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Medicine

优化分析 doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

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肥胖是发达国家和发展中国家一个新兴的健康问题。据报道是经常与非酒精性脂肪肝病(NAFLD)相关联的共存条件之一,具有患病30%和100%的NAFLD患者1之间的范围内。由于脂肪肝和肥胖症之间的强相关性,膳食诱导的肥胖(DIO)小鼠模型被广泛用于研究与NAFLD 2,3,4,5,6的发展相关联的复杂的分子机制。肝脂肪变性是NAFLD的最早阶段,它可以前进到非酒精性脂肪性肝炎(NASH),肝硬化,最终,肝癌7。因此,这种方法的总体目标是产生的肝脂肪变性条件动物和细胞模型和PR奥维德的高效,准确的测量血脂详细的协议。这些模型和测量也可用于其他代谢疾病,如胰岛素抵抗和2型糖尿病的调查是有用的。

由于肥胖被确定成为NAFLD,高脂肪的主要危险因素之一,高糖饮食(HFHS)模仿西式高脂饮食是用于诱导的肥胖小鼠。接着,肝脂肪变性的程度可以用不同的方法来评估。首先,体重和核磁共振(NMR)身体成分的分析表明喂养时间内脂质积累。的脂肪量和瘦体重可以以非侵入性的和实时的方式进行量化。

此外,磁共振成像(MRI)是用来同时显示全身和脂肪肝的分布。在MRI分析的灰度级信号可以被转换成清晰的伪彩色图象,和强度在灰度和彩色是半定量的。该技术提供了独特的优势,为在活的动物脂肪积累的测量。第二,肝脏的组织学分析是最常用的方法来确定肝脂肪变性。苏木精和曙红(H&E)染色的组织学提供的信息,如肝细胞形态和巨噬细胞浸润,而油红O染色显示肝细胞中脂质小滴的大小和位置。第三,用氯仿/甲醇萃取脂质含量分析是肝脂质的精确和定量的测量。总甘油三酯和胆固醇水平可与生化方法来测量。重要的是,脂质提取分析和油红O染色,也可在基因操作或药学治疗肝细胞使用。

本方法的优点是多种优化方法及其利用,以产生肝脂肪变性模型和全面表征表型在体内体外 。该DIO小鼠模型可以概括人类脂肪肝疾病的病理和代谢表型。在人类其他代谢参数可以在这个模型以及8被复制。响应于高糖加胰岛素的脂肪肝的肝细胞模型的生成是有效的,有用的,并且克服了昂贵和耗时鼠标工作的限制。两者合计,这些方法是足够和必不可少的肝脏脂质功能障碍和胰岛素抵抗养分超载在研究。

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Protocol

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所有的动物实验方案通过在研究院营养科学学院,上海生命科学研究院,中国院士(中国上海)的机构动物护理和使用委员会批准。

