Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Genetics

डीएनए सामग्री माप द्वारा स्तनधारी प्रतिकृति समय के जीनोम चौड़ा निर्धारण

doi: 10.3791/55157 Published: January 19, 2017

Abstract

जीनोम की प्रतिकृति एक उच्च विनियमित प्रक्रिया है कि डीएनए दोहराव की निष्ठा सुनिश्चित में सेल चक्र के एस चरण के दौरान होता है। प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र प्रतिकृति के कई मूल के एक साथ सक्रियण के माध्यम से एस चरण के दौरान एक अलग समय पर दोहराया जाता है। प्रतिकृति (टीओआर) के समय में कई जीनोमिक और epigenetic सुविधाओं के साथ संबद्ध है और उत्परिवर्तन दर और कैंसर से जुड़ा हुआ है। प्रतिकृति कार्यक्रम के पूर्ण जीनोमिक देखें समझने, स्वास्थ्य और रोग में एक प्रमुख भविष्य के लक्ष्य और चुनौती है।

, जीनोम स्तनधारी कोशिकाओं की व्यापक टीओआर नक्शा करने के लिए एक सरल दृष्टिकोण: यह लेख विधि "प्रतिकृति के जीनोमिक समय मानचित्रण के लिए एस / G1 की प्रतिलिपि संख्या अनुपात" (सीएनआर-टीओआर यहाँ कहा जाता है) में विस्तार से वर्णन है। विधि एस चरण कोशिकाओं और G1 चरण कोशिकाओं के बीच मतभेद प्रतिलिपि संख्या पर आधारित है। सीएनआर-टीओआर विधि 6 चरणों में किया जाता है: 1. propidium आयोडाइड (पीआई) के साथ कोशिकाओं को और धुंधला की तैयारी; 2. सोरटिंग G1 और एस चरण कोशिकाओं प्रतिदीप्ति सक्रिय सेल छँटाई का उपयोग कर (FACS); 3. डीएनए शुद्धि; 4. Sonication; 5. पुस्तकालय तैयारी और अनुक्रमण; और 6. डीएनए विश्लेषण। सीएनआर-टीओआर विधि एक तेज और आसान तरीका है कि विस्तृत प्रतिकृति नक्शे में यह परिणाम है।

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

स्तनधारी डीएनए प्रतिकृति ठीक एक बार सेल चक्र के दौरान प्रत्येक गुणसूत्र की सटीक प्रतिकृति सुनिश्चित करने के लिए कसकर विनियमित है। प्रतिकृति एक उच्च विनियमित आदेश के अनुसार होता है - कई बड़े जीनोमिक क्षेत्रों (~ एमबी) एस चरण की शुरुआत में दोहराने (प्रारंभिक डोमेन नकल) जबकि अन्य जीनोमिक क्षेत्रों के मध्य या देर एस चरण (मध्य और देर से नकल डोमेन) पर बाद में दोहराने 1। जीनोम के अधिकांश सभी ऊतकों (टीओआर विधान डोमेन) में एक ही समय में प्रतिकृति है, जबकि 30% - जीनोम का 50%, ऊतकों 2 के बीच अपनी टीओआर परिवर्तन भी कैंसर परिवर्तन 5 के दौरान भेदभाव 3, 4 के दौरान और एक हद तक कम करने के लिए, । इसके अलावा, कुछ जीनोमिक क्षेत्रों को दोहराने asynchronously 6, 7, 8, अर्थात् वहाँ एक अंतर हैदो alleles के बीच टीओआर में।

टीओआर प्रतिलेखन के स्तर, जीसी सामग्री, क्रोमेटिन राज्य, जीन घनत्व, आदि 1, 9 सहित कई जीनोमिक और Epigenomic सुविधाओं के साथ संबद्ध। टीओआर भी उत्परिवर्तन दर और प्रकार 10, 11 और इसलिए हैरानगी साथ जुड़ा हुआ है, प्रतिकृति कार्यक्रम के perturbations कैंसर 12, 13 से जुड़ी हैं। टो और क्रोमेटिन संरचना के बीच कारण संबंध में अभी तक समझ नहीं है। ऐसा नहीं है कि खुले क्रोमेटिन जल्दी प्रतिकृति की सुविधा संभव है। हालांकि, एक वैकल्पिक मॉडल पता चलता है कि क्रोमेटिन, 14 प्रतिकृति के दौरान इकट्ठा किया जाता है और विभिन्न क्रोमेटिन नियामकों शुरुआत में वर्तमान और एस चरण नेतृत्व के अंत जल्दी और देर नकल क्षेत्रों 1 की पैकेजिंग करने के लिए अंतर 11 में होने के प्रकार को प्रभावित करने से जीसी सामग्री।

