Analisi ottimizzata delle<em> In Vivo</em> e<em> In Vitro</em> Epatica steatosi
Summary
Here, optimized methods to generate in vivo and in vitro models of hepatic steatosis and to analyze the steatotic phenotypes and related physiological parameters are described.
Abstract
Establishing a system of procedures to qualitatively and quantitatively characterize in vivo and in vitro hepatic steatosis is important for metabolic study in the liver. Here, numerous assays are described to comprehensively measure the phenotype and parameters of hepatic steatosis in mouse and hepatocyte models.
Combining the physiological, histological, and biochemical methods, this system can be used to assess the progress of hepatic steatosis. In vivo, the measurements of body weight and nuclear magnetic resonance (NMR) provide a general understanding of mice in a non-invasive manner. Hematoxylin and Eosin (H&E) and Oil Red O staining determine the histological morphology and lipid deposition of liver tissue under nutrient overload conditions, such as high-fat diet feeding. Next, the total lipid contents are isolated by chloroform/methanol extraction, which are followed by a biochemical analysis for triglyceride and cholesterol. Moreover, mouse primary hepatocytes are treated with high glucose plus insulin to stimulate lipid accumulation, an efficient in vitro model to mimic diet-induced hyperglycemia and hyperinsulinemia in vivo. Then, the lipid deposition is measured by Oil Red O staining and chloroform/methanol extraction. Oil Red O staining determines intuitive hepatic steatotic phenotypes, while the lipid extraction analysis determines the parameters that can be analyzed statistically. The present protocols are of interest to scientists in the fields of fatty liver diseases, insulin resistance, and type 2 diabetes.
Introduction
L'obesità è un problema di salute in rapida crescita nei paesi sviluppati e in via di sviluppo. E 'stato segnalato per essere una delle condizioni coesistenti frequentemente associati con steatosi epatica non alcolica (NAFLD), con una prevalenza che varia tra il 30 e il 100 per cento in pazienti con NAFLD 1. A causa della forte correlazione tra il fegato grasso e l'obesità, obesi (DIO) modelli murini di dieta-indotta sono ampiamente utilizzati per studiare i meccanismi molecolari complessi associati con lo sviluppo di NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Steatosi epatica è il primo stadio della NAFLD, e può progredire a steatoepatite non alcolica (NASH), cirrosi, e in ultima analisi, il cancro del fegato 7. Pertanto, l'obiettivo generale di questo metodo è quello di generare modelli animali e cellulari di condizioni steatosico epatiche e al PrOvide protocolli dettagliati per la misurazione dei lipidi efficiente ed accurato. Questi modelli e misure sono utili anche per la ricerca di altri disordini metabolici, come la resistenza all'insulina e diabete di tipo 2.
Come l'obesità è identificato come uno dei principali fattori di rischio per la NAFLD, un alto contenuto di grassi, ad alto saccarosio dieta (HFHS) che imita la dieta ricca di grassi di tipo occidentale è usato per indurre l'obesità nei topi. Successivamente, il grado di steatosi epatica può essere valutata con metodi diversi. In primo luogo, il peso corporeo e analisi della composizione corporea con risonanza magnetica nucleare (NMR) mostrano l'accumulo di lipidi durante il tempo di alimentazione. La massa grassa e massa magra possono essere quantificati in modo non invasivo e in tempo reale.
Inoltre, la risonanza magnetica (MRI) viene utilizzata sia per il corpo intero e la distribuzione fegato grasso. Il segnale scala di grigi dell'analisi MRI può essere convertito un'immagine pseudo-colori leggibile in, e l'intensità dellala scala di grigi e colore è emi-quantificabile. Questa tecnologia offre vantaggi unici per la misurazione di accumulo di lipidi di animali vivi. In secondo luogo, l'analisi istologica del fegato è il metodo più comunemente utilizzato per determinare steatosi epatica. Ematossilina ed eosina (H & E) colorazione istologica fornisce informazioni, quali epatociti morfologia e infiltrazione di macrofagi, mentre Oil Red O colorazione mostra la dimensione e la posizione delle goccioline lipidiche in epatociti. In terzo luogo, l'analisi del contenuto di lipidi utilizzando estrazione con cloroformio / metanolo è una misurazione accurata e quantitativa dei lipidi epatici. Totale livelli di trigliceridi e di colesterolo possono essere misurati con metodi biochimici. È importante sottolineare che l'analisi estrazione dei lipidi e Oil Red O colorazione possono essere utilizzati anche in geneticamente manipolato o trattato farmaceuticamente epatociti.
Il vantaggio del presente metodo è la sua utilizzazione di approcci multipli ottimizzati per generare modelli steatosico epatichee caratterizzare completo fenotipi sia in vivo che in vitro. I modelli DIO mouse possono ricapitolare i patologia e metaboliche fenotipi di malattia del fegato grasso umano. Altri parametri metabolici negli esseri umani possono essere replicati in questo modello, come pure 8. La generazione del modello epatociti steatosico in risposta ad alta glucosio più insulina è efficiente, utile, e supera la limitazione del lavoro costoso e richiede tempo mouse. Nel loro insieme, questi metodi sono sufficienti ed essenziali per lo studio della disfunzione epatica lipidi e insulino-resistenza durante sovraccarico di nutrienti.
Protocol
Representative Results
Discussion
NAFLD è una serie di malattie epatiche progressive che è associato con la sindrome metabolica, l'obesità, insulino-resistenza, o diabete mellito tipo 2 (DM2) 11. Il segno distintivo di NAFLD è steatosi, l'accumulo di lipidi negli epatociti. Qui, uno spettro di metodi è presentata per caratterizzare i fenotipi e parametri di steatosi epatica utilizzando topi DIO e epatociti del mouse primarie. Questa procedura potrebbe essere utile per chiarire i meccanismi molecolari di NAFLD e altre…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We appreciate Feifei Zhang for the helpful discussions. We are grateful to Jing Gao and Yixuan Sun for the technical assistance and to Zhengshuai Liu and Fengguang Ma for the animal studies.
Materials
| O.C.T compound | SAKURA | 4583 | |
| Oil Red O | Sigma | O0625-25G | |
| Infinity Triglycerides kit | Fisher Scientific | TR22421 | |
| Infinity Cholesterol kit | Fisher Scientific | TR13421 | |
| Collagen type I, Rat tail | Millipore | 08-115 | |
| DMEM (low glucose) | Invitrogen | 11885-092 | |
| Penicillin / Streptomycin | Invitrogen | 15140-122 | |
| FBS | Invitrogen | 10099141 | |
| PBS | cellgro | R21-040-CVR | |
| HBSS | cellgro | 20-021-CV | |
| Insulin | TOCRIS Bioscience | 3435 | dissolve in PBS, 1mM for stock |
| Glucose | Sigma | G8270-100G | |
| Microscope | Olympus | BX53 | |
| Peristaltic pump | Longerpump | BT100-2J | |
| 10cm cell culture dish | Corning | 420167 | |
| 6-well-plate | Corning | 3516 | |
| BCA assay | Beyotime | P0010 | |
| Nuclear Magnetic Resonance | Niumag technology | MiniQMR23-060H-I | |
| High fat high surcose diet(HFHS) | Research Diets | D12327 |
References
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