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Medicine

के अनुकूलित विश्लेषण doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

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मोटापे की वजह से विकसित और विकासशील देशों में बढ़ती स्वास्थ्य समस्या है। यह 30 और 100 NAFLD रोगियों 1 में प्रतिशत के बीच लेकर एक व्यापकता के साथ, coexisting की स्थिति अक्सर nonalcoholic फैटी लीवर रोग (NAFLD) के साथ जुड़े में से एक होने की सूचना दी गई है। फैटी लीवर और मोटापे के बीच मजबूत संबंध के कारण, आहार प्रेरित मोटापे से ग्रस्त (DIO) माउस मॉडल व्यापक रूप से NAFLD 2, 3, 4, 5, 6 के विकास से जुड़े जटिल आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। यकृत स्टीटोसिस NAFLD के प्रारंभिक चरण है, और यह nonalcoholic स्टीटोहैपेटाइटिस (नैश), सिरोसिस, और अंत में, लीवर कैंसर से 7 प्रगति कर सकते हैं। इसलिए, इस विधि के समग्र लक्ष्य यकृत steatotic की स्थिति के पशु और सेल मॉडल उत्पन्न करने के लिए और पीआर करने के लिए हैकुशल और सटीक मापन के लिए लिपिड ovide विस्तृत प्रोटोकॉल। इन मॉडलों और माप भी ऐसे इंसुलिन प्रतिरोध और टाइप 2 मधुमेह के रूप में अन्य चयापचय संबंधी विकार, की जांच के लिए उपयोगी होते हैं।

मोटापा NAFLD, एक उच्च वसा के लिए महत्वपूर्ण जोखिम कारकों में से एक होने के लिए पहचाना जाता है के रूप में, उच्च सुक्रोज आहार (HFHS) है कि पश्चिमी शैली के उच्च वसा वाले आहार लुभाती चूहों में मोटापे के लिए प्रेरित करने के लिए प्रयोग किया जाता है। बाद में, यकृत स्टीटोसिस की डिग्री अलग अलग तरीकों का उपयोग कर मूल्यांकन किया जा सकता है। सबसे पहले, शरीर के वजन और परमाणु चुंबकीय अनुनाद (एनएमआर) के साथ शरीर की संरचना विश्लेषण समय खिला दौरान लिपिड संचय दिखा। वसा द्रव्यमान और दुबला मास एक गैर इनवेसिव और वास्तविक समय तरीके से मात्रा निर्धारित किया जा सकता है।

इसके अलावा, चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग (एमआरआई) दोनों पूरे शरीर और वसा के जिगर वितरण दिखाने के लिए प्रयोग किया जाता है। एमआरआई विश्लेषण के स्केल संकेत एक सुपाठ्य छद्म रंग छवि में परिवर्तित किया जा सकता है, और की तीव्रतास्केल और रंग अर्ध-quantifiable है। इस प्रौद्योगिकी जीवित पशुओं में लिपिड संचय की माप के लिए अद्वितीय लाभ प्रदान करता है। दूसरा, जिगर के histological विश्लेषण यकृत स्टीटोसिस निर्धारित करने के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किया विधि है। जबकि तेल लाल हे धुंधला आकार और hepatocytes में लिपिड बूंदों की स्थिति से पता चलता Hematoxylin और eosin (एच एंड ई) धुंधला हो जाना, इस तरह के hepatocyte आकृति विज्ञान और मैक्रोफेज घुसपैठ के रूप में ऊतकीय जानकारी प्रदान करता है। तीसरा, लिपिड सामग्री क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल निकासी का उपयोग कर विश्लेषण यकृत लिपिड का एक सटीक और मात्रात्मक माप है। कुल ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल के स्तर जैव रासायनिक तरीकों से मापा जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, लिपिड निकासी विश्लेषण और तेल लाल हे धुंधला भी आनुवंशिक छेड़छाड़ या pharmaceutically इलाज किया hepatocytes में इस्तेमाल किया जा सकता है।

