Denne studien viser en standardisert og validert metode for isolering og kultur av primær endometrial mus stromale og epiteliale celler, som kan brukes i et coculture system for å studere in vitro decidualization.
Decidualization er et progesteron-avhengig differensiering av endometrial stromale celler og er en forutsetning for vellykket implantasjon embryo. Selv om mange forsøk har vært gjort for å vise de underliggende mekanismene for decidualization, forblir s signalering mellom epitelcellene som er i berøring med embryoet og de underliggende stromale celler dårlig forstått. Derfor studerer decidualization på en måte som tar både epiteliale og stromale celler i betraktning kan forbedre vår kunnskap om de molekylære detaljene decidualization. For dette formål in vivo-modeller av kunstig decidualization er fysiologisk de mest relevante; imidlertid, er manipulering av intercellulær kommunikasjon er begrenset. For tiden, in vitro kulturer av endometrial stromale celler blir brukt til å undersøke modulering av decidualization av flere signaliseringsmolekyler. Konvensjonelt, humane eller mus endometriale stromale celler eranvendes. Imidlertid er tilgjengeligheten av humane prøver veldig ofte begrenset. Videre er bruken av murine vev sammen med variasjon i fremgangsmåten i dyrkning. Denne studien presenterer en validert og standardisert metode for å skaffe rent Livmor epitelceller (EEC) og stromal Cell (ESC) kulturer som bruker voksne intakte mus behandlet med østrogen i tre påfølgende dager. Protokollen er optimalisert for å forbedre utbyttet, levedyktighet og renhet av cellene og ble ytterligere utvidet for å studere decidualization i en coculture av EEC og ESC. Denne modellen kan være egnet til å utnytte betydningen av begge celletyper i decidualization og å vurdere bidraget av betydelige signalmolekyler skilles ut av EEC eller ESC under interkommunikasjon.
Den menneskelige endometrium er indre foring av livmor og gjennomgår månedlige sykluser av sammenbrudd og reparasjon som en forberedelse for mulige graviditeter. Den består av et enkelt lag av epitelceller lining livmor lumen og den underliggende stroma som varierer i tykkelse i henhold til svingninger av eggstokkhormoner østrogen og progesteron. I lutealfasen, vil postovulatory progesteron bølge indusere differensiering av endometrial stromale celler i større, runde uterusslimhinneceller, en prosess som kalles decidualization 1, 2. I human skjer dette fenomenet spontant å danne predecidua, men blir mer uttalt ved embryo implantasjon. En funksjonell følge av decidualization er at livmoren forbigående blir mottakelig for embryo implantasjon. Dette intervallet er merket som "vindu implantasjon '. I den første perioden av embryoimplantasjonen, den decidualized endometrial stromale celler som omgir den implantere embryo vil gi en barriere for å hindre passasje av skadelige stoffer til embryoet 3. Under svangerskapet, vil dette decidua gi næring til fosteret før placentation har funnet sted, og vil senere danne mors del av morkaken 4.
Etiske og praktiske hensyn begrenser utformingen av humane studier for å undersøke prosessen med decidualization og har ført til bruk av dyremodeller. Å være medlem av hemochorial placentation gruppen, vil endometrium av gnagere også gjennomgå decidualization før placentation 5. I gnagere, men initieringen av decidualization prosessen avhenger av tilstedeværelsen av blastocyster i livmor lumen, som indikerer at en ekstra stimulus er nødvendig for å utløse responser Deciduale 6. Dette innebærer en intrikat kommunikasjon mellom the endometrial epitelceller som ikke har direkte kontakt med den blastocyst, og de underliggende stromale celler. Likevel kan decidualization være kunstig indusert ved hjelp av stimuli som mekanisk skrape eller drypping av olje i et hormonelt primet livmor. Selv om in vivo studier med kunstige decidualization modeller har tillatt oss å forbedre våre innsikt i det komplekse signal prosessen med decidualization, mekanistiske fordypning, for eksempel undersøkelse av uunnværlig kommunikasjon mellom epitel og stromale celler, er begrenset. Derfor kan in vitro decidualization studier brukes til å manipulere viktige stier og studere fundamentale prosesser. For å oppnå dette, kan primær endometriale stroma cellekulturer settes opp fra human eller gnager endometrium. Ansette gnagere samtykker bruk av genmodifiserte dyr for å undersøke hvilken rolle et bestemt protein av interesse under decidualization prosessen. Men umoden, prepuberty mus brukes ofte for å unngå komplikasjoner av brunst, mens i andre tilfeller uteri er samlet fra alle faser av brunst, noe som resulterer i en heterogenitet i kulturene. Videre har prosessen med decidualization blitt studert i forskjellige protokoller, for eksempel, ved (i) som utfyller hormoner (østrogen, progesteron eller cyklisk adenosin monofosfat (cAMP)) til dyrkningsmediet, eller ved (ii) isolering av uterusslimhinneceller fra mus ved dag 4,5 av (pseudo) svangerskapet, noe som krever ekstra behov for plug kontroll og vasectomized menn. Disse begrensningene demonstrere nødvendigheten av en standardisert metode for å studere in vitro decidualization. I denne studien til en fysiologisk modell undersøke in vitro decidualization fra voksen, vil ikke (pseudo) gravide mus bli presentert. I denne metoden, vil daglig injeksjon av 17β-østradiol (E2) indusere proliferasjon av celler endometrial, noe som resulterer i et økt utbytte av homogent og pure celle populasjoner. Videre tillater bruk av et system coculturing studiet av epitel-stromal krysstale og evne til å manipulere prosessen med decidualization på ulike nivåer.