सीटू संकरण (मछली) में प्रतिदीप्ति व्यक्ति loci में टीओआर को मापने के लिए मुख्य विधि है। यह बस एस चरण कोशिकाओं है कि प्रदर्शन कर एक मछली संकेतों बनाम के लिए एक दिया एलील 15, 16 दोहरी का प्रतिशत का प्रतिशत की गणना के द्वारा किया जाता है। एक वैकल्पिक तरीका, BrdU के साथ डीएनए लेबलिंग, एस के साथ कई बार अंक के लिए उनके डीएनए सामग्री के अनुसार कोशिकाओं छँटाई, BrdU युक्त डीएनए immunoprecipitating, और qPCR 17 के साथ उपजी डीएनए की बहुतायत जाँच नाड़ी के होते हैं।

जीनोमिक टीओआर मानचित्रण दो तरीकों से प्राप्त किया जा सकता है। पहली विधि ऊपर वर्णित BrdU-आईपी आधारित विधि का एक जीनोमिक संस्करण है, जिसमें राशि की मात्रा का ठहरावके प्रत्येक अंश में उपजी डीएनए संकरण के माध्यम से पूरे जीनोम के लिए या गहरी अनुक्रमण द्वारा एक साथ किया जाता है। दूसरी विधि, सीएनआर-टो, G1 कोशिकाओं में डीएनए सामग्री द्वारा एस चरण कोशिकाओं और सामान्य से प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र की प्रतिलिपि संख्या को मापने पर आधारित है। इस विधि में, कोशिकाओं गैर नकल (G1 चरण) और नकल (एस चरण) समूह (चित्रा 1) में FACS के अनुसार क्रमबद्ध हैं। G1 में कोशिकाओं सभी जीनोमिक क्षेत्रों में एक ही कॉपी संख्या है और इस तरह उनके डीएनए सामग्री एक ही होना चाहिए। दूसरी ओर, एस में डीएनए नकल संख्या टीओआर पर निर्भर करता है, क्योंकि जल्दी नकल क्षेत्रों सबसे कोशिकाओं में प्रतिकृति कराना पड़ा और इसलिए उनके डीएनए सामग्री दोगुनी है, जबकि देर से नकल क्षेत्रों सबसे कोशिकाओं में अभी तक नहीं दोहराया है और इसलिए उनके डीएनए सामग्री होगा G1 कोशिकाओं के समान हो। इसलिए डीएनए सामग्री की G1 अनुपात करने के लिए एस टीओआर का संकेत है। प्रत्येक जीनोमिक क्षेत्र के लिए डीएनए की राशि के संकरण से मापा जाता है, या तोप्रोटीन या गहरी अनुक्रमण 2, 8 से। सीएनआर-टीओआर विधि के फायदे के आगे चर्चा की जाएगी।

इस पत्र चित्रा 2 में वर्णित के रूप में जीनोमिक टीओआर मानचित्रण के लिए सीएनआर-टीओआर विधि का वर्णन है। कागज परिणामों के बुनियादी विश्लेषण और जीनोमिक टीओआर नक्शे के निर्माण के लिए जब तक कोशिकाओं को इकट्ठा करने से पूरी प्रक्रिया का ठीक विवरण पर चर्चा। इस पत्र में वर्णित प्रोटोकॉल सफलतापूर्वक संस्कृति में विकसित विभिन्न प्रकार की कोशिकाओं पर प्रदर्शन किया गया है। इस प्रोटोकॉल के भविष्य में सुधार विवो में टो के मानचित्रण के लिए और दुर्लभ प्रकार की कोशिकाओं में नेतृत्व कर सकते हैं।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

नोट: टो केवल बढ़ रही है, unsynchronized कोशिकाओं पर मापा जा सकता है। 2 एक्स 10 6 तेजी से बढ़ कोशिकाओं, जो आम तौर पर ~ 1 x 10 5 एस चरण में कोशिकाओं का परिणाम देगा (दर सीमित कदम) - प्रक्रिया में कम से कम 1 के साथ शुरू करना चाहिए। यह एक प्रयोग के लिए दो या तीन प्रतिकृति का उपयोग कर संचालन करने के लिए सिफारिश की है। सीएनआर-टीओआर की पूरी प्रक्रिया एक सप्ताह के भीतर पूरा किया जा सकता है - दो दिन, पुस्तकालय तैयारी करने के लिए सभी कदम के लिए समर्पित किया जाना चाहिए एक से दो दिन अनुक्रमण के लिए आवश्यक हैं और एक अतिरिक्त दिन प्रारंभिक डेटा विश्लेषण के लिए आवश्यक है।

1. संस्कृति से कोशिकाओं के संग्रह

नोट: प्रोटोकॉल 10 सेमी प्लेट (लगभग 2 युक्त - 5 एक्स 10 6 कोशिकाओं) में संस्कृति में बढ़ कोशिकाओं के लिए लिखा है, लेकिन आसानी से अन्य प्लेटफार्मों पर समायोजित किया जा सकता है।

  1. कोशिकाओं है कि निलंबन में बड़े हो रहे थे के लिए, निर्धारण करने के लिए (धारा 2) आगे बढ़ें।
  2. पक्षपाती कोशिकाओं, महाप्राण और धोने के लिए PLसीए 2 और 2 मिलीग्राम + बिना 3 एमएल पीबीएस के साथ खाया।
  3. पीबीएस त्यागें और 1 एमएल वाणिज्यिक trypsin EDTA के साथ 37 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए कोशिकाओं सेते हैं जब तक कोशिकाओं को अलग।
    नोट: trypsin उपचार की अवधि प्रत्येक कोशिका प्रकार समायोजित किया जाना चाहिए।
  4. 3 एमएल संस्कृति मीडिया trypsin बेअसर और एक 15 एमएल शंक्वाकार ट्यूब या 5 एमएल polystyrene ट्यूब में कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए जोड़ें। बर्फ पर रखें।

