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Medicine

의 최적화 분석 doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

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비만은 선진국과 개발 도상국의 급성장 건강 문제입니다. NAFLD 환자 (1) 30 % 내지 100 범위의 유병률 자주 알코올성 지방 간 질환 (NAFLD)와 연관된 공존하는 조건 중 하나 인 것으로보고되었다. 인해 지방간, 비만의 강한 상관 관계,식이 유도 비만 (DIO) 마우스 모델은 광범위 NAFLD 2, 3, 4, 5, 6의 개발과 관련된 복잡한 분자 메커니즘을 연구하는데 사용된다. 간 지방증은 NAFLD의 초기 단계이며, 비 알코올성 지방 간염 (NASH), 간경변, 궁극적으로 간암 7 진행할 수있다. 따라서,이 방법의 전반적인 목표는 간 steatotic 조건의 동물 및 세포 모델을 생성하고 홍보하는 것입니다효율적이고 정확한 지질 측정 ovide 상세한 프로토콜. 이 모델과 측정은 또한 인슐린 저항성과 제 2 형 당뇨병 등의 대사 질환의 연구에 유용하다.

비만 NAFLD, 고지방위한 중요한 위험 인자 중 하나 인 것으로 확인 된 바와 같이, 높은 크로스 다이어트 서양식 고지방식이를 모방 (HFHS)는 마우스에서 비만을 유도하기 위해 사용된다. 이어서, 간 지방증의 정도는 다양한 방법을 사용하여 평가 될 수있다. 먼저, 체중 및 핵 자기 공명 (NMR)와 신체 조성 분석 시간 동안 먹이 지질 축적을 나타낸다. 지방 질량과 근육량은 비 침습적 실시간 방식으로 정량화 할 수있다.

또한, 자기 공명 영상 (MRI)는 전신 및 지방 간 분포 모두를 표시하기 위해 사용된다. 자기 공명 영상의 분석의 계조 신호는 명료 한 의사 컬러 화상으로 변환하고, 강도 수그레이 스케일과 컬러는 헤미 - 정량화이다. 이 기술은 살아있는 동물에서 지방 축적의 측정에 독특한 이점을 제공한다. 둘째, 간의 조직 학적 분석 간 지방증을 결정하기 위해 가장 많이 사용되는 방법이다. 오일 레드 O 염색은 간세포에서 지질 소적의 크기와 위치를 나타내고있다 Hematoxylin & Eosin 염색 얼룩, 예컨대 간세포 형태와 같은 식세포 침윤 학적 정보를 제공한다. 셋째, 클로로포름 / 메탄올을 사용하여 추출 지질 함량 분석 간 지질의 정확한 정량적 측정이다. 총 트리글리세리드 및 콜레스테롤 수준은 생화학 적 방법으로 측정 할 수있다. 중요한 지질 추출 분석 및 오일 레드 O 염색은 또한 유전자 조작 또는 약학 간세포 치료에 사용될 수있다.

본 방법의 장점은 간 steatotic 모델을 생성하는 여러 최적화 방법의 사용이다 그종합적 생체 내시험관 내에서 모두 표현형을 특성화. DIO 마우스 모델은 인간 지방간 질환의 병리 및 대사 표현형 요점을 되풀이 할 수있다. 인간의 다른 대사 매개 변수가 아니라 8로이 모델에 복제 할 수 있습니다. 높은 포도당 플러스 인슐린에 응답 steatotic 간세포 모델의 생성에 유용하고 효율적이며, 많은 비용과 시간이 소요 마우스 연구의 한계를 극복한다. 함께 찍은, 이러한 방법은 영양 과부하시 간 지질 장애와 인슐린 저항성의 연구에 대한 충분하고 필수적이다.

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Protocol

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모든 동물 실험 프로토콜은 생물 과학에 대한 영양 과학 연구소, 상하이 연구소, 중국 과학 아카데미 (중국 상하이)에서 기관 동물 관리 및 사용위원회에 의해 승인되었습니다.