1. DIO小鼠模型

  1. HFHS喂养
    1. 饲料八周龄雄性C57BL / 6小鼠用含有40千卡%的脂肪和40千卡%蔗糖的HFHS。房子在他们12小时暗光循环条件。
    2. 保持在HFHS饮食喂养条件的小鼠4周至16周。检查每周体重。
  2. 身体成分分析和伪彩色图像分析
    1. 若使小鼠身体成分分析仪分析。
      1. 在塑料管安全意识,不麻醉的小鼠。测量身体脂肪量,肌肉量,并使用核磁共振系统的流体,如前面2中所述。
    2. 使用扫描MRI系统每只小鼠的全身。
      1. 麻醉通过腹腔注射(25μL/ g)的1%阿佛丁的小鼠和专门的玻璃管进行成像分析。
        注:成像的方法,持续每只小鼠近0.5小时。当完成测量时,返回的小鼠其笼子。
    3. 扫描背侧,中间,和腹侧层小鼠的整个机构;扫描在垂直方向上的肝脏。使用0.55磁铁t和下面的仪器参数:K空间= 192×256微米,截面厚度= 3毫米,TE = 14.8毫秒,TR = 400毫秒,FOVRead = 100毫米,FOVPhase = 100毫米,扫描次数= 8.扫描使用相同的磁场条件小鼠的所有组。
    4. 根据信号强度9灰度图像映射到的伪彩色图象。
  3. 鼠标安乐死
    1. 消毒dissectiNG工具,如镊子和剪刀。
    2. 倒在纸巾上足够的异氟烷,并让异氟烷在玻璃罐挥发。确保将小鼠通过异氟烷安乐死。
    3. 固定在手术台上的小鼠。喷每个腹部用75%乙醇,使在用剪刀剑突的真皮的切口,并通过与手中线纵向撕裂真皮暴露腹膜。
    4. 夹紧钳剑突切腹膜纵横通过肋的底部,以暴露内脏。
    5. 通过心脏穿刺收集在EDTA涂层管血。
    6. 沿切肝隔膜,小心地取出使用细剪刀enterocoelia肝脏。切三块肝组织为以下脂质测量:一)6×3×3毫米的H&E染色,B)6×3×3毫米油红O染色,和c)对氯仿20-40毫克肝脏/甲醇提取。
  4. H&E染色
    1. 固定在4%磷酸盐缓冲的福尔马林乙酸肝脏在4℃下过夜,然后在石蜡中嵌入它。
    2. 切石蜡切片(5微米),并安装它们在载玻片上为H&E染色,如前所述3,10。
  5. 油红O染色
    1. 丽晶准备
      1. 制备具有10%的福尔马林,60%异丙醇,苏木和甘油胶冻油红O工作溶液。溶解0.5油状物红O粉末用100mL异丙醇和其加热在60℃的浴中,使0.5%的储备溶液。
      2. 2比(毫升DDH 2 O的的储备溶液3毫升和2):在3用双蒸水(DDH 2 O)稀释。过滤工作溶液,静置在室温下至少10分钟。
    2. 嵌入在AP最佳切削温度(OCT)化合物中的肝拉斯蒂克嵌入框。在-20℃30分钟将其冻结。把它切成8微米的部分在冷冻切片机,装入组织上滑动,并将其放置在室温下30分钟。
    3. 放置纸巾在染色槽的底部,并倒10%福尔马林的少量润湿纸巾。放置在染色槽内的滑动和固定在甲醛蒸气冰冻切片在4℃5分钟。
    4. 浸在3秒染色桶60%的异丙醇幻灯片;重复一次。
    5. 添加的油红O工作溶液几滴到滑动覆盖所有组织孵育15分钟。在室温下避光组织。
    6. 冲洗在3秒染色桶新的60%的异丙醇幻灯片;重复两次。
    7. 轻轻漂洗通过蒸馏水滑动两次并取出组织周围的水。一定不要干组织。
    8. 放在苏木幻灯片1分钟,用自来水轻轻漂洗5-10分钟。轻轻冲洗蒸馏水中滑两次,并保持它的蒸馏水,直到准备把盖玻片上。
    9. 烧热在微波甘油果冻,并把几滴在组织之上。轻轻地在上面放置盖玻片并注意不要形成气泡。
    10. 观察染色在显微镜下,并使用20X和40X的目标捕捉特征的照片。
  6. 肝脏脂类的测量
    1. 放置解剖肝组织中新的2毫升的塑料离心管中。均质在1毫升的PBS用均化和裂解物转移到一个新的15毫升玻璃管中。
    2. 加入5毫升氯仿/甲醇(2:1,体积/体积)溶液,涡旋混合物剧烈1分钟,并静置在冰上2小时。
    3. 离心在4℃1650 XG 10分钟;该混合物应分离成3层:上层甲醇层,中间蛋白光盘,和底氯仿和脂质。
    4. 陈德良 sfer底部相入用玻璃巴斯德吸管新玻璃管没有必要获取底部馏分的每一滴。抛开管冰。
    5. 添加氯仿4mM的氯化镁和1.5毫升的600μL到留在以前的管和涡大力上清液部分。在4℃下在冰上孵育30分钟,并离心于1650×g离心10分钟。
    6. 结合的底部相用巴斯德吸移管的第一底部相管。丢弃上层和中层。
    7. 蒸发在氮气下的氯仿中37℃浴中。以1%的Triton X-100 /氯仿200μL的彻底清洗的玻璃试管的侧面(体积/体积)。在氮气下蒸发。溶解与DDH 2 O的200μL,涡旋脂质很好地做最后的乳液。
    8. 根据制造商的方案通过使用甘油三酯或胆固醇试剂盒测量总甘油三酯(TG)和胆固醇(TC)水平外部参照“> 3。
      注:脂质值归一化到那些在初始匀浆中的蛋白质浓度的,如通过蛋白质定量3确定。