वर्तमान पद्धति का लाभ यकृत steatotic मॉडल उत्पन्न करने के लिए कई अनुकूलित दृष्टिकोण के अपने उपयोग हैऔर व्यापक दोनों vivo में इन विट्रो में phenotypes को चिह्नित करने के लिए। डियो माउस मॉडल मानव फैटी लीवर रोग की विकृति और चयापचय phenotypes पुनरावृत्ति कर सकते हैं। मानव में अन्य चयापचय मानकों को अच्छी तरह से 8 के रूप में इस मॉडल में दोहराया जा सकता है। उच्च ग्लूकोज प्लस इंसुलिन के जवाब में steatotic hepatocyte मॉडल की पीढ़ी कुशल, उपयोगी है, और महंगी और समय लेने माउस काम की सीमा पर काबू। साथ में ले ली, इन तरीकों पर्याप्त पोषक तत्व और अधिक भार के दौरान यकृत रोग लिपिड और इंसुलिन प्रतिरोध के अध्ययन के लिए आवश्यक हैं।

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Protocol

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सभी पशु प्रयोगात्मक प्रोटोकॉल पोषाहार विज्ञान के लिए संस्थान, जीव विज्ञान के लिए शंघाई संस्थानों, चीनी विज्ञान अकादमी (शंघाई, चीन) में संस्थागत पशु की देखभाल और उपयोग समिति द्वारा अनुमोदित किया गया।