1. DIO 마우스 모델

  1. HFHS 공급
    1. 40 킬로 칼로리 %의 지방과 40 킬로 칼로리 %의 자당을 포함하는 HFHS으로 8 주 된 수컷 C57BL / 6 마우스 피드. 12 시간 어두운 조명주기 조건을 수용.
    2. 네 여섯 주 동안 HFHS 다이어트 수유 상태에서 마우스를 유지합니다. 체중 매주을 확인합니다.
  2. 신체 조성 분석 및 의사 컬러 화상 해석
    1. 신체 조성 분석기 분석 생쥐 대상.
      1. 의 플라스틱 튜브에 의식하지 마취 마우스를 고정합니다. 이전이 설명 된 바와 같이, 본체 체지방량, 근육량 및 NMR 시스템을 이용하여 유체를 측정한다.
    2. MRI를 시스템을 사용하여 각 마우스의 몸 전체를 스캔합니다.
      1. 복강 내 주사 (25 μL / g)을 통해 1 % AVERTIN 가진 쥐를 마취 전문 유리관에서 촬상 분석을 수행한다.
        참고 : 이미지의 과정은 각 마우스에 대한 약 0.5 시간 동안 지속됩니다. 측정이 완료되면, 그 케이지에 마우스를 반환한다.
    3. 지느러미, 중간, 복부 층에서 마우스의 전체 몸을 스캔; 수직 방향 간 스캔. 0.55 T 자석과 같은 수단이 매개 변수를 사용하여 스캔 K 공간 = 192 X 256 μm의 섹션 두께 = 3mm, TE = 14.8 MS, TR = 400 밀리, FOVRead = 100mm, FOVPhase = 100mm, 그리고 수를 = 마우스의 모든 그룹에 대해 동일한 자성 조건을 사용하여 제 스캔.
    4. 신호 강도 9 항에있어서, 의사 컬러 화상에 계조 화상 약도.
  3. 마우스 안락사
    1. dissecti 소독이러한 집게와 가위로 NG 도구.
    2. 종이 타월에 충분한 이소 플루 란을 붓고 및 이소 플루 란은 유리 항아리에 휘발 할 수 있습니다. 쥐가 이소 플루 란에 의해 안락사되어 있는지 확인합니다.
    3. 운영 테이블에 마우스를 고정합니다. 75 % 에탄올로 각각 복부 스프레이 가위를 사용하여 칼 모양 프로세스 진피에 절개를하고, 복막을 노출시키기 위해 손으로 중앙선을 통해 길이 진피 찢어.
    4. 집게와 칼 모양의 과정을 클램프와 내장을 노출 리브의 바닥을 통해 복막 가로를 잘라.
    5. 심장 천자에 의해 EDTA 코팅 튜브에 혈액을 수집합니다.
    6. 간을 따라 다이어프램을 잘라 조심스럽게 좋은 가위를 사용하여 enterocoelia에서 간을 제거합니다. 다음과 같은 지질 측정 간 조직의 세 가지를 잘라 : H & E 염색을위한) 6 × 3 × 3mm, b)는 오일 레드 O 염색을위한 6 × 3 × 3mm, 클로로포름에 대한 간 C) 20 ~ 40 밀리그램 / 메탄올 추출.
  4. H & E 염색
    1. 밤새 4 ° C에서 4 % 인산 완충 포르말린 아세테이트 간을 수정 한 후 파라핀 왁스를 포함.
    2. 이전에 3, 10 설명한 바와 같이, 파라핀 섹션 (5 μm의)를 잘라 H & E 염색 용 유리 슬라이드에 그들을 탑재합니다.
  5. 오일 레드 O 염색법
    1. 리젠트 준비
      1. 10 % 포르말린, 60 % 이소프로판올, 헤 마톡 실린 및 글리세롤 젤리 오일 레드 O 작업 솔루션을 준비합니다. 이소프로판올 100 mL로 오일 레드 O 분말 0.5 g을 용해시키고, 그 0.5 % 스톡 용액을 만들기 위해 60 ° C의 욕에서 가열한다.
      2. 2 비율 (DDH 2 O 3 원액의 용액 2 ㎖) : 3에서 두 번 증류수 (DDH 2 O)로 희석. 작업 용액을 여과하고, 실온에서 적어도 10 분 동안 정치하자.
    2. AP 통신에 최적의 절삭 온도 OCT () 화합물의 간을 포함lastic 삽입 상자. 30 분 동안 -20 ℃로 동결. , 동결 마이크로톰 8 μm의 섹션으로 잘라 슬라이드에 조직을 탑재하고, 실온에서 30 분 동안 배치.
    3. 염색 욕조의 바닥에 종이 타월을 놓고, 종이 타월 습윤 10 % 포르말린 소량 붓는다. 염색 욕조에 슬라이드를 넣고 4 ℃에서 5 분 동안 포름 알데히드 증기에 고정 된 부분을 수정합니다.
    4. 3 초 동안 염색 욕조에 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 찍어; 한 번 반복합니다.
    5. 모든 조직을 커버하고 15 분 동안 배양 슬라이드에 오일 레드 O 작업 용액 몇 방울을 추가합니다. 실온에서 빛으로부터 조직을 보호합니다.
    6. 3 초 동안 염색 욕조에 새 60 % 이소프로판올에 슬라이드를 씻어; 두 번 반복합니다.
    7. 조심스럽게 두 번 증류 물을 통해 슬라이드를 씻어 조직 주위에 물을 제거합니다. 조직을 건조하지 않도록해야합니다.
    8. 1 분 동안 헤 마톡 실린에서 슬라이드를 놓고 5-10에 대한 수돗물로 부드럽게 씻어분. 조심스럽게 두 번 증류수에 슬라이드를 씻어하고 coverslip에 넣어 준비가 될 때까지 증류수에 보관하십시오.
    9. 전자 레인지에서 글리세롤 젤리를 가열하고, 조직의 상단에 몇 방울을 배치합니다. 조심스럽게 상단에 커버 슬립을 배치하고 거품을 형성하기 위해주의 바랍니다.
    10. 현미경으로 얼룩을 관찰하고 20X 및 40X 목표를 사용하여 특성 사진을 캡처합니다.
  6. 간 지질의 측정
    1. 새로운 2 mL의 플라스틱 원심 관의 해부 간 조직을 놓습니다. 균질화와 PBS의 1 mL에 균질화하고 새로운 15 mL 유리 튜브 해물 옮긴다.
    2. 적극적으로 1 분 동안 (1, v / V를 2) 솔루션, 소용돌이 혼합물 및 얼음에 2 시간 동안 서 있도록 클로로포름 / 메탄올 5 mL를 추가합니다.
    3. 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 원심 분리기; 상부 메탄올 층 중간 단백질 디스크 및 하부 클로로포름 지질 : 혼합물을 3 층으로 분리한다.
    4. 트란 유리 파스퇴르 피펫을 사용하여 새 유리관에 바닥 sfer 단계; 바닥 분획의 방울을받을 필요가 없다. 얼음에 옆으로 튜브를 설정합니다.
    5. 적극적으로 이전 튜브와 소용돌이에 남아있는 상층 부분에 클로로포름 4 밀리미터의 MgCl 2, 1.5 mL를 600 μL를 추가합니다. 4 ° C에서 10 분 동안 1,650 XG에 30 분 동안 얼음과 원심 분리기에 품어.
    6. 파스퇴르 피펫을 이용하여 제 1 바닥 상 관 바닥 상을 결합한다. 상부 및 중간 계층을 폐기하십시오.
    7. 37 °의 C 조에서 질소 가스 하에서 클로로포름을 증발. 1 % 트리톤 X-100 / 클로로포름 200 μL 충분히 유리관의 측면 워시 (V / V). 질소 기체 하에서 증발시켰다. 최종 에멀젼을 잘 200 DDH 2 O의 μL와 소용돌이와 지질을 용해.
    8. 제조사의 프로토콜에 따라 중성 지방 또는 콜레스테롤 키트를 사용하여 총 중성 지방 (TG) 및 콜레스테롤 (TC) 수준을 측정외부 참조 "> 3.
      주 : 단백질 정량 (3)에 의해 측정 된 지질 값은 초기 파쇄 액의 단백질 농도들로 정규화한다.