2.原发性肝细胞鼠标型号

  1. 小鼠原代肝细胞的分离
    1. 麻醉每只小鼠用6%水合氯醛(10微升/ g的腹膜内注射)。
    2. 隔离原代肝细胞,如前所述10。生长细胞对胶原涂覆的玻璃盖玻片在油红O染色的6孔板中。用于脂质提取,种子细胞到10厘米的细胞培养皿10。
  2. 细胞治疗和油红O染色
    1. 替换用2mL饥饿培养基的培养基,并在37℃孵育24小时。 30毫米的葡萄糖和100nM胰岛素治疗。它孵育在24小时37℃培养箱内培养。
    2. 吸出网上平台。加入PBS毫升2和漩涡轻轻冲洗介质;重复一次。
    3. 修复盖玻片用橡皮筋的幻灯片。暴露附着于外表面的细胞。上面(步骤1.5)中所述进行油红O染色。
      注:脂质蓄积的基础水平被刺激血清饥饿后的高葡萄糖加胰岛素治疗。脂质液滴通过油红O染色可视化。
  3. 血脂测定
    1. 治疗与高糖加胰岛素在相同的条件下(步骤2.2.1)的肝细胞。添加1毫升的PBS每10厘米细胞培养皿。刮去细胞和收获它们变成新的15毫升的玻璃管,从该100微升的等分试样转移至新的1.5毫升管中为蛋白质定量。
    2. 添加氯仿的4毫升/甲醇(2:1,体积/体积),以细胞的剩余900微升。超声处理约20哔声,然后涡大力释放脂在细胞中。在冰上孵育混合物2小时。执行脂质提取(步骤1.6)。

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Representative Results

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如在图1A中所示,小鼠体重为16周HFHS馈送,这大约是1.5倍食物饮食喂养组更高的后增加至45±1.2克核磁共振身体组成分析示出的脂肪质量和小鼠的瘦体质量指示( 图1B)。全身和肝脏的脂肪分布是通过MRI测定,并在活,有意识的小鼠代表伪彩色图像在图1C-D中所示。体重和身体组成进行测定,在HFHS饮食喂养过程可视化。

进一步解剖脂肪变性的表型,将小鼠处死并进行肝脏组织学分析。肝脏的H&E和油红O染色显示在图2A-B,其中脂肪滴成长大,占据多数的空间4个月HFHS饮食喂养后肝细胞。 HFHS饮食喂养的小鼠的肝脂肪变性的程度是很容易通过用食物饮食喂养的小鼠的比较显示。脂质的主要部件,诸如甘油三酯和胆固醇,用氯仿/甲醇萃取( 图2C)进行测定。在DIO小鼠中,营养过剩的过载造成的肝脏异常的甘油三酯积累。与由NMR,MRI和组织学分析数据,脂质沉积的程度可以有效地和精确地确定。

正如图3所示,在原代肝细胞的脂质水平24小时诱导的高糖加胰岛素。累积的脂滴通过油红O染色( 图3A)来确定,并用于定量脂质分析随后以测量在肝细胞中甘油三酯和胆固醇的水平( 图3B)。在此基础上模型,遗传修饰或在肝细胞脂质稳态药物治疗的效果可以以有效和快速的方式进行研究。

