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Developmental Biology

Aislamiento de ratón endometrial epiteliales y células del estroma de Published: March 2, 2017 doi: 10.3791/55168
Automatic Translation
*1, *1, 1
1Department of Development and Regeneration, Katholieke Universiteit Leuven (KU Leuven)
* These authors contributed equally

Summary

Este estudio presenta un método estandarizado y validado para el aislamiento y cultivo de ratón primario del estroma endometrial y células epiteliales, que se puede utilizar en un sistema de cocultivo para estudiar en decidualization vitro.

Abstract

Decidualization es un proceso de diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial y es un requisito previo para el éxito de la implantación del embrión. Aunque se han hecho muchos esfuerzos para revelar los mecanismos subyacentes de decidualization, la señalización exacta entre las células epiteliales que están en contacto con el embrión y las células del estroma subyacente sigue siendo poco conocida. Por lo tanto, el estudio de decidualization de una manera que toma tanto el epitelio y las células del estroma en cuenta podría mejorar nuestro conocimiento sobre los detalles moleculares de decidualization. Para este propósito, en modelos in vivo de decidualization artificial son fisiológicamente más relevantes; Sin embargo, la manipulación de la comunicación intercelular es limitado. Actualmente, en cultivos in vitro de células del estroma endometrial se utilizan para investigar la modulación de decidualization por varias moléculas de señalización. Convencionalmente, las células estromales humanas o de ratón endometriales sonusado. Sin embargo, la disponibilidad de muestras humanas se limita, con frecuencia. Además, el uso de tejidos murinos se acompaña con variedad en el método de cultivo. Este estudio presenta un método validado y estandarizado para obtener pura de la célula epitelial endometrial (CEE) y las culturas del estroma celular (CES) que utilizan ratones intactos adultos tratados con estrógenos durante tres días consecutivos. El protocolo se ha optimizado para mejorar el rendimiento, la viabilidad y la pureza de las células y se amplió con el fin de estudiar decidualization en un cocultivo de CEE y ESC. Este modelo puede ser adecuado para explotar la importancia de ambos tipos de células en decidualization y evaluar la contribución de las moléculas de señalización importantes secretadas por la CEE o ESC durante la comunicación intercelular.

Introduction

El endometrio humano es el revestimiento interno del útero y se somete a ciclos mensuales de descomposición y la reparación como una preparación para posibles embarazos. Se compone de una sola capa de células epiteliales que recubren el lumen uterino y el estroma subyacente que varía de espesor de acuerdo con las fluctuaciones de las hormonas ováricas estrógenos y progesterona. Durante la fase luteal, el aumento de la progesterona posovulatorio inducirá la diferenciación de las células del estroma endometrial a las células deciduales más grandes, redondas, un proceso llamado decidualization 1, 2. En humanos, este fenómeno se produce de forma espontánea para formar el predecidua, pero se hace más pronunciada después de la implantación del embrión. A consecuencia funcional de decidualization es que el útero se vuelve transitoriamente receptivo a la implantación del embrión. Este intervalo se denomina como la "ventana de implantación". Durante el período inicial de la implantación del embrión, el correo decidualizedlas células del estroma que rodean ndometrial el embrión implante proporcionarán una barrera para impedir el paso de sustancias perjudiciales para el embrión 3. Durante el embarazo, este decidua proporcionará nutrientes para el desarrollo del feto antes de placentación ha tenido lugar, y más tarde formará la parte materna de la placenta 4.

Consideraciones éticas y prácticas limitan el diseño de los estudios en humanos para investigar el proceso de decidualization y han impulsado el uso de modelos animales. Al ser un miembro del grupo de placentación hemochorial, el endometrio de roedores también va a sufrir decidualization antes de la placentación 5. En los roedores, sin embargo, el inicio del proceso de decidualization depende de la presencia de los blastocistos en el lumen uterino, lo que indica que un estímulo extra es necesario para activar las respuestas deciduales 6. Esto implica una compleja comunicación entre THe células endometriales epiteliales que tienen contacto directo con el blastocisto y las células del estroma subyacente. Sin embargo, decidualization puede inducirse artificialmente mediante estímulos como el rascado mecánico o la instilación de aceite en un útero preparado hormonal. Aunque los estudios in vivo utilizando modelos artificiales decidualization nos han permitido mejorar nuestros conocimientos en el proceso complejo de señalización de decidualization, mecanicistas estudios en profundidad, por ejemplo, la investigación de la comunicación indispensable entre las células epiteliales y del estroma, son limitadas. Por lo tanto, en estudios in vitro decidualization se pueden utilizar para manipular vías importantes y estudiar los procesos fundamentales. Con este fin, los cultivos de células estromales endometriales primarios se pueden configurar de endometrio humano o de roedores. El empleo de los roedores consiente el uso de animales modificados genéticamente para investigar el papel de una proteína específica de interés durante el proceso de decidualization. Sin embargo, no maduro, prepúberratones ty se utilizan a menudo con el fin de evitar complicaciones del ciclo estral, mientras que en otros casos úteros se recogen de todas las fases del ciclo estral, lo que resulta en una heterogeneidad en los cultivos. Además, el proceso de decidualization se ha estudiado en diferentes protocolos, por ejemplo, por (i) las hormonas que complementa (estrógeno, progesterona o monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)) al medio de cultivo, o por (ii) el aislamiento de las células deciduales de los ratones en día 4,5 de la gestación (pseudo), que exigen la necesidad adicional para la comprobación de enchufe y machos vasectomizados. Estas limitaciones demuestran la necesidad de un método estandarizado para estudiar en decidualization vitro. En este estudio, un modelo fisiológico para examinar decidualization in vitro a partir de adulto, se presentarán (pseudo) ratones no embarazadas. En este método, la inyección diaria de 17β-estradiol (E2) se induce la proliferación de las células del endometrio, dando como resultado un aumento del rendimiento de homogénea y ppoblaciones de células ure. Además, el uso de un sistema de cocultivo permite el estudio de la diafonía epitelial-estromal y la capacidad de manipular el proceso de decidualization en diferentes niveles.