Decidualization er progesteron-avhengige differensiering av endometrial stromal celler til runde som utskiller uterusslimhinneceller. I human, forekommer denne fremgangsmåte spontant i lutealfasen av menstruasjonssyklusen og startes i stromale celler som omgir de vaskulære celler til å danne predecidua. Men i gnagere, er tilstedeværelsen av en blastocyst er viktig å indusere decidualization. Det faktum at decidualization oppstår bare etter kontakt med endometrial epitelceller innebærer at viktige faktorer er utskilt av epitelcellene å indusere decidualization i den underliggende stroma. Selv om denne forskjellen i initieringen av den decidualization prosessen bør bli anerkjent det faktum at menneskelige decidualization blir mer robust ved embryoimplantasjonen tyder på at lignende mekanismer kan være involvert. In vitro cellekulturer blir ofte brukt for å studere effekten av spesifikke molekyler under prosessen med decidualization.Likevel er tilgjengelighet og mengden av menneskelig vev som kan samles ofte begrenset og ledsaget av variasjoner, f.eks syklus fase, antall graviditeter og tilstedeværelse av gynekologiske sykdommer som endometriose eller adenomyosis. Mange av disse problemer kan forebygges ved anvendelse av muse-vev som er lett tilgjengelig og syklusen fase uavhengig. En annen sterk fordel med å bruke mus vev er muligheten til å bruke genmodifiserte gnagere og muligheten for å sette opp et stort antall forsøk. I øyeblikket, har mange forskjellige isoleringsmetoder er beskrevet i litteraturen med høy variabilitet i en alder av dyrene, og den periode i estrus fase ved tidspunktet for bruk.
Denne studien viser en ny metode for primær endometrial ko-kulturer av stromale og epiteliale celler i hvilke fordel ble tatt fra et standardisert brunst ved en daglig injeksjon av østrogen forutgående isolering. Videre er østrogen known å indusere spredning i epitelceller og stromale celler som ytterligere øker utbyttet per isolasjon. Isoleringen protokoll beskrevet i dette papiret var basert på Grant et al. 7 har imidlertid flere optimaliseringstrinn ble inkludert for å øke utbyttet, renhet, og levedyktigheten til de forskjellige cellekulturer. Først HBSS ble alltid supplert med antibiotika for å unngå forurensning av den primære kultur. Under isolering av MEEC, ble en temperatur tilpasning gjort (15 minutter ved 37 ° C) for å øke uttaket av epitelceller i løpet av den første fordøyelsen. Deretter en ytterligere trinn ble inkludert for å dempe enzymatisk aktivitet etter trypsin-spaltning ved tilsetning av medium inneholdende FBS for å inhibere dets aktivitet. Videre MEECs ble ført gjennom et filter hvor mesh var større enn det som vanligvis er beskrevet (100 um) som de ofte kommer i grupper og celle ark. Videre forurensning av stromale celler ble redusert ved å utføre en tilleggsitional trinn der MEECs og MESCs ble separert basert på gravitasjon sedimentering. Til slutt, MEECs ble sådd på kollagen-belagte dekkglass for å øke bindingen av celler til dekkglass, slik det ble klart at festing til ubelagte eller PLL-belagte dekkglass var utilstrekkelig. Under isolering av MESCs, ble kollagenase (1 mg / ml) tilsatt for å forbedre fordøyelsen. Videre ble denne digereringstrinnet utført i duplikat for å unngå forurensning av gjenværende MEECs. Alle disse trinnene resulterte i rene og levedyktige kulturer av homogene cellepopulasjoner.