图2
图1.高脂肪,高糖饮食(HFHS)增加小鼠肥胖和脂肪肝。八周龄的雄性C57BL / 6小鼠喂食上的食物或HFHS饮食分别为8周,16周。 (A)体重的老鼠。小鼠( )身体组成。 (C - D)代表磁共振鼠标和肝脏的形象。白色区域的灰度图像中表示的脂肪,而伪彩色图像中的红色区域指示的脂肪。数据被表示为平均值±标准误差(SEM)中,n = 5-8。 * P <0.05相对于食物饮食喂养的老鼠。误差棒代表SEM。国家统计使用未配对的双尾学生t检验进行分析部分。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2
图2.分析与HFHS饲料喂养的小鼠脂肪肝。八周龄的雄性C57BL / 6小鼠喂食上的食物或HFHS饮食分别为8周,16周。 (A)enterocoelia和肝脏代表大体形态。 (B)代表H&E和油红O染色(比例尺:50微米)。油红O染色脂肪和中性脂肪,红色圆点表示在肝细胞中积累脂肪滴。 (C)的使用氯仿/甲醇方法中的肝脏脂质提取总甘油三酯和胆固醇水平。数据被归一化到t他肝重,和被表示为平均值±标准误差(SEM)中,n = 5-8。 * P <0.05,而使用食物饮食喂养小鼠。误差棒代表SEM。使用未配对的双尾学生t检验进行统计分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3
图3.肝脂肪变性是暴露在高葡萄糖+胰岛素小鼠原代肝细胞诱导。没有或葡萄糖和胰岛素处理的培养的原代肝细胞(A)的油红O染色,所指示的(比例条:50微米)。 (B)在原代肝甘油三酯水平进行测定,并归一化到蛋白质浓度。数据被表示为平均值±的标准误差(SEM)。 * P <0.05相对于对照组。误差棒代表SEM。使用未配对的双尾学生t检验进行统计分析。 请点击此处查看该图的放大版本。

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Discussion

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NAFLD是一系列与代谢综合征,肥胖,胰岛素抵抗或II型糖尿病(T2DM)11相关联的进行性肝脏疾病。 NAFLD的特点是脂肪变性,脂质在肝细胞中的积累。这里,提出来表征表型和使用的DIO小鼠和小鼠原代肝细胞脂肪肝的参数的方法的光谱。此过程可帮助阐明NAFLD和其他相关的代谢性疾病的分子机制。

在体内体外实验相结合,这些方法提供了全面的分析和脂肪肝的评估。目前,NAFLD的动物模型主要由遗传和营养模型。这里使用的HFHS饮食旨在模仿现代饮食风格和足以诱导肥胖和脂肪肝中的小鼠。然而,研究在开发板的分子机制脂质放松管制的pment,基于细胞的测定法包含超过动物研究明显的优点,包括通过基因突变或药物治疗易于操纵,以及相对低的成本和时间的承诺。以产生在小鼠原代肝细胞肝脏脂肪变性,高浓度的葡萄糖以及胰岛素来诱导脂质堆积,这是一种新的和体外模型有效地模拟体内饮食诱导的高血糖症和高胰岛素血症。该处理也适用于其他的肝细胞系,例如HepG2细胞。鉴于遗传修饰的肝细胞对多种药物治疗的访问,此处描述体外脂肪变性模型克服了限制和使用GAIN-和失功能的方法对动物模型的生成费时的步骤。

体成分分析,包括NMR和MRI,上提供的非侵入性和实时数据脂质在整个身体和肝脏。它是一种非侵入性,省时省力,可视化的,与半质量测量。另外,身体组成分析的准确性,可以大大通过结合其它组织学和生化测定改善。它是至关重要的,必须确定体内和使用H&E染色,油红O染色和脂质测量,所有这些都是用于诊断和分级脂肪肝黄金标准测量体外肝脂肪变性。

一本发明方法的一个限制是它不能测量炎症和胶原沉积时单纯性脂肪肝发展为肝炎,肝纤维化,最终,肝硬化和肝癌。由于饮食诱导的肥胖小鼠对NASH发展低风险,目前的协议足以DIO小鼠来评估肝脂肪变性。然而,在NASH的条件下,其他生化测量,如等离子体阿拉尼NE转氨酶(ALT)和天冬氨酸转氨酶(AST)的水平,应利用。

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Disclosures

作者宣称,他们没有竞争的经济利益。

资金来源:这项工作是由中国国家自然科学基金(81270930号,31471129,和31671224)和百人计划中国的科学院计划(2013OHTP04),以YL资助项目

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

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References

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优化分析<em&gt;在体内</em&gt;和<em&gt;体外</em&gt;脂肪肝
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Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

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