2. फिक्सेशन

नोट: इस भाग के लिए, सभी चरणों 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 300 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  2. महाप्राण और 1 एमएल ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  3. 250 μL (कुल) ठंड पीबीएस में कोशिकाओं Resuspend।
  4. जबकि धीरे ट्यूब vortexing, धीरे धीरे सी 100% इथेनॉल ° -20 की dropwise 800 μL जोड़ें। 80% - यह 70 के अंतिम इथेनॉल एकाग्रता की ओर जाता है।
    नोट: उच्च शुद्धता इथेनॉल इस कदम पर की सिफारिश की है।
  5. के लिए बर्फ पर कोशिकाओं को सेतेआर 30 मिनट।
    नोट: इस चरण कोशिकाओं 4 डिग्री सेल्सियस पर या -20 डिग्री सेल्सियस पर कुछ महीनों के लिए कुछ दिनों के लिए रखा जा सकता है पर।

3. पीआई धुंधला

  1. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 500 XG पर कोशिकाओं अपकेंद्रित्र।
  2. सतह पर तैरनेवाला ध्यान Aspirate और 1 एमएल ठंड पीबीएस के साथ कोशिकाओं को दो बार धो लें।
  3. महाप्राण और निम्न मिश्रण के साथ प्रत्येक नमूना resuspend: 1 एमएल पीबीएस, 5 μL 10 मिलीग्राम / एमएल RNaseA, 50 μL 1 मिलीग्राम / एमएल propidium आयोडाइड (पीआई, उपयोग करने से पहले मिश्रण बोतल)। ~ 2 x 10 6 कोशिकाओं / एमएल) के लिए एकाग्रता को समायोजित करें।
    नोट: प्रकाश से बाहर रखें - पीआई प्रकाश के प्रति संवेदनशील है।
  4. एक 5 एमएल polystyrene ट्यूब के लिए 35 माइक्रोन जाल के माध्यम से फिल्टर, और Parafilm के साथ बंद हुआ।
  5. अंधेरे में आरटी पर सेते हैं, 15 के लिए - 30 मिनट।
    नोट: कोशिकाओं को अब FACS विश्लेषण के लिए तैयार हैं। यदि आवश्यक हो, दाग कोशिकाओं अंधेरे में 4 डिग्री सेल्सियस पर कम से कम 24 घंटे के लिए भंडारित किया जा सकता है।

4. क्रमबद्ध

  1. क्रमबद्ध एक FACS मशीन का उपयोग कोशिकाओं। हमेंई 561 एनएम लेजर उनकी पीआई तीव्रता के आधार पर कोशिकाओं को अलग करने के लिए। अन्य 488 एनएम या 532 की तरह 535 एनएम उत्तेजना अधिकतम निकट लेज़रों FACS मशीन विन्यास के आधार पर किया जा सकता है।
  2. इष्टतम परिणामों के लिए, सबसे छोटी नोक विशेष सेल का आकार (सबसे कोशिकाओं 85 माइक्रोन के लिए) के लिए सिफारिश का उपयोग करें। उपज के ऊपर पवित्रता मोड को प्राथमिकता दें। 45 साई की एक म्यान दबाव के साथ, एक स्थिर धीमी प्रवाह का प्रयोग करें, आमतौर पर अप करने के लिए 300-500 घटनाओं / एस।
  3. Gating का उपयोग करना, साजिश रचने एफसीएस बनाम एसएससी द्वारा मृत कोशिकाओं और subcellular मलबे (कम एफसीएस और उच्च एसएससी) भेदभाव। व्यवहार्य कोशिकाओं से की साजिश रचने एसएससी-चौड़ाई (डब्ल्यू) बनाम एसएससी-ऊँचाई (एच) एक FSC डब्ल्यू बनाम एफएससी-एच साजिश और PI- डब्ल्यू द्वारा द्वारा पीछा द्वारा दोहरी भेदभाव बनाम पीआई-एच (दोहरी ही एच मूल्य होगा लेकिन बड़ा डब्ल्यू मूल्य)। व्यवहार्य एकल कक्षों के लिए पीआई-क्षेत्र (ए) तीव्रता जो कोशिकाओं के डीएनए सामग्री का प्रतिनिधित्व करता है की एक हिस्टोग्राम आकर्षित।
  4. G1 और एस चरणों में क्रमबद्ध कोशिकाओं, चित्रा 1 में दिखाया गया है। S के लिए गेटिंग विस्तृत हो सकता है और G1 और G2 चरणों में अतिक्रमण, जबकि G1 gating संकीर्ण हो और जहाँ तक एस से संभव के रूप में करना चाहिए।