Renheten av cellepopulasjonen ble evaluert med farging og QRT-PCR ved vimentin som en markør og stromal cytokeratin som en epitelial markør. Åpenbart ble en motsatt uttrykk mønster av vimentin og cytokeratin observert i MEEC og Mesc. Imidlertid kan det bli lagt merke til at den relative mRNA-ekspresjon av vimentin og cytokeratin er lik i MEEC kulturer. similar resultatene er publisert av andre forskningsgrupper, der epitelceller i kultur erverve vimentin uttrykk ni. Mer viktig er forskjellen på protein uttrykk mellom vimentin og cytokeratin som ble observert i immunohistologiske stainings av de ulike cellepopulasjoner. Dobbelt farging viste at EECS var positive for cytokeratin og ESC var positive for vimentin. Bruken av disse markørene i immunfarging er en etablert metode og standardly brukt for å indikere de celletyper 10.
Selv om en rekke undersøkelser er blitt utført på decidualization av Mesc, er det fortsatt mulig at tilstedeværelsen av epitel-celler i denne modellen kan endre resultatene av decidualization. For det første har det vist seg at hvis MEEC vokse til et monolag i nærvær av Mesc-kondisjonert medium eller i et ko-kultur omgivelser, har en forbedret monolaget epitelcelle transepitelial elektrisk motstand (Teer), som følge av faktorer som utskilles av Mesc 7. Videre Pierro et al. 11 gitt bevis for at epitelproliferasjon, påvirket av 17β-østradiol, kan være mediert av faktorer utskilt fra stromale celler, og alternativt kan epitelceller frigi faktorer som modulerer stromal decidualization 12, 13. Samlet sett er det klart at epitel-stromal co-kultur miljø gir en mer fysiologisk situasjon som gjør det mulig for parakrint samhandling og kommunikasjon. Fremgangsmåten for dyrking av to ulike celletyper ved hjelp av et innsats ko-kultursystem ble beskrevet tidligere i 14, 15 og er tilpasset for bruk av murine primære celler. Ved påvisning av prolaktin mRNA nivåer som en lese-out for decidualization har beskrevet teknikken en svært reproduserbar avlesing for decidualization tilgjengelig og tillates derved studiet av epitel-stromal forhold under decidualization. Parakrine signaler mediert fra MEEC kan forandre graden av decidualization i de stromale celler. Videre tillater den modell for spesifikke modulering av epiteliale side uten direkte å påvirke de stromale celler. Derfor denne co-kultur MEEC og Mesc tilbyr et perfekt verktøy for å evaluere effekten av hormoner, cytokiner, etc. på epitelceller med lese-out på stromal decidualization. En annen fordel med denne ko-kultursystem er at det gjør det mulig for forskere å undersøke involveringen av et spesifikt protein i decidualization-prosess i enten epitelisk eller stromal rommet ved hjelp av celler isolert fra transgene dyr. Videre vil denne teknikken være svært nyttig for å undersøke blastocyst adhesjon for å vurdere hvorvidt parakrine faktorer utskilt av epitel-celler i nærvær av en blastocyst er tilstrekkelig til å indusere decidualization av den underliggende stromalceller. Et viktig skritt i trophoblast invasjon korrelert til ekstracellulære matrise nedbrytning, som er mediert av handlingen av proteolytiske enzymer. Den foreslåtte teknikk kan anvendes som en in vitro modell for å undersøke den krysstale mellom blastocyst, epitelcellene og støtter stroma.
Men i øyeblikket er lite kjent om opprinnelsen av epitelceller som kan være så vel luminal som kjertel. Derfor er ytterligere karakterisering av den genetiske og molekylære profil av epitelcellene nødvendig. I tillegg er det beskrevet fremgangsmåten begrenset i tilgjengelig kunnskap om polarisasjonen av epitelcellene. For øyeblikket, ble polarisasjonen av epitelceller ikke tatt hensyn til. Imidlertid forskjeller i ekspresjon av membranproteiner er beskrevet i apikale og basalmembraner. Upassende polarisering av epitel lag kan ha en innvirkning på parakrint samspillet mellom epithelial og stromale celler. Imidlertid, fremgangsmåter for å oppnå polariserte epitelceller er blitt beskrevet, og kan være inkludert i den beskrevne teknikk 15, 16.
