबलिंग, एस के साथ कई बार अंक के लिए उनके डीएनए सामग्री के अनुसार कोशिकाओं छँटाई, BrdU युक्त डीएनए immunoprecipitating, और qPCR 17 के साथ उपजी डीएनए की बहुतायत जाँच नाड़ी के होते हैं।
जीनोमिक टीओआर मानचित्रण दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। पहली विधि ऊपर वर्णित BrdU-आईपी आधारित विधि का एक जीनोमिक संस्करण है, जिसमें राशि की मात्रा का ठहरावके प्रत्येक अंश में उपजी डीएनए संकरण के माध्यम से पूरे जीनोम के लिए या गहरी अनुक्रमण द्वारा एक साथ किया जाता है। दूसरी विधि, सीएनआर-टो, G1 कोशिकाओं में डीएनए सामग्री द्वारा एस चरण कोशिकाओं और सामान्य से प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र की प्रतिलिपि संख्या को मापने पर आधारित है। इस विधि में, कोशिकाओं गैर नकल (G1 चरण) और नकल (एस चरण) समूह (चित्रा 1) में FACS के अनुसार क्रमबद्ध हैं। G1 में कोशिकाओं सभी जीनोमिक क्षेत्रों में एक ही कॉपी संख्या है और इस तरह उनके डीएनए सामग्री एक ही होना चाहिए। दूसरी ओर, एस में डीएनए नकल संख्या टीओआर पर निर्भर करता है, क्योंकि जल्दी नकल क्षेत्रों सबसे कोशिकाओं में प्रतिकृति कराना पड़ा और इसलिए उनके डीएनए सामग्री दोगुनी है, जबकि देर से नकल क्षेत्रों सबसे कोशिकाओं में अभी तक नहीं दोहराया है और इसलिए उनके डीएनए सामग्री होगा G1 कोशिकाओं के समान हो। इसलिए डीएनए सामग्री की G1 अनुपात करने के लिए एस टीओआर का संकेत है। प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र के लिए डीएनए की राशि के संकरण से मापा जाता है, या तोप्रोटीन या गहरी अनुक्रमण 2, 8 से। सीएनआर-टीओआर विधि के फायदे के आगे चर्चा की जाएगी।
इस पत्र चित्रा 2 में वर्णित के रूप में जीनोमिक टीओआर मानचित्रण के लिए सीएनआर-टीओआर विधि का वर्णन है। कागज परिणामों के बुनियादी विश्लेषण और जीनोमिक टीओआर नक्शे के निर्माण के लिए जब तक कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पूरी प्रक्रिया का ठीक विवरण पर चर्चा। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक संस्कृति में विकसित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य में सुधार विवो में टो के मानचित्रण के लिए और दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं में नेतृत्व कर सकते हैं।
Protocol
Representative Results
Discussion
सीएनआर-टीओआर किसी भी यूकेरियोटिक proliferating सेल की आबादी है कि एस के लिए FACS और G1 चरणों (Rhind एन और गिल्बर्ट डीएम 20 द्वारा समीक्षा) द्वारा विभाजित किया जा सकता है पर सिद्धांत रूप में किया जा सकता है। विधि य…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम आंकड़े पैदा करने में सहायता के लिए उड़िया वर्दी धन्यवाद। IS समूह में काम इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 567/10) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान (# 281306) शुरू करने से समर्थन किया था।
Materials
| PBS | BI (Biological Industries) | 02-023-1A |
| Trypsin-EDTA | BI (Biological Industries) | 03-052-1B |
| 15ml conical tube | Corning | 430790 |
| 5ml Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap | BD-Falcon | 352235 |
| Ethanol | Gadot | 64-17-5 |
| RNAse-A 10mg/ml | Sigma | R4875 |
| Propidiom iodide 1mg/ml | Sigma | P4170 |
| parafilm | Parafilm | PM-996 |
| 1.5ml DNA LoBind Eppendorf tubes | Eppendorf | 22431021 |
| BSA | Sigma | A7906 |
| 1.7ml MaxyClear tube | Axygen | MCT-175-C |
| magnetic beads – Agencourt AMPure XP | Beckman Coulter | A63881 |
| Ultrasonicator | Covaris | M-series -530092 |
| 50 µl microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6x16mm | Covaris | 520096 |
| Qubit fluorometer | Invitrogen | |
| Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit | Invitrogen | Q32854 |
| Electrophoresis.2200 Tape station system | Agilent | D1000 ScreenTape |
| Seqeuncing – Illumina NextSeq system | Illumina | SY-415-1001 |
| Dneasy kit for DNA purification | Qiagen | 69504 |
| PureProteom Magnetic Stand | Millipore | LSKMAGS08 |
| Anti-BrdU/FITC | DAKO | F7210 |
| FACS sorter | BD | FACSARIA III |
| FACS software | BD | FACSDiva v 8.0.1 |
References
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