आकृति 1
चित्रा 1. सेल चक्र चरण दृढ़ संकल्प पीआई तीव्रता के आधार पर। माउस भ्रूण fibroblast (MEF) जनसंख्या के सेलुलर डीएनए सामग्री का वितरण (पीआई-क्षेत्र से मापा जाता है) दिखा हिस्टोग्राम। चिह्नित क्षेत्रों का उपयोग कर, 4N डीएनए सामग्री) - डीएनए सामग्री दो उप आबादी i) G1 कोशिकाओं (2N डीएनए सामग्री) और द्वितीय) एस चरण कोशिकाओं (2N में जनसंख्या सुलझाने के लिए प्रयोग किया जाता है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

नोट: G1 कोशिकाओं के संग्रह के प्रयोजन के लिए विभिन्न क्षेत्रों के बीच जीनोमिक अनुक्रमण दक्षता में पूर्वाग्रहों के लिए खाते में करने के लिए है। एक वैकल्पिक एप्लिकेशनरोच एक ही सेल प्रकार से G1 को गिरफ्तार कर लिया कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए है। यह दृष्टिकोण क्लीनर परिणाम देता है (क्योंकि यह कम से कम एस चरण संदूषण) को गिरफ्तार कर लिया, लेकिन यह कोशिकाओं और मापा कोशिकाओं के बीच आनुवंशिक अंतर से उत्पन्न पूर्वाग्रहों पेश हो सकता है।

  1. ठंड की स्थिति में क्रमबद्ध और 1.5 / 2 एमएल ट्यूबों में हल कोशिकाओं को इकट्ठा। क्रमबद्ध निम्नलिखित बर्फ पर ट्यूबों रखें।
    नोट: 4 डिग्री सेल्सियस 18 पर 3 घंटे - - के लिए 1 5% बीएसए डीएनए वसूली में सुधार करने के लिए, यह कम बाध्यकारी ट्यूबों का उपयोग करने के लिए या 4 के साथ लेपित ट्यूबों का उपयोग करने के लिए बेहतर है।

5. डीएनए शुद्धि

  1. प्रत्येक नमूना (G1 और एस) के लिए एक डीएनए शुद्धि किट का उपयोग डीएनए शुद्ध।
    नोट: वाणिज्यिक किट का उपयोग करते हैं, के रूप में निर्माता से सिफारिश, उच्च उपज के लिए एक 2 एमएल ट्यूब में 400 μL क्षालन बफर के साथ elute।
  2. fluorometer का उपयोग डीएनए एकाग्रता की जाँच करें।
    नोट: 100,000 स्तनधारी FACS द्वारा एकत्र की कोशिकाओं से, एक डीएनए के ~ 1 माइक्रोग्राम मिलना चाहिए। एटी इस स्तर डीएनए 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए रखा जा सकता है।

6. Sonication

  1. एक 1.7 एमएल ट्यूब कि चुंबकीय इस्तेमाल किया स्टैंड के साथ संगत है में डीएनए स्थानांतरण।
  2. निर्माता के निर्देशों के अनुसार 2x SPRI मोती का उपयोग कर, एक चुंबकीय स्टैंड का उपयोग डीएनए ध्यान लगाओ, और 50 μL क्षालन बफर में elute।
  3. 250 बीपी के एक औसत लक्ष्य चोटी आकार के लिए एक केंद्रित ultrasonicator के साथ कतरनी डीएनए। एक 50 μL डीएनए नमूने लिए निम्नलिखित सेटिंग्स का उपयोग करें: 50 डब्ल्यू, 20% ड्यूटी कारक, फट प्रति 200 साइकिल, 20 डिग्री सेल्सियस, 120 S।
  4. वैद्युतकणसंचलन द्वारा sheared डीएनए के आकार की जाँच करें। ~ 250 बीपी पर एक चोटी के साथ 700 बीपी - सिफारिश आकार के वितरण 200 है।
    नोट: इस स्तर पर डीएनए 4 डिग्री सेल्सियस पर या लंबे समय तक भंडारण के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर कुछ दिनों के लिए रखा जा सकता है।

7. पुस्तकालय तैयारी, और अनुक्रमण

नोट: कई पुस्तकालय तैयारी किट और अलगईएनटी अनुक्रमण प्लेटफार्मों हमारे द्वारा इस्तेमाल किया और माल खंड में वर्णित लोगों को इसी तरह से काम करना चाहिए। वास्तव में अतीत में, टो नक्शे माइक्रोएरे प्लेटफार्मों 2 के साथ एक बहुत ही इसी पद्धति का उपयोग करके उत्पन्न किया गया।