Samlet foreslår beskrevet protokollen en teknikk for å kunne etablere primære cellekulturer av mus livmor epitel og stromale celler. Denne teknikken resulterer i rene cellekulturer som bekreftes av QRT-PCR og farging av vimentin og cytokeratin. Til slutt, ble en epitelisk og stromal ko-kultur innføres som gjør det mulig for undersøkelse av parakrine signaler mediert ved enten MEEC og / eller Mesc i decidualization prosessen.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Research Foundation-Flandern (FWO G.0856.13N) og Forskningsrådet av KU Leuven (OT / 13/113). KDC er finansiert av FWO Belgia. AH er finansiert av OT / 13/113. Vi vil gjerne takke Cell Imaging Core innretningen av KU Leuven (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) for bruk av konfokal mikroskop.
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant | Greiner Bio-one | 662610 | Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore. https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/0110_0110_0090_0030/13408/ |
Nunc Cell culture treated 24 well plates | Thermo Scientific | 142475 | http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475 |
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt | Sigma Aldrich | B7880 | Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en®ion=BE |
Medroxyprogesterone 17-acetate | Sigma Aldrich | M1629 | Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en®ion=BE |
Arachis oil | Supermarket | Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used |
|
PrestoBlue cell viability reagent | Thermo Scientific | A13261 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1 |
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red | Gibco | 14175-046 | Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 |
17-β Estradiol | Sigma Aldrich | E8875 | Prepare a stock solution of 1mg/ml in EtOH before diluting in arachis oil (1:1000). http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en®ion=BE |
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized | Merck Millipore | SCGPU05RE | http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE |
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) | Gibco | 15070-063 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063 |
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES | Gibco | 11330-032 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057 |
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin | Gibco | 10500-056 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064 |
Amphotericin B | Gibco | 15290-018 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018 |
Gentamicin (50mg/ml) | Gibco | 15750-037 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037 |
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red | Sigma Aldrich | D5921 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en®ion=BE |
MCDB-105 | Sigma Aldrich | M6395 | Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en®ion=BE |
Insulin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | I1882 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en®ion=BE |
Coverslips, glass, 18 mm Ø | Glaswarenfabrik Karl Hecht | 1001/18 | http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937&tx_rmproducts_pi1[p]=3504&tx_rmproducts_pi1[v]=20088&cHash=abd12065683fe74b00eaa5e562824d06 |
Poly-L-lysine | Sigma Aldrich | P2636 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en®ion=BE |
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum | Sigma Aldrich | C2674 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en®ion=BE |
DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-094 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094 |
Trypsin from bovine pancreas | Sigma Aldrich | T7409 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en®ion=BE |
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red | Gibco | 25300-054 | Warm to room temperature before use. https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 |
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352340 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable | BD Falcon | 352360 | https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680 |
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized | Merck Millipore | SLGP033RS | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1 |
Acetic acid (glacial) 100% | Merck Millipore | 1.00063 | https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063 |
Collagen I | Corning | 354236 | From rat tail. https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&productid=354236%28Lifesciences%29# |
Pancreatin from porcine pancreas | Sigma Aldrich | P3292 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en®ion=BE |
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile | BD Falcon | 353001 | https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630 |
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent | VWR Chemicals | 20821296 | https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP |
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3) | Cell Signalling Tech | #5741 | use 1/500. http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741 |
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin | Sigma Aldrich | C2562 | use 1/1000. http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en®ion=BE |
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS | Affymetrix | 19943 | http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1 |
Triton X-100 | Sigma Aldrich | X100 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en®ion=BE&gclid=Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIwBEiQAI8rq879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k8P8HAQ |
Goat serum | Sigma Aldrich | G9023 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en®ion=BE |
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 | Thermo Scientific | A-11034 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=488#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Oryctolagus%20cuniculus%22$;;conjugates:^%22Alexa%20Fluor®%20488%22$;; |
Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 | Thermo Scientific | A-11032 | http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&resultPage=1&resultsPerPage=15&autocomplete=&priorSearchTerms=&searchMode=keyword&productTypeSelect=antibody&targetTypeSelect=antibody_secondary&species=ltechall&keyword=594#filters=genericsort2:%22Capra%20hircus%22;;generic6:^%22Mus%20musculus%22$;; |
VECTASHIELD mounting medium with DAPI | Vector Laboratories | H-1200 | http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html |
DPBS, with calcium and magnesium | Gibco | 14040174 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133 |