2. 기본 마우스 간세포 모델

  1. 마우스 차 간세포의 분리
    1. 6 % 클로 랄 하이드레이트 (복강 10 μL / g)와 각 마우스를 마취.
    2. 이전 10 설명 된대로 기본 간세포를 분리합니다. 오일 레드 O 염색을위한 6 웰 플레이트에 콜라겐 코팅 커버 글라스에 세포를 성장. 지질 추출, 10 cm 세포 배양 접시 (10)에 세포를 시드.
  2. 세포 치료 및 오일 레드 O 염색법
    1. 기아 매체의 2 mL를 매체를 교체하고 24 시간 동안 37 ° C에서 품어. 30 mM의 포도당과 100 nM의 인슐린으로 치료. 24 시간 동안 37 ° C 형 문화 인큐베이터에서 그것을 품어.
    2. 매체를 기음. 2 mL의 PBS의 추가 매체를 씻어 부드럽게 소용돌이 친다; 한 번 반복합니다.
    3. 고무 밴드와 슬라이드에 커버 슬립을 수정합니다. 외부 표면에 부착 세포를 노출. (단계 150) 전술 한 바와 같이 오일 레드 O 염색을 수행한다.
      참고 : 지질 축적의 기초 수준은 혈청 기아 후 높은 포도당 플러스 인슐린 치료를 자극한다. 지질 방울 오일 레드 O 염색으로 가시화된다.
  3. 지질의 측정
    1. 동일한 조건에서 높은 포도당 플러스 인슐린 (단계 2.2.1)와 간세포 치료. 각 10 cm 세포 배양 접시에 PBS 1 ML을 추가합니다. 세포를 긁어하고 100 μL의 분취 단백질 정량 신선한 1.5mL 용량 튜브에 전송되는 새로운 15 mL 유리 튜브로 수확.
    2. 세포의 나머지 900 μL에 (1, v / V를 2 개) 4 mL의 클로로포름 / 메탄올을 추가합니다. 대략 20 비프 음에 대한 초음파 처리 한 다음 소용돌이 적극적 출시세포의 지질. 2 시간 동안 얼음 혼합물을 품어. 지질 추출 (단계 1.6)을 수행합니다.

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Representative Results

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도 1a에 도시 된 바와 같이, 마우스의 체중은 약 차우 다이어트 공급 군보다 1.5 배이다 HFHS 공급, 16 주 후에 45 ± 1.2 g으로 증가시켰다. 핵 자기 공명 신체 조성은 지방 질량과 쥐의 근육량을 보여주는 분석하면 (그림 1B) 표시됩니다. 몸 전체와 간장의 지방 분포는 MRI에 의해 결정하고, 라이브, 의식 생쥐의 대표적인 의사 컬러 이미지는 그림 1C-D에 표시됩니다. 체중 및 신체 조성 측정하고 HFHS 다이어트 공급 과정에서 가시화 하였다.

상기 steatotic 표현형 해부, 생쥐는 희생시키고 간 조직 학적 분석을 수행 하였다. 간을의 H & E와 오일 레드 O 염색, 그림 2A-B에 표시되는 지질 방울은 더 큰 성장과 대부분의 공간을 점유HFHS 다이어트 공급 4 개월 간세포. HFHS 다이어트 먹인 쥐의 간 지방증의 정도는 쉽게 차우 다이어트 먹인 쥐와 비교하여 시각화한다. 이러한 중성 지방 및 콜레스테롤과 같은 지질의 주요 구성 요소는, 클로로포름 / 메탄올 추출 (도 2C)로 측정 하였다. DIO 마우스에서 과잉 영양소 과부하 간에서 비정상적인 트리글리세리드 축적을 야기. NMR, MRI, 조직 학적 분석 데이터와 지질 침착 정도를 정확하고 효율적으로 측정 할 수있다.

도 3에 도시 바와 같이, 일차 간세포의 지질 농도를 24 시간 동안 높은 포도당 플러스 인슐린에 의해 유도 하였다. 축적 된 지질 방울 오일 레드 O 염색법 (도 3a)에 의해 결정하고, 지질 정량 분석은 간세포의 중성 지방 및 콜레스테롤 수준 (도 3b)을 측정하기 위해 계속해서 사용 하였다. 이를 바탕으로모델, 유전 적 변형 또는 간세포 지질 항상성에서 치료 약제의 효과는 효율적이고 신속하게 조사 할 수있다.

그림 2
그림 1. 높은 지방, 높은 설탕 다이어트 (HFHS)은 생쥐에서 비만과 간 지방증을 증가시킨다. 8 주 된 수컷 C57BL가 / 6 마우스는 각각 팔주 16 주에 대한 우 또는 HFHS 다이어트에 공급 하였다. 쥐의 (A) 체중. 쥐의 (B) 바디 조성물. (C - D) 마우스와 간 대표 자기 공명 이미지입니다. 의사 - 컬러 화상의 적색 영역은 지방을 나타내는 동안 그레이 스케일 이미지에서 백색 영역은 지방을 나타낸다. 데이터는 N = 5-8, 표준 오차 (SEM) 평균 ±로 표시됩니다. * P <우 다이어트 먹인 쥐에 비해 0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. STATISTICA리터 분석 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 2
HFHS 다이어트가 공급 생쥐의 간 지방증 그림 2. 분석. 8 주 된 수컷 C57BL가 / 6 마우스는 각각 팔주 16 주에 대한 우 또는 HFHS 다이어트에 공급 하였다. (A) enterocoelia 간 대표 심한 형태. (B) 대표 H & E와 오일 레드 O 염색 (스케일 바 : 50 μm의). 오일 레드 O는 지방과 중성 지방을 얼룩, 그리고 빨간색 점은 간세포에 축적 된 지질 방울을 나타냅니다. (C) 클로로포름 / 메탄올 방법을 사용하여 간 지질 추출 총 중성 지방 및 콜레스테롤 수준. 데이터는 T로 정규화 된그는 간 무게, 표준 오차 (SEM) 평균 ±로 표시됩니다, N = 5-8. * P <우 다이어트를 먹이 쥐에 비해 0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계 분석은 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
그림 3. 간장의 지방 축적은 높은 혈당 플러스 인슐린에 노출 된 마우스 차 간세포에서 유도된다. 없이 또는 포도당과 인슐린 치료를 배양 차 간세포의 (A) 오일 레드 O 염색, 표시 등 (스케일 바 : 50 μm의). (B) 일차 간세포의 트리글리 세라이드 수준을 측정하여 단백질 농도로 표준화되었다. 데이터는 평균 ±로 표현되는표준 오차 (SEM). * 대조군 대비 p <0.05. 오차 막대는 SEM을 나타낸다. 통계 분석은 부대, 두 꼬리 학생의 t-test를 이용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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NAFLD 대사 증후군, 비만, 인슐린 내성이나 2 형 당뇨병 (T2DM) 11와 연관된 프로그레시브 간 질환의 시리즈이다. NAFLD의 특징은 지방간, 간세포에 지방의 축적이다. 여기서, 방법의 스펙트럼은 표현형 및 DIO 마우스 및 마우스 차 간세포를 사용하여 간 지방증의 파라미터를 특성화하기 위해 제공된다. 이 절차는 비 알코올성 지방간 질환 및 기타 관련 대사 질환의 분자 메커니즘을 규명하는 것이 도움이 될 수 있습니다.