  1. किसी भी व्यावसायिक पुस्तकालय तैयारी किट का उपयोग पुस्तकालयों तैयार करें।
  2. 800 बीपी - पुस्तकालय तैयारी के अंत में, 300 के लिए चुंबकीय मोतियों का उपयोग आकार का चयन करें।
  3. पुस्तकालयों तैयार करने के बाद, fluorometer का उपयोग डीएनए एकाग्रता को मापने।
  4. डीएनए आकार को मापने वैद्युतकणसंचलन का उपयोग कर।
  5. किसी भी मंच पर अनुक्रमण प्रदर्शन करना।
    नोट: अनुक्रमण कम से कम 10 एम नमूना प्रति पढ़ता सिफारिश की है। इस गहराई एक पढ़ा लगभग हर 300 बीपी (~ 3 के लिए जीबी आकार जीनोम) के बराबर है, और 50 के एक प्रस्ताव पर टीओआर मापन के लिए पर्याप्त है - 100 केबी। गहराई खिड़कियों के आकार में कमी का परिणाम देगा बढ़ाने और इस प्रकार अधिक निश्चितता के साथ संकल्प में वृद्धि सक्षम हो जाएगा। बनती अंत अनुक्रमण में आवश्यक नहीं हैकेवल कवरेज जानकारी के बाद से इस प्रोटोकॉल एकत्र किया जाता है। यह, हालांकि, स्थान को हल करने में पढ़ता है कि दोहराव दृश्यों को शामिल करने में मदद मिल सकती है।

8. विश्लेषण

नोट: डेटा विश्लेषण ए कोरेन एट अल द्वारा इस्तेमाल किया पद्धति पर आधारित है। 19।

  1. इसी जीनोम bowtie2 या किसी विश्वसनीय कम पढ़ा एलाइनर का उपयोग करने के मानचित्र अनुक्रमण डेटा। परिभाषित अलग-अलग आकार के, 200 के द्वारा कवर क्षेत्रों के रूप में बराबर-कवरेज गुणसूत्र खिड़कियों G1 अंश में पढ़ता है और गिनती एस चरण में ही खिड़कियों में पढ़ता है।
  2. प्रत्येक विंडो के लिए एस / G1 अनुपात की गणना। इस जीनोम (चित्रा 3) के साथ एस / G1 अनुपात में बड़े उतार चढ़ाव के साथ एक नक्शा उत्पन्न करनी चाहिए। टीओआर माप की विश्वसनीयता के लिए एक अच्छा नियंत्रण G1 / G1 अनुपात (G1 के दो अलग-अलग माप से) जो बहुत चापलूसी होना चाहिए करने के लिए इस नक्शे की तुलना है।
  3. मानक के अनुसार करने के लिए 0 डेटा मतलब है और प्रत्येक वी से घटा कर 1 एसडीसभी खिड़कियां (एक्स गुणसूत्र को छोड़कर) और सभी खिड़कियों के एस / G1 के मानक विचलन द्वारा विभाजित परिणाम के औसत मूल्य Alue। इस क्रम में Z स्कोर में बदलने और विभिन्न प्रयोगों के बीच तुलना को सक्षम करने में किया जाता है।
  4. UCSC जीनोम ब्राउज़र के रूप में अच्छी तरह से प्रत्येक शेष अंतर की खाई को कम से कम 15 डेटा खिड़कियों से युक्त टुकड़ा द्वारा सूचीबद्ध सभी क्षेत्रों खाई निकालें।
  5. 10 के एक पैरामीटर के साथ matlab समारोह csaps के माध्यम से एक घन समरेखण पट्टी के साथ शेष टुकड़े चिकनी - 16 और सेट अंक पर हर 100 केबी बैठाना।
    नोट: समरेखण और प्रक्षेप के पैरामीटर्स डेटा की गहराई के आधार पर समायोजित किया जाना चाहिए। अन्य उपयुक्त समरेखण तरीकों और कार्यों मौजूद हैं और इस्तेमाल किया जा सकता है।
  6. नेत्रहीन प्रत्येक को दोहराने की विश्वसनीयता की पुष्टि के बाद, विलय सभी पढ़ता है और इसी प्रक्रिया के इस डेटा के ऊपर वर्णित के प्रदर्शन से एक गहरी संकल्प प्रोफ़ाइल गणना।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

एक ठेठ टीओआर नक्शा माउस भ्रूणीय fibroblasts के लिए चित्रा 3 (MEFs) में दिखाया गया है। दोनों डॉट्स, जो अलग-अलग खिड़कियां (कदम 8.3) के लिए सामान्यीकृत एस / G1 अनुपात रहे हैं, साथ ही लाइन है जो घन समरेखण और प्रक्षेप (कदम 8.5) का परिणाम यह आंकड़ा विश्लेषण की प्रक्रिया को दर्शाता है के बाद से यह पता चलता है।

i) बड़े क्षेत्रों (एक megabase के क्रम में) जो एक साथ (सीटीआर = लगातार टीओआर) क्षेत्रों में जल्दी दोहराने, मध्य या देर हो चुकी है: इस तरह के नक्शे प्रतिकृति कार्यक्रम का संगठन है, जो टीओआर डोमेन के दो प्रकार का घपला है कब्जा ; और ii) लौकिक संक्रमण क्षेत्रों (TTRs) जिसमें टीओआर धीरे-धीरे बदलता है। सीटीआर TTRs द्वारा एक दूसरे से जुड़े हुए हैं और एक साथ प्रतिकृति संगठन के इन दो प्रकार के पूरे जीनोम को कवर किया।