1. DIO माउस मॉडल

  1. HFHS खिला
    1. एक HFHS कि 40 किलो कैलोरी% वसा और 40 किलो कैलोरी% sucrose शामिल है के साथ आठ सप्ताह के एक पुरुष C57BL / 6 चूहों फ़ीड। उन्हें 12 घंटे अंधेरे प्रकाश चक्र की स्थिति घर।
    2. चार सोलह सप्ताह के लिए HFHS आहार खिला हालत में चूहों रखें। शरीर के वजन साप्ताहिक जाँच करें।
  2. शारीरिक संरचना विश्लेषण और छद्म रंग छवि विश्लेषण
    1. एक शरीर रचना विश्लेषक के विश्लेषण के लिए चूहों के अधीन।
      1. में एक प्लास्टिक ट्यूब में होश में है, न कि anesthetized चूहों सुरक्षित। उपाय शरीर में वसा द्रव्यमान, दुबला मास, और एक एनएमआर प्रणाली का उपयोग कर तरल पदार्थ के रूप में पहले 2 का वर्णन किया।
    2. एक एमआरआई प्रणाली का उपयोग करते हुए प्रत्येक माउस के पूरे शरीर को स्कैन।
      1. intraperitoneal इंजेक्शन (25 μL / छ) के माध्यम से 1% Avertin के साथ चूहों anesthetize और विशेष ग्लास ट्यूब में इमेजिंग विश्लेषण करते हैं।
        नोट: इमेजिंग की प्रक्रिया प्रत्येक माउस के लिए लगभग 0.5 घंटे के लिए रहता है। जब माप पूरा हो गया है, उनके पिंजरे में चूहों वापसी।
    3. पृष्ठीय, मध्य, और उदर परतों में चूहों के पूरे शरीर को स्कैन; ऊर्ध्वाधर दिशा में जिगर स्कैन। एक 0.55 टी चुंबक और निम्नलिखित महत्वपूर्ण भूमिका निभाई मापदंडों का उपयोग करें: कश्मीर अंतरिक्ष = 192 x 256 माइक्रोन, खंड मोटाई = 3 मिमी, ते = 14.8 एमएस, टी.आर. = 400 एमएस, FOVRead = 100 मिमी, FOVPhase = 100 मिमी, और संख्या स्कैन के = 8. स्कैन चूहों के सभी समूहों के लिए एक ही चुंबकीय हालत का उपयोग कर।
    4. एक छद्म रंग छवि पर नक्शे स्केल छवि संकेत तीव्रता 9 के अनुसार।
  3. माउस इच्छामृत्यु
    1. dissecti जीवाणुरहितएनजी उपकरण, संदंश और कैंची के रूप में।
    2. एक कागज तौलिया पर पर्याप्त isoflurane डालो और isoflurane एक ग्लास जार में भाप बनकर उड़ जाने। सुनिश्चित करें कि चूहों isoflurane द्वारा euthanized हैं।
    3. एक ऑपरेटिंग मेज पर चूहों को ठीक करें। 75% इथेनॉल के साथ प्रत्येक पेट स्प्रे, जिफाएडा प्रक्रिया कैंची का उपयोग कर के डर्मिस में एक चीरा बनाने, और हाथों से midline के माध्यम से लंबाई डर्मिस आंसू पेरिटोनियम बेनकाब करने के लिए।
    4. संदंश के साथ जिफाएडा प्रक्रिया दबाना और पसलियों के नीचे के माध्यम पेरिटोनियम चौड़ाई में कटौती विसरा को बेनकाब करने के लिए।
    5. हृदय पंचर द्वारा EDTA लेपित नलियों में रक्त ले लीजिए।
    6. जिगर के साथ डायाफ्राम कट और ध्यान से ठीक कैंची का उपयोग enterocoelia से जिगर को हटा दें। निम्नलिखित लिपिड मापन के लिए जिगर ऊतक के तीन टुकड़े कट: एक) 6 एक्स 3 एक्स 3 एच ई धुंधला के लिए मिमी, ख) 6 एक्स 3 एक्स 3 तेल लाल हे धुंधला के लिए मिमी, और ग) 20-40 क्लोरोफॉर्म के लिए जिगर का मिलीग्राम / मेथनॉल निकासी।
  4. एच एंड ई धुंधला
    1. रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% फॉस्फेट बफर formalin एसीटेट में जिगर को ठीक करें और फिर पैराफिन मोम में इसे लागू।
    2. आयल वर्गों (5 माइक्रोन) में कटौती और एच एंड ई धुंधला के लिए गिलास स्लाइड पर उन्हें माउंट, जैसा कि पहले 3, 10 में वर्णित है।
  5. तेल लाल हे धुंधला
    1. रीजेंट तैयारी
      1. 10% formalin, 60% isopropanol, Hematoxylin, और ग्लिसरॉल जेली के साथ तेल लाल हे काम कर समाधान तैयार है। isopropanol के 100 एमएल के साथ तेल लाल हे पाउडर के 0.5 ग्राम भंग और यह एक 60 डिग्री सेल्सियस के स्नान में गर्मी एक 0.5% शेयर समाधान बनाने के लिए।
      2. 2 अनुपात (DDH 2 हे के शेयर समाधान के 3 एमएल और 2 मिलीलीटर): एक 3 पर डबल आसुत जल (DDH 2 हे) के साथ पतला। काम कर समाधान फ़िल्टर और कमरे के तापमान पर कम से कम 10 मिनट के लिए खड़े हो जाओ।