생체 내생체 외 분석에서 결합,이 방법은 종합적인 분석과 간 지방증의 평가를 제공합니다. 현재 NAFLD의 동물 모델은 주로 유전과 영양 모델로 구성되어 있습니다. 여기에 사용 된 HFHS 다이어트는 현대의 다이어트 스타일을 모방하도록 구성 및 쥐에서 비만과 간 지방증을 유발하기에 충분하다. 그러나, develo의의 분자 메커니즘을 연구하는지방 규제 완화의 pment은 세포 기반 분석은 유전자 돌연변이 나 약물 치료로 쉽게 조작뿐만 아니라 상대적으로 낮은 비용과 시간 약속을 포함하여 동물 실험을 통해 확실한 장점을 포함하고 있습니다. 마우스 차 간세포에서 간 지방증을 생성하려면, 포도당 플러스 인슐린의 높은 농도는 소설과 생체 규정에 의한 고혈당 및 고 인슐린 혈증을 모방하는 체외 모델의 효율적인 지질 축적을 유도하는 데 사용됩니다. 이러한 처리는 또한 인 HepG2 세포 간 다른 세포주에 적용 할 수있다. 유 전적으로 변형 된 간세포는 약제 처리의 다양한 접근임을 감안할 때, 여기에 설명 된 시험 관내 steatotic 모델 제한 및 이득 - 및 기능 상실 방법을 이용하여 동물 모델의 생성에 시간이 걸리는 단계를 극복한다.

신체 조성은, NMR 분석 및 MRI을 포함에서 비 침습적 실시간 데이터를 제공 할몸 전체 및 간 지질. 이것은 비 침습성, 시간 절약, visualizable, 반 정량적 측정이다. 또한, 신체 조성 분석의 정확도는 상당히 다른 조직 학적 및 생화학 적 측정을 결합하여 개선 될 수있다. 이는 생체 내 및 진단 및 간 지방증 그레이딩 골드 표준 측정은 모두 H & E 염색, 오일 레드 O 염색법, 및 지질의 측정을 이용하여 시험 관내에서 간 지방증을 결정하는데 중요하고 필요하다.

본 발명의 방법의 한계 중 하나는 단순 지방증 간염, 섬유증, 결국 간경화와 간암으로 이행 될 때 염증 콜라겐 침착을 측정 할 수 없다는 점이다. 식이 유도 된 비만 마우스 NASH의 발전을위한 낮은 위험을 감안할 때, 현재 프로토콜 DIO 마우스에서 간 지방증을 평가하기에 충분하다. 그러나, NASH의 상태, 플라즈마 ALANI 다른 생화학 적 측정에북동 아미노 전이 효소 (ALT)와 아스 파르 테이트 아미노 전이 효소 (AST) 수치가 이용되어야한다.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

자금 조달 :이 작품은 중국 국가 자연 과학 재단 (제 81270930, 31471129 및 31671224)와 백 재능 중국 과학 아카데미의 프로그램 (2013OHTP04) YL에 대한 보조금에 의해 지원되었다

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

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References

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의 최적화 분석<em&gt; 생체</em&gt; 및<em&gt; 체외</em&gt; 간 지방증
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Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

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