Protocol

AlexaFluor

Todos los experimentos con animales para este estudio fueron aprobados por el comité de ética de la Universidad Católica de Lovaina (Bélgica) (Proyecto P174 / 2013). Los ratones se alojaron en condiciones estándar, con acceso ad libitum a bolitas de comida y agua del grifo, y se mantuvieron en condiciones controladas (23 ± 1,5 ° C, humedad relativa 40 - 60%, 12/12 ciclo de luz / oscuridad).

1. Los ratones

  1. Utilizar como cepa de ratón comercialmente disponible (es decir, C57BL / 6, hembra 8 - 12 semanas de edad). Típicamente, 4 - 5 ratones producirán una cantidad adecuada de células para experimentos adicionales.
  2. Inyectar ratones intactos por vía subcutánea con 100 l de la 17β-estradiol (E2) solución (100 ng / 100 l) para 3 consecutivo d antes de la aislamiento con el fin de estandarizar la fase del ciclo estral de los animales y para inducir la proliferación de endometrio Células. La necesidad para el control de la fase del ciclo de los ratones antes de iniciar el protocolo es ser evitablecausa de la 3 d 'tratamiento con estradiol.

2. Preparativos

  1. Hacer una solución de 100 ng / 100 l E2 en aceite de cacahuete. Para las inyecciones de cinco ratones (como se describe en 1.2), se necesita una cantidad de 1,5 ml.
    1. Disolver 1 mg E2 en 1 ml de etanol para tener una solución madre de 1 mg / mL.
    2. Diluir esta solución madre 1: 1.000 en aceite de cacahuete.
  2. Hacer 500 ml de solución salina equilibrada de Hank (HBBS) 1x complementado con 100 U / ml de penicilina y 100 mg / ml de estreptomicina (en lo sucesivo como HBSS +).
  3. Hacer 500 ml de filtrado de células de ratón endometrial del estroma (MESC) de medio a MESC cultura: de Eagle modificado por Dulbecco / Mezcla Nutriente F12 (DMEM / F12) con rojo fenol, L-glutamina y ácido 4- (2-hidroxietil) piperazina-1-etanosulfónico ácido, N - (2-hidroxietil) piperazina N '- (ácido 2-etanosulfónico) (HEPES), que contiene 10% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, y 100 mg / ml de gentamicina (further refiere como medio MESC).
  4. Hacer 500 ml de filtrado medio MESC 2% a la cultura MESC durante decidualization: DMEM / F12 con rojo fenol, L-glutamina y HEPES que contiene 2% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, y 100 mg / ml de gentamicina.
  5. Preparar 500 ml de filtrado de células de ratón Endometrial epitelial (MEEC) medio: DMEM que contiene 10% de FBS, 0,5 mg / ml de anfotericina B, 100 mg / ml de gentamicina, 25% MCDB-105 medio, y 5 mg / ml de insulina (en lo más a como medio MEEC).
  6. Preparar cubreobjetos de poli-L-lisina (PLL) recubiertos para la cultura MESC.
    1. Disolver 25 mg de PLL en 250 ml de agua destilada. Filtrar la solución usando un filtro de 0,22 micras.
    2. Añadir cubreobjetos estériles en una placa de 12 pocillos. Añadir 300 l de PLL disuelto en los cubreobjetos.
    3. Retire la solución después de 30 min de incubación. Las placas se pueden almacenar a 4 ° C hasta su uso posterior (hasta 1 - 2 meses).
  7. Preparar a 10 mg / ml solución madre of colagenasa de tipo IA y almacenar alícuotas de 300 l a -20 ° C. Filtro antes de su uso.

3. Los preparativos necesarios antes de las 24 h Aislamiento

  1. Preparar cubreobjetos recubiertos de colágeno para la cultura MEEC.
    1. Preparar una solución de ácido acético 0,02 M en agua destilada (1 ml por cubreobjetos).
    2. Añadir 150 ml de colágeno en 12 ml de ácido acético 0,02 M para obtener una concentración final de 50 mg / ml.
    3. Añadir cubreobjetos estériles en una placa de 12 pocillos.
    4. Añadir 1 ml de la solución de colágeno (véase 3.1.2).
    5. Incubar O / N (mínimo 12 h) a 37 ° C.
      Durante el aislamiento:
    6. Eliminar la solución de colágeno de los cubreobjetos por succión y se deja secar al aire en un ambiente estéril (en la cabina de flujo laminar).
    7. Lavar los cubreobjetos dos veces con solución salina tamponada con fosfato (PBS).
  2. Preparar una solución de pancreatina 2,5% mediante la adición de 0,25 g de pancreatina en un tubo de 15 ml que contenía canónica 10 ml deHBSS +. Agitar (200 rpm) de la solución a 37 ° C durante 1 h para aumentar la solubilidad. Almacenar a 4 ° C.

4. Aislamiento y cultivo de células epiteliales del endometrio de ratón (MEEC) y ratón endometrial células estromales (MESC)