अपेक्षाकृत कम अनुक्रमण ग के बावजूद बढ़ा हुआ टीओआर मानचित्रण के लिए प्रयोग किया जाता है (एक को पढ़ने के हर 300 बीपी), जिसके परिणामस्वरूप नक्शे काफी मजबूत कर रहे हैं। चित्रा 4 एक ही क्षेत्र में माउस पूर्व बी कोशिकाओं की triplicates की तुलना में MEF कोशिकाओं के बीच triplicates टीओआर नक्शे के reproducibility पता चलता है। इस तरह के नक्शे के बीच तुलना अंतर टीओआर के साथ क्षेत्रों के जो क्षेत्रों में जो ऊतकों के बीच टीओआर नक्शे में मतभेद प्रतिकृति के बीच मतभेदों की तुलना में काफी बड़ा कर रहे हैं के रूप में परिभाषित कर रहे हैं की पहचान के लिए अनुमति देता है।

चित्र 2
चित्रा 2: प्रोटोकॉल योजना। योजनाबद्ध आरेख सीएनआर-टीओआर विधि की प्रक्रिया का वर्णन है। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

57 / 55157fig3.jpg "/>
चित्रा 3: प्रतिनिधि जीनोमिक टीओआर नक्शे। दिखाया गया है MEF कोशिकाओं के पूरे क्रोमोजोम 1 की टो और एक ~ 50 एमबी क्षेत्र में एक करीब देखो। दिखाया आकार खिड़कियां (डॉट्स) और smoothed डेटा (ठोस लाइन) बदलती में एस / G1 मूल्यों के Z स्कोर कर रहे हैं। जबकि कम मूल्यों देर प्रतिकृति के अनुरूप उच्च एस / G1 मूल्यों जल्दी प्रतिकृति के अनुरूप हैं। (; लाल सीटीआर) और लौकिक संक्रमण क्षेत्रों (TTRs, हरी) तीर लगातार टीओआर क्षेत्रों के उदाहरण को इंगित करें। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4: दोहराता की Reproducibility। (ए) Smoothed MEF triplicates के टीओआर (नीला) माउस गुणसूत्र 1. ऑरेंज तीर पर एक 18 एमबी क्षेत्र में पूर्व बी triplicates (लाल) की तुलनासेल लाइनों के बीच अंतर क्षेत्रों के उदाहरण को इंगित करें। (बी) के 6 नमूने के बीच स्पीयरमैन सहसंबंध की गर्मी नक्शा। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

सीएनआर-टीओआर किसी भी यूकेरियोटिक proliferating सेल की आबादी है कि एस के लिए FACS और G1 चरणों (Rhind एन और गिल्बर्ट डीएम 20 द्वारा समीक्षा) द्वारा विभाजित किया जा सकता है पर सिद्धांत रूप में किया जा सकता है। विधि यहाँ वर्णित इस तरह के मानव और माउस के रूप में ~ 3 जीबी की एक जीनोम आकार के साथ स्तनधारी कोशिकाओं को समायोजित किया गया है। सीएनआर-टीओआर प्रोटोकॉल में छोटे परिवर्तन (सेल तैयारी और अनुक्रमण गहराई में) आदेश यूकेरियोट्स के लिए इसे समायोजित करने के लिए आवश्यक हैं। ध्यान एस चरण कोशिकाओं की पर्याप्त मात्रा का संग्रह करने के लिए भुगतान किया जाना चाहिए, क्योंकि यह दर सीमित कदम है। इस प्रकार, सेल चक्र के लिए एक प्रारंभिक FACS पुष्टि करने के लिए है कि प्रयोग किया जा सकता है और एस चरण में कोशिकाओं की मात्रा मान्य करने के लिए किया जाना चाहिए। कोशिकाओं जो अनियमित सेल चक्र प्रदर्शन के लिए, यह कोशिकाओं को विभाजित पता लगाने के लिए BrdU के साथ कोशिकाओं prestain, और FACS चरण तक विरोधी BrdU निर्माता प्रोटोकॉल का पालन करने के लिए सिफारिश की है। आमतौर पर कोशिकाओं 30 मिनट के लिए 10-20 माइक्रोन के BrdU के साथ दाग रहे हैं।

5 कोशिकाओं प्राप्त करने में दोहराने के लिए एक एकल 10 सेमी टिशू कल्चर प्लेट / कुप्पी (लगभग 2-5 एक्स 10 6 कोशिकाओं से युक्त) की सिफारिश की है। यह राशि जब धीमी गति से बढ़ रही कोशिकाओं के साथ काम वृद्धि की जानी चाहिए, क्योंकि एस चरण में कोशिकाओं का प्रतिशत कम है और इस तरह एक आदेश एस में कोशिकाओं के लिए पर्याप्त मात्रा में प्राप्त करने में अधिक कोशिकाओं से हल करने के लिए है