    2. इष्टतम काटने तापमान (अक्टूबर) एपी में परिसर में जिगर एम्बेडlastic एम्बेडिंग बॉक्स। 30 मिनट के लिए -20 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर। एक ठंड microtome में 8 माइक्रोन वर्गों में यह कटौती, एक स्लाइड पर ऊतक माउंट, और 30 मिनट के लिए कमरे के तापमान पर जगह है।
    3. एक धुंधला टब के तल में एक कागज तौलिया रखें और कागज तौलिया गीला करने के लिए 10% formalin की एक छोटी राशि डाल देना। धुंधला टब में स्लाइड प्लेस और 4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए formaldehyde वाष्प में जमे हुए वर्गों को ठीक।
    4. 3 एस के लिए धुंधला टब में 60% isopropanol में स्लाइड डुबकी; एक बार पुन: दोहराएं।
    5. सभी ऊतक को कवर और 15 मिनट के लिए सेते करने के लिए स्लाइड करने के लिए तेल लाल हे काम कर समाधान की कुछ बूँदें जोड़ें। कमरे के तापमान पर प्रकाश से ऊतक को सुरक्षित रखें।
    6. 3 एस के लिए धुंधला टब में नए 60% isopropanol में स्लाइड कुल्ला; दो बार दोहराएँ।
    7. धीरे दो बार आसुत जल के माध्यम से स्लाइड कुल्ला और ऊतकों के आसपास पानी निकाल दें। ऊतक सुखाने के लिए नहीं भूलें।
    8. Hematoxylin में स्लाइड 1 मिनट के लिए रखें और 5-10 के लिए नल के पानी से कुल्ला धीरेमि। धीरे दो बार आसुत जल में स्लाइड कुल्ला और आसुत जल में रखने coverslip पर डाल करने के लिए तैयार है जब तक।
    9. माइक्रोवेव में ग्लिसरॉल जेली गर्मी और ऊतकों के शीर्ष पर कई बूँदें जगह है। धीरे शीर्ष पर coverslip जगह और देखभाल बुलबुले के लिए फार्म लेने के लिए नहीं।
    10. एक खुर्दबीन के नीचे दाग का निरीक्षण करें और 20X 40X और उद्देश्यों का उपयोग विशेषता चित्रों पर कब्जा।
  6. जिगर लिपिड का मापन
    1. एक नया 2 मिलीलीटर की प्लास्टिक अपकेंद्रित्र ट्यूब में विच्छेदित जिगर ऊतक रखें। एक homogenizer साथ पीबीएस के 1 एमएल में Homogenize और एक नया 15-एमएल ग्लास ट्यूब के लिए lysate हस्तांतरण।
    2. सख्ती 1 मिनट के लिए: (1, वी / वी 2) समाधान, भंवर मिश्रण है, और बर्फ पर 2 घंटे के लिए खड़े हो जाओ क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1650 XG पर अपकेंद्रित्र; ऊपरी परत मेथनॉल, मध्य प्रोटीन डिस्क, और नीचे क्लोरोफॉर्म और लिपिड: मिश्रण 3 परतों में अलग होना चाहिए।
    4. ट्रॅन एक गिलास पाश्चर pipet का उपयोग कर एक नया ग्लास ट्यूब में नीचे चरण sfer; नीचे अंश की हर बूंद पाने के लिए कोई जरूरत नहीं है। बर्फ पर एक तरफ ट्यूब सेट करें।
    5. 4 मिमी 2 MgCl और 1.5 क्लोरोफॉर्म एमएल के 600 μL सतह पर तैरनेवाला अंश पिछले ट्यूब और भंवर सख्ती में छोड़ दिया करने के लिए जोड़ें। 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 1650 XG पर 30 मिनट के लिए बर्फ और सेंट्रीफ्यूज पर सेते हैं।
    6. प्रथम तल चरण पाश्चर pipet का उपयोग ट्यूब के साथ नीचे चरण का मिश्रण। उच्च और मध्यम परतों त्यागें।
    7. एक 37 डिग्री सेल्सियस के स्नान में नाइट्रोजन गैस के तहत क्लोरोफॉर्म लुप्त हो जाना। 1% ट्राइटन X-100 / क्लोरोफॉर्म के 200 μL के साथ अच्छी तरह से ग्लास ट्यूब के पक्ष धो (वी / वी)। नाइट्रोजन गैस के तहत लुप्त हो जाना। अंतिम पायस बनाने के लिए अच्छी तरह से 200 भंवर DDH 2 हे की μL और साथ लिपिड भंग।
    8. कुल ट्राइग्लिसराइड (टीजी) और कोलेस्ट्रॉल (टीसी) के स्तर को मापने के लिए एक ट्राइग्लिसराइड या कोलेस्ट्रॉल किट का उपयोग करके निर्माता प्रोटोकॉल के अनुसारxref "> 3।
      नोट: के रूप में प्रोटीन की मात्रा का ठहराव 3 द्वारा निर्धारित लिपिड मूल्यों, प्रारंभिक homogenate में प्रोटीन सांद्रता के उन लोगों के लिए सामान्यीकृत कर रहे हैं।

2. प्राथमिक माउस Hepatocyte मॉडल

  1. माउस प्राथमिक hepatocytes का अलगाव
    1. 6% क्लोरल हाइड्रेट (10 μL / जी intraperitoneally) के साथ प्रत्येक माउस anesthetize।
    2. प्राथमिक hepatocytes पृथक, के रूप में पहले 10 में वर्णित है। तेल लाल हे धुंधला के लिए 6 अच्छी तरह से थाली में कोलेजन लेपित गिलास coverslips पर कोशिकाओं को विकसित। लिपिड निकासी के लिए, एक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश 10 पर कोशिकाओं बीज।
  2. सेल उपचार और तेल लाल हे धुंधला
    1. भुखमरी के माध्यम से 2 एमएल के साथ मध्यम बदलें और 24 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं। 30 मिमी ग्लूकोज और 100 एनएम इंसुलिन के साथ यह समझो। 24 घंटे के लिए एक 37 डिग्री सेल्सियस संस्कृति इनक्यूबेटर में यह सेते हैं।
    2. मध्यम aspirate। 2 पीबीएस के एमएल जोड़ें और धीरे ज़ुल्फ़ माध्यम कुल्ला करने के लिए; एक बार पुन: दोहराएं।
    3. एक रबर बैंड के साथ स्लाइड करने के लिए coverslip को ठीक करें। कोशिकाओं के बाहर सतह के अनुयायी बेनकाब। के रूप में (1.5 कदम) ऊपर वर्णित तेल लाल हे धुंधला प्रदर्शन करना।
      नोट: लिपिड संचय के बेसल स्तर एक उच्च ग्लूकोज प्लस इंसुलिन उपचार सीरम भुखमरी के बाद से प्रेरित कर रहे हैं। लिपिड बूंदों तेल लाल हे धुंधला द्वारा कल्पना कर रहे हैं।
  3. लिपिड का मापन
    1. उच्च ग्लूकोज के साथ साथ एक ही हालत में इंसुलिन (कदम 2.2.1) के साथ hepatocytes समझो। पीबीएस के 1 एमएल प्रत्येक 10 सेमी सेल संस्कृति डिश में जोड़े। कोशिकाओं परिमार्जन और उन्हें नए 15-एमएल ग्लास ट्यूब, जिसमें से 100 μL की aliquots प्रोटीन मात्रा का ठहराव के लिए नए सिरे से 1.5 एमएल ट्यूबों के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं में फसल।
    2. (: 1, वी / वी 2) कोशिकाओं के शेष 900 μL करने के लिए 4 एमएल क्लोरोफॉर्म की / मेथनॉल जोड़ें। लगभग 20 बीप के लिए Sonicate और फिर भंवर सख्ती जारी करने के लिएकोशिकाओं में लिपिड। 2 घंटे के लिए बर्फ पर मिश्रण सेते हैं। लिपिड निष्कर्षण (कदम 1.6) प्रदर्शन करना।

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Representative Results

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जैसा कि चित्र में दिखाया गया है 1 ए, माउस शरीर के वजन HFHS खिला है, जो लगभग चाउ आहार खिलाने के समूह की तुलना में अधिक 1.5 गुना के 16 सप्ताह के बाद 45 ± 1.2 जी के लिए बढ़ा दिया गया था। एनएमआर शरीर की संरचना दिखा विश्लेषण वसा द्रव्यमान और चूहों का दुबला मास संकेत कर रहे हैं (चित्रा 1 बी)। पूरे शरीर की वसा और जिगर का वितरण एमआरआई द्वारा निर्धारित किया गया है, और जीने, होश में चूहों में प्रतिनिधि छद्म रंग छवियों चित्रा 1C-डी में दिखाया जाता है। शरीर के वजन और शरीर की संरचना मापा और HFHS आहार खिलाने की प्रक्रिया के दौरान कल्पना थे।

आगे steatotic phenotypes काटना करने के लिए, चूहों बलिदान किया गया है और एक जिगर ऊतकीय विश्लेषण किया गया था। एच एंड ई और तेल लाल हे यकृत का धुंधला, चित्रा 2A बी में दिखाया जाता है जिसमें लिपिड बूंदों बड़ा हो जाना और अधिकांश में रिक्त स्थान पर कब्जाHFHS आहार खिलाने के 4 महीने बाद Hepatocytes। HFHS आहार खिलाया चूहों के यकृत स्टीटोसिस की डिग्री आसानी से चाउ आहार खिलाया चूहों के साथ तुलना करके कल्पना की है। ऐसे ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल के रूप में लिपिड के मुख्य घटकों, क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल निकासी (चित्रा 2 सी) के साथ मापा गया। डियो चूहों में, अतिरिक्त पोषक तत्व अधिभार की वजह से जिगर में असामान्य ट्राइग्लिसराइड संचय। एनएमआर, एमआरआई, और histological विश्लेषण से डेटा के साथ, लिपिड बयान की डिग्री कुशलता से और सही निर्धारित किया जा सकता है।

के रूप में 3 चित्र में दिखाया, प्राथमिक hepatocytes में लिपिड स्तर 24 घंटे के लिए उच्च ग्लूकोज प्लस इंसुलिन से प्रेरित थे। संचित लिपिड बूंदों तेल लाल हे धुंधला (चित्रा 3) के द्वारा निर्धारित किया गया है, और मात्रात्मक लिपिड विश्लेषण बाद में इस्तेमाल किया गया था hepatocytes में ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल के स्तर (चित्रा 3 बी) को मापने के लिए। इस पर आधारितमॉडल, आनुवंशिक संशोधन या hepatocytes में लिपिड homeostasis पर दवा उपचार के प्रभाव के लिए एक कुशल और तेजी से रास्ते में जांच की जा सकती है।