  1. Se añaden 25 mg de tripsina en un tubo de 15 ml que contenía solución de pancreatina 2,5% (véase el punto 3.2) para terminar con una solución final que contenía 0,25% de tripsina (en lo sucesivo como MESC combinación de la digestión).
  2. Aislamiento de úteros
    1. Compruebe la fase del ciclo de los animales con un examen de frotis vaginal.
      1. Sujeción del animal y lavar la vagina con cuidado con 50 l de PBS 3 - 5 veces.
      2. Recoger el ras final sobre un portaobjetos de vidrio.
      3. Examinar el material bajo un microscopio de campo claro utilizando un objetivo 10X o 20X.
      4. Utilice sólo los ratones que son en la fase de estro. Esta etapa se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (Figura 1
    2. La eutanasia a los animales utilizando un método apropiado, como dislocación cervical o CO 2 narcosis inducida.
    3. Pulverizar los canales con 70% de etanol con el fin de generar un ambiente estéril.
    4. El uso de instrumentos quirúrgicos estériles, abrir el abdomen y los intestinos empujar a un lado para visualizar ambos cuernos uterinos.
    5. Coge el cuerno uterino en el extremo más distal bajo la trompa de Falopio. Diseccionar los cuernos uterinos de la trompa de Falopio y eliminar el tejido adiposo y conectivo. Cortar el cuerno en el extremo distal por encima del cuerpo del útero y colocarlo en una placa de Petri de 35 mm con 3 ml de HBSS +.
      1. Repita este paso para el otro cuerno y para los demás animales hasta que se recogen todos los cuernos uterinos.
    6. Limpiar el cuerno uterino (en HBSS +) adicionalmente bajo un estereoscopio y eliminar todo adiposo residual o tejido conectivo.
    7. Cortar los cuernos uterinos abiertos longitudinalmente para exponer el lumen uterino y reemplazar THe cuerno en una nueva placa de Petri con HBSS + fresca.
    8. Transferir todos los cuernos uterinos en el tubo de 15 ml que contiene pancreatina y tripsina.
    9. Incubar horizontalmente durante 60 minutos a 4 ° C en un agitador orbital (50 rpm).
    10. Incubar en posición horizontal durante 45 minutos a 23 ° C (temperatura ambiente), sin agitación.
    11. Incubar en posición horizontal durante 15 minutos a 37 ° C (baño de agua), sin agitación.
    12. Mientras tanto hacer la mezcla de digestión MESC disolviendo 300 l de la 1 mg / ml de colagenasa de valores en 2,7 ml de solución 0,05% de ácido Tripsina-etilendiaminotetraacético (EDTA).
      NOTA: A partir de ahora, más etapas de aislamiento se llevan a cabo en un ambiente estéril bajo una campana de flujo laminar.
  3. Ratón de células epiteliales del endometrio (MEEC) Cultura
    1. Después de 2 h de incubación, se vierte con cuidado la solución sobrenadante.
    2. Transferir los úteros en una placa de Petri que contiene medio de MEEC frío y se incuba durante 5 min para inactivar la tripsinaactividad.
    3. Transferir los úteros a un tubo de 15 ml que contiene 3 ml de HBSS frío +.
    4. Vortex durante 10 s para liberar las láminas epiteliales.
    5. Enjuague los úteros en una placa de Petri limpia con 3 ml de HBSS +.
    6. Repita el paso 4.3.2 - 4.3.4 para obtener un total de tres suspensiones que contienen láminas epiteliales.
    7. Transferir los úteros a la mezcla de digestión MESC e incubar durante 30 minutos a 37 ° C con agitación (200 rpm) (vaya al paso 4.4 para un mayor aislamiento de MESC).
    8. Recuperar las láminas epiteliales pipeteando las tres suspensiones de células suavemente en una malla de nylon 100 micras con el fin de eliminar los restos de tejido.
    9. Centrifugar la suspensión celular recogida a 500 xg durante 5 min.
    10. Resuspender el precipitado en 12 ml de medio MEEC y mezclar bien.
    11. Settle la solución durante 5 min con el fin de separar MESC restante mediante sedimentación por gravedad.
    12. Retire cuidadosamente los 2 ml superiores mediante el uso de una pipeta de 5 ml.
    13. Centrifugar la suspensio celularn a 500 xg durante 5 min.
    14. Volver a suspender en medio MEEC pipeteando suavemente hacia arriba y hacia abajo.
    15. Placa de las células en cubreobjetos recubiertos de colágeno en la densidad deseada para experimentos adicionales (Figura 2A).
    16. Se incuban las células a 37 ° C en un incubador de CO2 al 5% durante un mínimo de 12 h.
      NOTA: Para la inmunotinción o experimentos funcionales como imágenes de calcio fluorescente, se aconseja la placa de las células directamente sobre el cubreobjetos, mientras que la siembra en una placa de 6 pocillos se recomienda cuando se desea el aislamiento de ARN o proteína. Aislamiento de células del estroma endometrial ratón se divide en dos rondas como la pureza de las células después de sólo una digestión puede ser insuficiente. Los úteros se digieren dos veces para una recuperación óptima de la célula y la pureza. En las dos vueltas de las intervenciones técnicas son idénticas. Las células recogidas de ambas rondas se pueden mantener para experimentos adicionales, según lo deseado por el investigador.
  4. Ratón endometrial StrCell omal (MESC) Cultura: 1ª Ronda
    1. Antes del inicio de la primera ronda de la digestión, preparar una segunda mezcla de digestión mediante la disolución de 300 l de 1 mg / ml de colagenasa de valores de 2,7 solución de tripsina-EDTA ml 0,05%. Se necesita esta mezcla en el paso 4.4.8.
    2. Preparar tres pequeñas placas de Petri de frío (4 ° C) HBSS + y 3 x 15 ml tubos con 3 ml de medio MESC (X1 tubo, X2 y X3).
    3. Después de 30 minutos de incubación, agite la solución que contiene tripsina-úteros suavemente durante 10 s. células MESC se separará del tejido uterino y permanecerán en la solución de tripsina.
    4. Transferir los úteros a la primera placa de Petri que contiene 3 ml de frío (4 ° C) HBSS + y enjuagar muy bien.
    5. Añadir 3 ml de medio MESC al tubo que contiene originalmente los cuernos uterinos (tubo en el paso 4.4.3) para inhibir la actividad de la tripsina.
    6. Transferir los úteros de la placa de Petri con el frío (4 ° C) HBSS + para X1 tubo que contiene 3 ml de medio MESC y agitar suavemente durante 10 s. Repetir los pasos 4.4.4 (transferencia a una placa de Petri de frío (4 ° C) HBSS +) y 4.4.6 (transferencia a X2 y X3 tubo) dos veces.
      NOTA: Por último, este protocolo se traducirá en 4 suspensiones de células: un tubo que contiene la solución de tripsina y 3 tubos con medio que contiene MESC MESC (tubos de X1, X2 y X3).
    7. Transferencia úteros en la nueva digestión MESC, como se describe en el paso 4.4.1 y se incuba durante 30 min a 37 ° C, verticalmente.
    8. Recoger las células del estroma haciendo pasar las cuatro suspensiones de células a través de una malla de nylon 40 micras. Enjuague la malla con 5 ml adicionales de MESC.
    9. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 7 min.
    10. Resuspender el precipitado en MESC y la placa sobre cubreobjetos recubiertos de PLL para experimentos adicionales con la densidad deseada.
    11. Se incuba durante un mínimo de 4 - 6 h u O / N a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  5. Endometrial ratón del estroma celular (MESC) Cultura: 2ª Ronda <ol>
  6. Preparar tres pequeñas placas de Petri de frío (4 ° C) HBSS + y 3 x 15 ml tubos con 3 ml de medio MESC (Tubos Y1, Y2 e Y3).
  7. Repita los pasos 4.4.3 - 4.4.7.
  8. La transferencia de la última suspensión de células junto con los úteros a una malla de nylon 40 micras.
  9. Recoger las células del estroma haciendo pasar el contenido del tubo de Y1, Y2 y Y3 a través de la malla de nylon. Enjuague la malla con 5 ml adicionales de MESC.
  10. Centrifugar la suspensión de células a 500 xg durante 7 min.
  11. Resuspender el precipitado en medio MESC y la placa sobre cubreobjetos recubiertos de PLL para experimentos adicionales (Figura 2b).
  12. Incubar durante un mínimo de 4-6 horas a 37 ° C con 5% de CO 2.
    NOTA: Para la inmunotinción o experimentos funcionales como imágenes de calcio fluorescente, se aconseja a la placa las células sobre cubreobjetos, mientras que la siembra en una placa de 6 pocillos se recomienda cuando se desea el aislamiento de ARN o proteína.

5. La vimentina/ Citoqueratina doble tinción para la Validación de MEEC Pura y culturas MESC

  1. Sembrar las células en cubreobjetos.
  2. Lavar 3 x 5 min con PBS que contiene calcio y magnesio en un agitador orbital (50 rpm).
  3. Fijar las células con paraformaldehído al 4% (PFA) (¡CUIDADO!) Durante 10 minutos, no en la coctelera.
  4. Lavar 3 veces con PBS sin calcio y magnesio en un agitador (50 rpm).
  5. Permeabilizar las células con 0,2% Triton X-100 durante 10 minutos en un agitador (50 rpm).
  6. Lavar 3 veces con PBS en un agitador.
  7. Bloquear con 5% de suero de cabra (GS) en PBS durante 2 h en un agitador (50 rpm)
  8. Se incuban las células con el conejo monoclonal anti-vimentina humana (1: 500) y el ratón monoclonal pancytokeratin anti-humana (1: 1000) a 4 ° C en un agitador (50 rpm). Los anticuerpos se diluyeron en PBS con 0,5% GS.
  9. Lavar 3 veces con PBS en un agitador (50 rpm).
  10. Se incuban las células con anticuerpos secundarios (1: 1000 en 0,5% GS) Alexa Fluor 488 conjugado con IgG anti-conejo y Alexa Fluor 488-conjucerrada IgG anti-ratón en un agitador.
  11. Lavar 3 veces con PBS en un agitador.
  12. Monte los portaobjetos con medio de montaje acuoso que contiene DAPI y O seco / N.
  13. Sellar las diapositivas con esmalte de uñas y mantener el 4 ° C para su uso posterior (Figura 2a, b).

6. En Vitro decidualization en un Sistema de Coculture

NOTA: Se requieren cuatro a cinco animales para establecer un sistema de co-cultivo en una placa de 24 pocillos. Continuar con el siguiente protocolo en un ambiente estéril, preferiblemente en una cabina de flujo laminar.

  1. Preparar los insertos de cultivo celular durante las etapas de centrifugación y / o de incubación de el aislamiento de células epiteliales (como se describe en 4.3) en una placa de 24 pocillos adicional.
    1. Añadir 200 - 400 l de medio de MESC en la cantidad deseada de pocillos en la placa de 24 pocillos.
    2. Coloque los insertos en los precargadas de 24 pozos utilizando pinzas estériles.
  2. Resuspender el precipitado MEEC(Volumen de trabajo: 150 - 300 l por inserción) (paso 4.3.14) en medio MEEC y se dividen en los insertos. Cultivar las células a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  3. Sembrar las células del estroma en otra placa de 24 pocillos (compatible con los insertos de cultivo celular) después de la segunda ronda de aislamiento de células del estroma (paso 4.5.6). Utilizar un volumen de trabajo de 400 l de suspensión celular por pocillo.
  4. Permitir que las células estromales se unan para un mínimo de 4 - 6 horas a 37 ° C en una incubadora de CO2 al 5%.
  5. La transferencia de los insertos de cultivo celular cubiertos con las células epiteliales de la primera placa de 24 pocillos en la segunda placa de 24 pocillos cubierta por células estromales. El uso de fórceps esterilizados o tocar las inserciones sólo a sus pies colgando.
  6. Cultivar las células a 37 ° C en 5% de CO 2 incubadora durante un período de 3-5 d hasta que las células epiteliales formar una monocapa y las células estromales de alcanzar 80 - 90% de confluencia. Además, utilice la resistencia eléctrica transepitelial (TEER)para vigilar la monocapa epitelial mediante el uso de un metro epitelial Volt / Ohm como se describe por Grant et al. 7. Los valores de 800-1.000 / pocillo eran suficientes para considerar la monocapa confluente del epitelio.
  7. Si es necesario, sustituya el medio cada 2 - 3 d usando pipetas de vidrio o puntas de pipeta fina. Comienza con la sustitución del medio de las células del estroma (sembradas en la parte inferior), antes de reemplazar el medio en los insertos. Se recomienda el uso de medio de cultivo celular precalentado a 37 ° C.
  8. Preparar el medio decidualization para inducir en decidualization vitro antes de iniciar el experimento. Utilizar un volumen de trabajo de 400 l por pocillo de las células del estroma.
    1. Preparar las siguientes soluciones madre y almacenar alícuotas a -20 ° C.
      1. Preparar 250 mM de medroxiprogesterona 17-acetato (MPA) en etanol.
      2. Preparar mM solución madre 100 8-Bromoadenosine 3 ', 5'-AMPc en agua ultrapura.
    2. Hacer el medio decidual contener MPA 1 M y cAMP 0,5 mM en medio MESC que contiene 2% de SFB.
  9. Retire con cuidado el medio de los pocillos y añadir el medio decidual en las células del estroma. Si se necesita una condición de control, utilice el medio MESC que contiene 2% de FBS.
  10. Retire el medio de los insertos de cultivo celular y añadir 300 l de medio MEEC sobre las células.
  11. Se incuban las células durante 5 d en una incubadora a 37 ° C en 5% de CO 2.
  12. Después del quinto día, evaluar el alcance de decidualization en las células del estroma por RT-qPCR (véase más adelante).
  13. Validar la viabilidad de las células epiteliales utilizando el reactivo de viabilidad basado en resazurina.
    1. Preparar una solución 01:10 de reactivo de la viabilidad en medio MEEC.
    2. La transferencia de los insertos de cultivo celular en una nueva placa de 24 pocillos.
    3. Añadir 150 - 300 l de reactivo de viabilidad - solución MEEC sobre las células.
    4. Incubar a 37 ° C en 5% de CO 2 durante por lomenos 4 - 5 h o durante la noche y evaluar la viabilidad celular mediante la observación de un cambio de color (azul y el violeta / rosa).
      NOTA: decidualization también se puede evaluar usando un ELISA de ratón prolactina-específico, como preferido por el investigador.

7.Validation de decidualization de QRT-PCR

NOTA: Para la validación de la decidualization de QRT-PCR, se recomienda llevar a cabo todas las pruebas en condiciones duplicado con el fin de recibir una cantidad suficiente de células para el análisis de ARN.
RT-PCR cuantitativa se realizó como se describió anteriormente en De Clercq et al. 8.
En breve:

  1. Aislar el ARN total usando un kit de aislamiento de ARN comercial.
    1. Evaluar la cantidad y la calidad del ARN usando métodos comerciales de acuerdo con el protocolo del fabricante, respectivamente.
  2. Sintetizar ADNc, según el protocolo del fabricante a partir de 1 g de ARN total.
  3. Utilice un kit comercial de acuerdo con el protocolo del fabricante para llevar a cabo la reacción de QRT-PCR.
    1. Ejecutar todas las muestras por triplicado.
    2. Hacer uso de la comercial TaqMan Master Mix y sondas TaqMan específicas para los genes de limpieza deseados y prolactina (prl8a2) para llevar a cabo la reacción.

Representative Results

Descripción general de Protocolo

La figura 1A ilustra una visión general del protocolo. Una inyección diaria de E2 (100 ng) durante tres días consecutivos se utiliza para sincronizar los animales y estandarizar la fase del ciclo estral. El ciclo estral se puede evaluar mediante lavados vaginales y se divide en el proestro, estro, diestro, y la fase metaestro. La fase del ciclo puede ser designado de acuerdo con la proporción de células descamadas en el lavado, que están sometidos a cambios hormonales. El aumento de los niveles de estrógeno hará que los animales evolucionan a la fase de estro. Esta fase puede ser fácilmente detectado por la presencia de células epiteliales cornificadas exclusivamente y la ausencia de leucocitos (Figura 1B). El día 4, úteros de los animales que se encuentran en fase de estro se recogen y MEEC y MESC están aislados (Figura 1C). c decidualizationun ser inducida mediante la adición de AMPc 0,5 mM y 1 M MPA al medio FBS 2% durante un período de incubación de 5 d.

Control de calidad de MEEC y MESC culturas

La pureza de los cultivos de células primarias se puede evaluar por la diferencia de vimentina y citoqueratina expresión. La vimentina es un filamento intermedio que se expresa en las células mesenquimales, por lo tanto, en las células del estroma endometrial. La citoqueratina es un filamento intermedio que se encuentra en el citoesqueleto de tejido epitelial. La figura 2A muestra el nivel de expresión de ARNm de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC evaluó mediante QRT-PCR. vimentina niveles son altos en MESC y baja en MEEC (2,2 veces más alta, p <0,001), mientras que los niveles de citoqueratina son altos en MEEC y baja en MESC (36x más alta, p <0,001). Un vimentina / doble tinción de citoqueratina se realizó e indicó que las células estromales expresan vimentina, mientras que Epitcélulas helial expresan citoqueratina (Figura 2B, C). La ausencia de anticuerpo primario se utilizó como control negativo para la inmunotinción (Figura 2D, E). Estos inmunohistoquímico coloraciones muestran que tanto los cultivos de células de endometrio (MEEC y MESC) tienen una pureza de hasta el 90%.

Decidualization en MEEC / cocultivos MESC

Después del aislamiento, las células endometriales estromales de ratón y se sembraron en un sistema de co-cultivo para imitar el entorno de endometrio. Las células se cultivaron hasta que las células epiteliales forman una monocapa en el inserto de cultivo celular (valores de TEER de 800 - 1.000 / pocillo), y las células del estroma llegado a un estado sub-confluente. Decidualization se indujo en las células del estroma con la aplicación de cAMP 0,5 mM y 1 M MPA. Después de cinco días de incubación, los niveles de mRNA de prolactina se evaluaron en las células del estroma de QRT-PCR como una indicación para DECIDualization (Figura 3A). Los niveles de prolactina fueron altamente expresado en células sometidas a las hormonas y no detectables en las células incubadas con el medio de control (p <0,01).

Dado que las células epiteliales son difíciles de visualizar el interior de los insertos de cultivo celular, un ensayo de viabilidad se realizó inmediatamente después del período de incubación de cinco días (Figura 3B). Se añadió una mezcla de medio de crecimiento normal y un reactivo de viabilidad a los pocillos y se incubó durante un período de un mínimo de 8 a 12 h. El cambio de color de azul a rosa brillante indicó la presencia de células epiteliales viables. Tenga en cuenta que el cambio de color sólo se producirá cuando las células viables están presentes.

Figura 1
Figura 1: Descripción General del Protocolo. (A) Esquema de la protocolo de aislamiento a partir de tresdías consecutivos de inyecciones de estrógeno. El día 3, los preparativos necesarios deben estar preparados. En el día 4, se evalúa fase de estro (indicado por la estrella) mediante la realización de un lavado vaginal. MESC y MEEC se aísla a través de diferentes fases de digestión. En el día 6, o cuando las células son confluentes, decidualization puede ser inducida en el sistema de co-cultivo mediante la adición de cAMP y MPA para el medio y un periodo de incubación de cinco días (días 6-11). (B) imagen representativa de la fase de estro se caracteriza por la presencia de células epiteliales cornificadas en el lavado vaginal (magnificación 10X). (C) imagen representativa de MESC y MEEC (ampliación 20X, barra de escala: 100 micras). Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Figura 2
(A) los niveles de ARN mensajero de vimentina y citoqueratina expresión para indicar la pureza de los cultivos. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza ACTB y TBP. Los datos se muestran como la media ± SEM. Vimentina / doble tinción de citoqueratina en cultivos de MESC (B) y culturas MEEC (C). Insertar de la izquierda muestra una vista magnificación 63X. Control negativo con el anticuerpo primario omitido para MESC (D) y MEEC (E) (barra de escala: 50 micras). ***: P <0,001 con ANOVA de dos vías con la corrección de Bonferroni para múltiples pruebas. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.


Figura 3: Validación de decidualization a través de RT-PCR. Niveles (A) mRNA expresión de prolactina en las células del estroma para evaluar decidualization. los niveles de ARN se cuantificaron relativamente a la media geométrica de los genes de limpieza PGK1 y TBP. El factor de cambio en las células cultivadas en el control o medio decidual se muestra como media ± SEM. (B) imágenes ilustrativas de las células del estroma antes (arriba) y después (abajo) de estímulo decidualization. El inserto de la derecha ilustra una ampliación de una célula estromal decidualized. Decidualization se caracteriza por la presencia de células multinucleadas, indicado por flechas negras. (C) Imágenes representativas de la evaluación de la viabilidad de las células epiteliales en el inserto después del ensayo. Fotos fueron tomadas inmediatamente después de la administración del reactivo de viabilidad (Prestoblue) (0 h) y el fespués de la mañana (ON). **: P <0,01 con la prueba de Mann-Whitney. ON: durante la noche. Barra de escala: 100 micras. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.

Discussion

Decidualization es la diferenciación de progesterona dependiente de las células del estroma endometrial a las células deciduales ronda secretoras. En humanos, este proceso se produce de forma espontánea durante la fase lútea del ciclo menstrual y se inicia en las células del estroma que rodean a las células vasculares para formar el predecidua. Sin embargo, en los roedores, la presencia de un blastocisto es imperativo para inducir decidualization. El hecho de que decidualization sólo se produce después del contacto con las células epiteliales del endometrio implica que los factores importantes son secretadas por las células epiteliales para inducir decidualization en el estroma subyacente. Aunque esta diferencia en la iniciación del proceso de decidualization debe ser reconocido, el hecho de que decidualization humano se vuelve más robusta a la implantación del embrión sugiere que mecanismos similares podrían estar involucrados. In vitro de cultivos celulares a menudo se utilizan para estudiar el efecto de moléculas específicas durante el proceso de decidualization.Sin embargo, la disponibilidad y la cantidad de tejido humano que puede ser recogida suele ser limitada y acompañadas de variaciones, por ejemplo, la fase del ciclo, número de embarazos y la presencia de enfermedades ginecológicas como la endometriosis o adenomiosis. Muchos de estos problemas pueden evitarse con el uso de tejido murino que es fácilmente accesible y la fase del ciclo independiente. Otra gran ventaja de la utilización de tejido murino es la oportunidad de utilizar los roedores modificados genéticamente y por la posibilidad de instalar un gran número de experimentos. Por el momento, muchos protocolos de aislamiento diferentes se han descrito en la literatura con alta variabilidad en la edad de los animales y el período en la fase de estro en el momento de uso.

En este estudio se presenta un nuevo método para endometriales co-cultivos primarios de células estromales y epiteliales en el que se aprovechó de un ciclo estral estandarizada por una inyección diaria de estrógeno antes del aislamiento. Además, el estrógeno es known para inducir la proliferación en las células epiteliales y estromales que aumenta aún más el rendimiento por aislamiento. El protocolo de aislamiento descrito en este documento se basa en Grant et al. 7, sin embargo, se incluyeron otras medidas de optimización para aumentar el rendimiento, la pureza y la viabilidad de los diferentes cultivos celulares. En primer lugar, HBSS siempre fue suplementado con antibióticos para evitar la contaminación del cultivo primario. Durante el aislamiento de MEEC, se llevó a cabo una adaptación de la temperatura (15 min a 37 ° C) para aumentar la cosecha de las células epiteliales durante la primera digestión. A continuación, se incluye un paso adicional para moderar la actividad enzimática después de digestión con tripsina mediante la adición de medio que contiene FBS para inhibir su actividad. Además, MEECs se pasaron a través de un filtro de la cual la malla era más grande que lo que se describe comúnmente (100 micras) ya que a menudo vienen en racimos y láminas de células. Por otra parte, la contaminación por células estromales se redujo mediante la realización de un complementoitional etapa en la que MEECs y mESCs fueron separados basados ​​en la sedimentación por gravedad. Finalmente, MEECs se sembraron en cubreobjetos recubiertos con colágeno para aumentar la unión de las células a cubreobjetos de vidrio, como se puso de manifiesto que el apego a cubreobjetos de vidrio no recubiertas o-PLL era insuficiente. Durante el aislamiento de los mESCs, se complementó colagenasa (1 mg / ml) para mejorar la digestión. Además, esta etapa de digestión se realizó por duplicado para evitar la contaminación de MEECs restantes. Todos estos pasos adicionales resultaron en cultivos puros y viables de poblaciones celulares homogéneas.

La pureza de la población de células se evaluó con inmunotinción y QRT-PCR usando vimentina como marcador del estroma y citoqueratina como un marcador epitelial. Claramente, se observó un patrón de expresión opuesto de vimentina y citoqueratina en MEEC y MESC. Sin embargo, se puede notar que la expresión mRNA relativa de vimentina y citoqueratina es similar en los cultivos MEEC. similar resultados son publicados por otros grupos de investigación, en el que las células epiteliales en la expresión de vimentina cultura adquieren 9. Más importante es la diferencia en la expresión de proteínas entre vimentina y citoqueratina como se observó en los inmunohistoquímico coloraciones de las diferentes poblaciones de células. inmunotinción doble mostró que EECs fueron positivas para citoqueratina y ESC fueron positivas para vimentina. El uso de estos marcadores en la inmunotinción es un método establecido y de manera estándar utiliza para indicar los tipos de células 10.

Aunque una gran cantidad de investigación se ha realizado en el decidualization de MESC, sigue siendo posible que la presencia de células epiteliales en este modelo puede alterar los resultados de decidualization. En primer lugar, se ha demostrado que si MEEC crecer a una monocapa en presencia de medio MESC acondicionado o en un entorno de co-cultivo, la monocapa tiene una resistencia eléctrica transepitelial mejorada de células epiteliales (TEER), como resultado de factores secretados por MESC 7. Por otra parte, Pierro et al. 11 proporcionan evidencia de que la proliferación epitelial, influenciado por 17β-estradiol, podría estar mediado por factores secretados por las células del estroma, y de forma alternativa, las células epiteliales pueden liberar factores que modulan decidualization estroma 12, 13. En general, es evidente que el entorno de co-cultivo epitelial-estromal ofrece una situación más fisiológica que permite la interacción paracrina y la comunicación. El método de cultivo de dos tipos de células diferentes utilizando un sistema de co-cultivo inserto se ha descrito anteriormente 14, 15 y se ha adaptado para el uso de células primarias de múrido. Por la detección de los niveles de mRNA de prolactina como de salida para leer decidualization, la técnica descrita tiene un muy reproducible de lectura de salida para decidualization disponible y permitirs así el estudio de la relación epitelial-estromal durante decidualization. paracrinos señales mediadas de MEEC podrían alterar el alcance de decidualization en las células del estroma. Además, el modelo permite la modulación específica de la parte epitelial sin afectar directamente a las células del estroma. Por lo tanto, esta co-cultivo de MEEC y MESC ofrece una herramienta perfecta para evaluar el efecto de las hormonas, citoquinas, etc., en las células epiteliales con una lectura de datos en decidualization estromal. Otra ventaja de este sistema de cultivo es que permite a los investigadores estudiar la implicación de una proteína específica en el decidualization-proceso, ya sea en el epitelial o compartimiento del estroma mediante el uso de células aisladas de animales transgénicos. Además, esta técnica será muy útil para investigar la adhesión de blastocisto para evaluar si los factores paracrinos secretadas por las células epiteliales en presencia de un blastocisto son suficientes para inducir decidualization de la estroma subyacenteCélulas. Un paso importante en la invasión del trofoblasto correlacionada con degradación de la matriz extracelular, que está mediada por la acción de enzimas proteolíticas. La técnica propuesta se puede aplicar como un modelo in vitro para investigar la diafonía entre el blastocisto, las células epiteliales y del estroma de soporte.

Sin embargo, por el momento se sabe poco sobre el origen de las células epiteliales que pueden ser, así como luminal glandular. Por lo tanto, se requiere una mayor caracterización del perfil genético y molecular de las células epiteliales. Además, el método descrito está limitado en el conocimiento disponible acerca de la polarización de las células epiteliales. Por el momento, la polarización de las células epiteliales no se tuvo en cuenta. Sin embargo, diferencias en la expresión de proteínas de membrana se describen en las membranas apicales y basales. la polarización inadecuado de la capa epitelial podría tener un impacto en la interacción paracrina entre epitheliAl y las células del estroma. Sin embargo, los métodos para obtener células epiteliales polarizadas se ha descrito y se podrían incluir en la técnica descrita 15, 16.

En total, el protocolo descrito propone una técnica para establecer con éxito cultivos celulares primarios de ratón epitelial endometrial y células del estroma. Esta técnica resulta en cultivos de células puras como se confirma por QRT-PCR y la inmunotinción de vimentina y citoqueratina. En última instancia, se introdujo una epiteliales y del estroma de co-cultivo que permite la investigación de las señales paracrinas mediadas por cualquiera de MEEC y / o MESC en el proceso decidualization.

Disclosures

Los autores no tienen nada que revelar.

Acknowledgments

Este trabajo fue apoyado por becas de la Fundación de Investigación de Flandes (FWO G.0856.13N) y el Consejo de Investigación de la Universidad Católica de Lovaina (OT / 13/113). KDC es financiado por el FWO Bélgica. AH es financiado por OT / 13/113. Nos gustaría dar las gracias a la instalación Cell Imaging Core de la Universidad Católica de Lovaina (http://gbiomed.kuleuven.be/english/corefacilities/microscopy/cic/cic.htm) para el uso del microscopio confocal.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
ThinCert Tissue culture insert for 24 well plates; 1 µm pore size; transparant Greiner Bio-one 662610 Inserts are also provided for other multiwell plates and/or other pore sizes. Other suppliers: Merck Millipore.
https://shop.gbo.com/en/row/articles/catalogue/article/
0110_0110_0090_0030/13408/ 
Nunc Cell culture treated 24 well plates Thermo Scientific 142475 http://www.thermofisher.com/order/catalog/product/142475
8-Bromoadenosine 3′,5′-cyclic monophosphate sodium salt Sigma Aldrich B7880 Prepare a stock solution of 100 mM in Milli Q water. Store aliquots at -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/b7880?lang=en&region=BE 
Medroxyprogesterone 17-acetate Sigma Aldrich M1629 Prepare a stock solution of 250 µM in ethanol. Store aliquots at -20 °C.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m1629?lang=en&region=BE 
Arachis oil Supermarket Standard cooking arachis oil that can be found in every supermarket is used
PrestoBlue cell viability reagent Thermo Scientific A13261 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A13261?ICID=cvc-prestoblue-c1t1
HBSS 1x, no calcium, no magnesium, no phenol red Gibco 14175-046 Store in fridge as long as possible. Use cold HBSS+ during the protocol.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14175046 
17-β Estradiol Sigma Aldrich E8875 Prepare a stock solution of 1 mg/mL in EtOH before diluting in arachis oil (1:1,000).
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/e8875?lang=en&region=BE
Cell medium filter Stericup, 0.22 µm, polyethersulfone, 500 mL, radio-sterilized Merck Millipore SCGPU05RE http://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Stericup-GP%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-500%C2%A0mL%2C-radio-sterilized,MM_NF-SCGPU05RE
Penicillin-Streptomycin (5,000 U/mL) Gibco 15070-063 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15070063?ICID=search-15070-063
DMEM/F12, phenol red, L-glutamine, HEPES Gibco 11330-032 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/11330057?ICID=search-11330-057
Fetal Bovine Serum, qualified, heat inactivated, E.U.-approved, South America Origin Gibco 10500-056 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10500064?ICID=search-10500-064
Amphotericin B Gibco 15290-018 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15290018?ICID=search-15290-018
Gentamicin (50 mg/mL) Gibco 15750-037 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/15750037?ICID=search-15750-037
DMEM, low glucose, pyruvate, no glutamine, no phenol red Sigma Aldrich D5921 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/d5921?lang=en&region=BE
MCDB-105 Sigma Aldrich M6395 Dilute in Milli Q water, adjust pH to 7 with NaOH and filter before use. Store in the dark.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/m6395?lang=en&region=BE 
Insulin from bovine pancreas Sigma Aldrich I1882 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/i1882?lang=en&region=BE
Coverslips, glass, 18 mm Ø Glaswarenfabrik Karl Hecht 1001/18 http://www.hecht-assistent.de/187/?L=1&tx_rmproducts_pi1[g]=937
&tx_rmproducts_pi1[p]=3504
&tx_rmproducts_pi1[v]=20088
&cHash=abd12065683fe74b00eaa
5e562824d06
Poly-L-lysine Sigma Aldrich P2636 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p2636?lang=en&region=BE
Collagenase type IA from Clostridium histolyticum Sigma Aldrich C2674 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2674?lang=en&region=BE
DPBS, no calcium, no magnesium Gibco 14190-094 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14190094?ICID=search-14190-094
Trypsin from bovine pancreas Sigma Aldrich T7409 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/t7409?lang=en&region=BE
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red Gibco 25300-054 Warm to room temperature before use.
https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/25300054?ICID=search-25300-054 
Cell strainer, 40 µm mesh, disposable BD Falcon 352340 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Cell strainer, 100 µm mesh, disposable BD Falcon 352360 https://www.fishersci.com/shop/products/falcon-cell-strainers-4/p-48680
Millex-GP Syringe Filter Unit, 0.22 µm, polyethersulfone, 33 mm, gamma sterilized Merck Millipore SLGP033RS https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Millex-GP-Syringe-Filter-Unit%2C-0.22%C2%A0%C2%B5m%2C-polyethersulfone%2C-33%C2%A0mm%2C-gamma-sterilized,MM_NF-SLGP033RS?bd=1
Acetic acid (glacial) 100% Merck Millipore 1.00063 https://www.merckmillipore.com/BE/en/product/Acetic-acid-%28glacial%29-100%25,MDA_CHEM-100063
Collagen I Corning  354236 From rat tail.
https://catalog2.corning.com/LifeSciences/en-BR/Shopping/ProductDetails.aspx?categoryname=&
productid=354236%28
Lifesciences%29# 
Pancreatin from porcine pancreas Sigma Aldrich P3292 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/p3292?lang=en&region=BE
35 mm Tissue Culture Dishes, Polystyrene, Sterile BD Falcon 353001 https://us.vwr.com/store/catalog/product.jsp?product_id=4675630
Ethanol absolute AnalaR NORMAPUR ACS, Reag. Ph. Eur. analytical reagent VWR Chemicals 20821296 https://uk.vwr.com/store/catalog/product.jsp?catalog_number=20821.310DP
monoclonal rabbit anti-human vimentin (D21H3)  Cell Signalling Tech #5741 Use 1/500.
http://www.cellsignal.com/products/primary-antibodies/vimentin-d21h3-xp-rabbit-mab/5741
monoclonal mouse anti-human pan cytokeratin  Sigma Aldrich C2562 Use 1/1,000.
http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/c2562?lang=en&region=BE
Paraformaldehyde Solution, 4% in PBS Affymetrix 19943 http://www.affymetrix.com/catalog/130621/USB/Paraformaldehyde+Solution+4+percent+in+PBS#1_1
Triton X-100 Sigma Aldrich X100 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/SIAL/X100?lang=en&region=BE&gclid=
Cj0KEQjwhN-6BRCJsePgxru9iIw
BEiQAI8rq
879lESeuIU4N4AEQRLNEXj4f
8z65KkD-q8Xr35sQDRgaAp-k
8P8HAQ
Goat serum Sigma Aldrich G9023 http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g9023?lang=en&region=BE
Goat anti-rabbit Alexa Fluor 488 Thermo Scientific A-11034 http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=488&
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Goat anti-mouse Alexa Fluor 594 Thermo Scientific A-11032 http://www.thermofisher.com/order/genome-database/searchResults?query=594&
resultPage=1&
resultsPerPage=15&
autocomplete=&
priorSearchTerms=&
searchMode=keyword&
productTypeSelect=antibody&
targetTypeSelect=
antibody_secondary&
species=ltechall&
keyword=594#filters=genericsort2:\%22Capra%20hircus\%22;;generic6:^\%22Mus%20musculus\%22$;;
VECTASHIELD mounting medium with DAPI Vector Laboratories H-1200 http://vectorlabs.com/vectashield-mounting-medium-with-dapi.html
DPBS, with calcium and magnesium Gibco 14040174 https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/14040133

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De Clercq, K., Hennes, A., Vriens, J. Isolation of Mouse Endometrial Epithelial and Stromal Cells for In Vitro Decidualization. J. Vis. Exp. (121), e55168, doi:10.3791/55168 (2017).

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