जब कोशिकाओं छँटाई, यह उनकी डीएनए सामग्री के लिए और इस तरह एक कम प्रवाह दर की सिफारिश की है अनुसार कोशिकाओं का सबसे अच्छा संभव जुदाई को प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है। आदेश में अस्थायी समाधान को अधिकतम करने के लिए, यह कोशिकाओं को इकट्ठा करने के लिए महत्वपूर्ण हैपूरे एस चरण से। यह एस के रूप में व्यापक gating संभव (चित्रा 1) के रूप में हासिल की है। दूसरी ओर, G1 gating संकीर्ण होना चाहिए (G1 चोटी से और बाईं करने के लिए शुरू, चित्रा 1) के क्रम में दोनों उप-G1 और जल्दी एस चरण संदूषण से बचने के लिए।

Sonication विभिन्न तरीकों से किया जा सकता है, लेकिन यह एक केंद्रित ultrasonicator जो एक प्रयोग की जांच के लिए आवश्यकता के बिना एक मजबूत और आसान sonication के लिए सक्षम बनाता है का उपयोग करने के लिए सिफारिश की है। फिर भी, जब पहली बार प्रयोगशाला में प्रोटोकॉल की स्थापना, यह 200-700 बीपी के एक आकार वितरण प्राप्त करने के लिए मानकों को जांच करने की सिफारिश की है।

BrdU-आईपी और सीएनआर-Tor - के रूप में परिचय में बताया गया है, वहाँ जीनोम चौड़ा टीओआर मानचित्रण के लिए दो मुख्य तरीके हैं। दोनों तरीकों समान टीओआर नक्शे (डेटा) नहीं दिखाया उन दोनों के बीच मतभेदों के बावजूद दे। सीएनआर-टीओआर विधि अधिकतम अंतर betwe के बाद से अपनी संवर्धन सीमा में सीमित हैके बाद से जल्दी नकल क्षेत्रों जल्दी अंश में लगभग केवल BrdU शामिल होंगे जल्दी और देर क्षेत्रों एन दुगना है, जबकि साथ BrdU आईपी बहुत अधिक संवर्धन हासिल की है, है। दूसरी ओर, BrdU आईपी विधि संकल्प एस चरण एकत्र भिन्न की संख्या से सीमित है। इसकी सबसे आम आवेदन में, केवल दो भिन्न (प्रारंभिक देर हो चुकी बनाम) तुलना कर रहे हैं, जो ठीक अस्थायी समाधान के लिए एक समझौता में यह परिणाम है। सीएनआर-टीओआर विधि, हालांकि, पूरे एस चरण के साथ एक सतत संकेत देता है। इसके अलावा, BrdU आईपी विधि इम्युनो-वर्षा जो आमतौर पर सीएनआर-टीओआर विधि की तुलना में एक बहुत अधिक पृष्ठभूमि देता है पर आधारित है। सीएनआर-टीओआर पद्धति का एक और लाभ यह है कि यह पूर्वव्यापी हाल ही में 21 में वर्णित के रूप में unsynchronized संस्कृतियों का अनुक्रमण डेटा से टीओआर जानकारी निकालने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। अंत में, सीएनआर-टीओआर विधि तथ्य यह है कि यह इसके बाद से नीचे पहुंचा जा सकता है की अपनी सादगी की वजह से और कारण बेहतर है immu पर आधारित नहीं हैकोई-वर्षा।

जीनोमिक और Epigenomic सुविधाओं के जटिल नेटवर्क में टीओआर की भूमिका deciphered जाना बना रहता है। सीएनआर-टीओआर विधि के रिश्तेदार आसानी प्राकृतिक परिस्थितियों है कि कोशिकाओं के अनुभव और अच्छी तरह से पता लगाया जाना चाहिए और व्यापक जीनोम के कई शामिल करने के लिए मौजूदा टीओआर डेटा के विस्तार के लिए अनुमति देता है। यह विभिन्न प्रतिकृति तनाव की स्थिति, endoreduplication के साथ ही विभिन्न कैंसर परिवर्तनों भी शामिल है। एसएनपी डेटा और उच्च अनुक्रमण गहराई का उपयोग भी अलग से एक एलील के टीओआर को मापने के लिए अनुमति देगा। इसके अलावा, अनुक्रमण लागत में और कमी टीओआर नक्शे का संकल्प है, जो सहायता कर सकते हैं और आगे की बढ़ती में स्थितियों के बीच सूक्ष्म परिवर्तनों की पहचान की अनुमति सक्षम हो जाएगा। अन्य भविष्य के आवेदनों मौजूदा तरीकों में सुधार और कोशिकाओं जो विवो में टीओआर को मापने के लिए सक्षम हो जाएगा की कम संख्या पर टीओआर माप को लागू करने से प्राप्त किया जा सकता है।