चित्र 2
चित्रा 1. उच्च वसा, उच्च सुक्रोज आहार (HFHS) चूहों में मोटापा और यकृत स्टीटोसिस बढ़ जाती है। आठ सप्ताह के एक पुरुष C57BL / 6 चूहों एक चाउ या 8 सप्ताह और 16 सप्ताह के लिए क्रमश: HFHS आहार पर खिलाया गया। चूहों के (ए) शरीर के वजन। चूहों का (बी) शरीर रचना। (सी - डी) प्रतिनिधि चुंबकीय अनुनाद माउस और जिगर की छवि। ग्रे पैमाने पर छवि में सफेद क्षेत्र, वसा को इंगित करता है, जबकि छद्म रंग छवि में लाल क्षेत्र वसा इंगित करता है। डेटा मानक त्रुटि (SEM) ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, एन = 5-8। * पी <0.05 बनाम चाउ आहार खिलाया चूहों। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। STATISTICAएल विश्लेषण एक unpaired, दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2. एक HFHS आहार के साथ खिलाया चूहों में यकृत स्टीटोसिस का विश्लेषण। आठ सप्ताह के एक पुरुष C57BL / 6 चूहों एक चाउ या 8 सप्ताह और 16 सप्ताह के लिए क्रमश: HFHS आहार पर खिलाया गया। (ए) enterocoelia और जिगर के प्रतिनिधि सकल आकृति विज्ञान। (बी) के प्रतिनिधि एच ई और तेल लाल हे धुंधला (स्केल सलाखों: 50 माइक्रोन)। तेल लाल हे वसा और वसा तटस्थ दाग, और लाल डॉट्स hepatocytes में जमा लिपिड बूंदों से संकेत मिलता है। (सी) क्लोरोफॉर्म / मेथनॉल विधि का उपयोग जिगर लिपिड एक्सट्रेक्शन की कुल ट्राइग्लिसराइड और कोलेस्ट्रॉल के स्तर। डेटा के लिए टी सामान्यीकृत थावह जिगर वजन, और मानक त्रुटि (SEM) ± मतलब के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैं, एन = 5-8। * पी <0.05 चूहों चाउ आहार के साथ खिलाया बनाम। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एक unpaired, दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्रा 3. यकृत स्टीटोसिस उच्च ग्लूकोज प्लस इंसुलिन के संपर्क में माउस प्राथमिक hepatocytes में प्रेरित किया है। बिना या ग्लूकोज और इंसुलिन के साथ इलाज किया सुसंस्कृत प्राथमिक hepatocytes (ए) तेल लाल हे धुंधला हो जाना, संकेत के रूप में (पैमाने सलाखों: 50 माइक्रोन)। (बी) के प्राथमिक hepatocytes में ट्राइग्लिसराइड का स्तर मापा और प्रोटीन एकाग्रता के लिए सामान्यीकृत किया गया था। डेटा मतलब ± के रूप में प्रतिनिधित्व कर रहे हैंमानक त्रुटि (SEM)। * पी <0.05 नियंत्रण समूह की तुलना में। त्रुटि सलाखों SEM प्रतिनिधित्व करते हैं। सांख्यिकीय विश्लेषण एक unpaired, दो पूंछ छात्र के टी-परीक्षण का उपयोग किया गया था। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

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NAFLD कि उपापचयी सिंड्रोम, मोटापा, इंसुलिन प्रतिरोध, या टाइप 2 मधुमेह (T2DM) 11 के साथ जुड़ा हुआ है प्रगतिशील जिगर रोगों की एक श्रृंखला है। NAFLD की बानगी स्टीटोसिस, hepatocytes में लिपिड का संग्रह है। इधर, तरीकों की एक स्पेक्ट्रम phenotypes और डियो चूहों और माउस प्राथमिक hepatocytes का उपयोग कर यकृत स्टीटोसिस के मापदंडों को चिह्नित करने के लिए प्रस्तुत किया है। यह प्रक्रिया NAFLD और अन्य संबंधित चयापचय रोगों की आणविक तंत्र को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी हो सकता है।

Vivo में इन विट्रो assays में मेल है, इन तरीकों में व्यापक विश्लेषण और यकृत स्टीटोसिस का आकलन प्रदान करते हैं। वर्तमान में, NAFLD के पशु मॉडल मुख्य रूप से आनुवंशिक और पोषक तत्वों की मॉडल से मिलकर बनता है। HFHS यहां इस्तेमाल किया आहार आधुनिक आहार शैली की नकल करने का इरादा और चूहों में मोटापा और यकृत स्टीटोसिस प्रेरित करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, विकास में आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिएलिपिड ढील की pment, सेल आधारित परख पशु अध्ययन से अधिक स्पष्ट लाभ, आनुवंशिक उत्परिवर्तन या औषधीय उपचार के द्वारा आसान हेरफेर, साथ ही अपेक्षाकृत कम लागत और समय प्रतिबद्धताओं सहित शामिल हैं। माउस प्राथमिक hepatocytes में यकृत स्टीटोसिस उत्पन्न करने के लिए, ग्लूकोज प्लस इंसुलिन के उच्च सांद्रता लिपिड संचय, जो एक उपन्यास और नकल करने के लिए इन विवो आहार प्रेरित hyperglycemia और hyperinsulinemia विट्रो मॉडल में कुशल है प्रेरित करने के लिए इस्तेमाल कर रहे हैं। इस उपचार में भी इस तरह HepG2 कोशिकाओं के रूप में अन्य यकृत सेल लाइनों, के लिए लागू है। यह देखते हुए कि आनुवंशिक रूप से संशोधित hepatocytes दवा उपचार की एक किस्म के लिए पहुंच रहे हैं, इन विट्रो steatotic मॉडल यहाँ वर्णित सीमा और gain- और नुकसान के समारोह के दृष्टिकोण का उपयोग कर पशु मॉडल की पीढ़ी के लिए समय लेने वाली कदम पर काबू।

शरीर की संरचना का विश्लेषण करती है एनएमआर और एमआरआई सहित, पर गैर इनवेसिव और वास्तविक समय डाटा उपलब्ध कराने केपूरे शरीर और जिगर में लिपिड। यह एक गैर इनवेसिव, समय की बचत, visualizable, और अर्द्ध गुणात्मक माप है। इसके अलावा, शरीर रचना विश्लेषण की सटीकता बहुत अन्य ऊतकीय और जैव रासायनिक माप के संयोजन से सुधार किया जा सकता है। यह विवो में और एच एंड ई धुंधला, तेल लाल हे धुंधला हो जाना, और लिपिड माप, जो सभी के निदान और यकृत स्टीटोसिस ग्रेडिंग के लिए सोने का मानक माप कर रहे हैं का उपयोग कर इन विट्रो में यकृत स्टीटोसिस निर्धारित करने के लिए महत्वपूर्ण और आवश्यक है।

वर्तमान पद्धति की सीमाओं में से एक है, जब साधारण स्टीटोसिस हेपेटाइटिस, फाइब्रोसिस, और अंत में, सिरोसिस और लीवर कैंसर की प्रगति सूजन और कोलेजन बयान को मापने के लिए अपनी असमर्थता है। यह देखते हुए आहार प्रेरित मोटे चूहों नैश के विकास के लिए एक कम जोखिम है कि, वर्तमान प्रोटोकॉल DIO चूहों में यकृत स्टीटोसिस का मूल्यांकन करने के लिए पर्याप्त है। हालांकि, नैश की हालत, ऐसे प्लाज्मा alani के रूप में अन्य जैव रासायनिक माप, मेंne aminotransferase (ALT) और aspartate aminotransferase (एएसटी) के स्तर, उपयोग किया जाना चाहिए।

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Disclosures

लेखकों घोषणा की कि वे कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है कि।

अनुदान: यह काम चीन के राष्ट्रीय प्राकृतिक विज्ञान फाउंडेशन (नं 81270930, 31471129, 31671224 और) और सौ किक्कार चीनी विज्ञान अकादमी के कार्यक्रम (2013OHTP04) YL करने से अनुदान द्वारा समर्थित किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

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References

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के अनुकूलित विश्लेषण<em&gt; Vivo</em&gt; और<em&gt; इन विट्रो</em&gt; यकृत steatosis
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Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

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