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Acknowledgments

हम आंकड़े पैदा करने में सहायता के लिए उड़िया वर्दी धन्यवाद। IS समूह में काम इसराइल विज्ञान फाउंडेशन (अनुदान संख्या 567/10) और यूरोपीय अनुसंधान परिषद अनुदान (# 281306) शुरू करने से समर्थन किया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
PBS BI (Biological Industries) 02-023-1A
Trypsin-EDTA BI (Biological Industries) 03-052-1B
15 mL conical tube Corning 430790
5 mL Polystyrene round Bottom tube with cell strainer cap  BD-Falcon 352235
Ethanol Gadot 64-17-5
RNAse-A 10 mg/mL Sigma R4875
Propidiom iodide 1 mg/mL Sigma P4170
Parafilm Parafilm PM-996
1.5 mL DNA LoBind Eppendorf tubes  Eppendorf 22431021
BSA Sigma A7906
1.7 mL MaxyClear tube  Axygen MCT-175-C
magnetic beads - Agencourt AMPure XP  Beckman Coulter A63881
Ultrasonicator Covaris M-series  -530092
50 µL microTUBE AFA Fiber Screw-Cap 6 x 16 mm Covaris 520096
Qubit fluorometer Invitrogen
Qubit dsDNA High Sensitivity (HS) Assay Kit Invitrogen Q32854
Electrophoresis 2200 Tape station system Agilent D1000 ScreenTape
Seqeuncing - Illumina NextSeq system Illumina SY-415-1001
Dneasy kit for DNA purification Qiagen 69504
PureProteom Magnetic Stand Millipore LSKMAGS08
Anti-BrdU/FITC DAKO F7210
FACS sorter BD FACSARIA III
FACS software BD FACSDiva v 8.0.1

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Farkash-Amar, S., Simon, I. Genome-wide analysis of the replication program in mammals. Chromosome Res. 18, (1), 115-125 (2010).
  2. Yaffe, E., et al. Comparative analysis of DNA replication timing reveals conserved large-scale chromosomal architecture. PLoS Genet. 6, (7), e1001011 (2010).
  3. Hiratani, I., et al. Global reorganization of replication domains during embryonic stem cell differentiation. PLoS Biol. 6, (10), (2008).
  4. Rivera-Mulia, J. C., et al. Dynamic changes in replication timing and gene expression during lineage specification of human pluripotent stem cells. Genome Res. 25, (8), 1091-1103 (2015).
  5. Ryba, T., et al. Abnormal developmental control of replication-timing domains in pediatric acute lymphoblastic leukemia. Genome Res. 22, (10), 1833-1844 (2012).
  6. Farkash-Amar, S., et al. Global organization of replication time zones of the mouse genome. Genome Res. 18, (10), 1562-1570 (2008).
  7. Koren, A., McCarroll, S. A. Random replication of the inactive X chromosome. Genome Res. 24, (1), 64-69 (2014).
  8. Mukhopadhyay, R., et al. Allele-specific genome-wide profiling in human primary erythroblasts reveal replication program organization. PLoS Genet. 10, (5), e1004319 (2014).
  9. McNairn, A. J., Gilbert, D. M. Epigenomic replication: linking epigenetics to DNA replication. Bioessays. 25, (7), 647-656 (2003).
  10. Sima, J., Gilbert, D. M. Complex correlations: replication timing and mutational landscapes during cancer and genome evolution. Curr Opin Genet Dev. 25, 93-100 (2014).
  11. Kenigsberg, E., et al. The mutation spectrum in genomic late replication domains shapes mammalian GC content. Nucleic Acids Res. 44, (9), 4222-4232 (2016).
  12. Woo, Y. H., Li, W. H. DNA replication timing and selection shape the landscape of nucleotide variation in cancer genomes. Nat Commun. 3, 1004 (2012).
  13. Liu, L., De, S., Michor, F. DNA replication timing and higher-order nuclear organization determine single-nucleotide substitution patterns in cancer genomes. Nat Commun. 4, 1502 (2013).
  14. Goren, A., Cedar, H. Replicating by the clock. Nat Rev Mol Cell Biol. 4, (1), 25-32 (2003).
  15. Selig, S., Okumura, K., Ward, D. C., Cedar, H. Delineation of DNA replication time zones by fluorescence in situ hybridization. EMBO J. 11, (3), 1217-1225 (1992).
  16. Smith, L., Thayer, M. Chromosome replicating timing combined with fluorescent in situ hybridization. J Vis Exp. (70), e4400 (2012).
  17. Simon, I., et al. Asynchronous replication of imprinted genes is established in the gametes and maintained during development. Nature. 401, (6756), 929-932 (1999).
  18. Phi-Wilson, J. T., Recktenwald, D. J. Coating agents for cell recovery. Google Patents. (1993).
  19. Koren, A., et al. Differential relationship of DNA replication timing to different forms of human mutation and variation. Am J Hum Genet. 91, (6), 1033-1040 (2012).
  20. Rhind, N., Gilbert, D. M. DNA replication timing. Cold Spring Harb Perspect Biol. 5, (8), a010132 (2013).
  21. Koren, A., et al. Genetic variation in human DNA replication timing. Cell. 159, (5), 1015-1026 (2014).
डीएनए सामग्री माप द्वारा स्तनधारी प्रतिकृति समय के जीनोम चौड़ा निर्धारण
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).More

Yehuda, Y., Blumenfeld, B., Lehmann, D., Simon, I. Genome-wide Determination of Mammalian Replication Timing by DNA Content Measurement. J. Vis. Exp. (119), e55157, doi:10.3791/55157 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter