Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Optimalisert Analyse av doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fedme er et voksende helseproblem i utviklede og utviklingsland. Det har blitt rapportert å være en av de andre sykdomstilstander ofte forbundet med alkoholisk fettleversykdom (NAFLD), med en utbredelse som varierer mellom 30 og 100 prosent i NAFLD pasienter 1. På grunn av den sterke korrelasjonen mellom fettlever og fedme, blir diett-induserte overvektige (DIO) musemodeller mye brukt til å studere de komplekse molekylære mekanismene forbundet med utvikling av NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatose er den tidligste fasen av NAFLD, og det kan utvikle seg til alkoholisk steatohepatitis (NASH), skrumplever, og til slutt, leverkreft 7. Derfor det overordnede målet med denne metoden er å generere dyre- og cellemodeller av lever steatotic forhold og foOvide detaljerte protokoller for effektiv og nøyaktig lipid måling. Disse modellene og målinger er også nyttige for undersøkelse av andre metabolske lidelser, så som insulinresistens og type 2 diabetes.

Som fedme er kjent for å være en av de viktigste risikofaktorer for NAFLD, en høy-fett, er høy sukrose diett (HFHS) som imiterer vestlig stil fettrik diett brukes til å indusere fedme hos mus. Deretter kan graden av leversteatose vurderes ved hjelp av ulike metoder. Først, kroppsvekt og kroppssammensetning analyse med kjernemagnetisk resonans (NMR) viser lipidakkumulering under mating tid. Den fettmasse og mager masse kan kvantifiseres i en ikke-invasiv og real-time måte.

I tillegg er magnetisk resonansavbildning (MRI) som brukes for å vise både hel-legeme og leveren fordelingen av fett. Den gråtoner signal av MRI-analysen kan bli omdannet til en leselig pseudo-fargebilde, og intensiteten avgråtoner og farge er hemi-kvantifiserbare. Denne teknologien gir unike fordeler for måling av lipidakkumulering i levende dyr. For det andre, histologisk analyse av leveren er den mest brukte metode for å bestemme hepatisk steatose. Hematoxylin og eosin (H & E) farging gir histologiske informasjon, som hepatocytt morfologi og makrofag infiltrering, mens Oil Red O farging viser størrelsen og plasseringen av lipid-dråper i hepatocytter. For det tredje, lipidinnholdet analyse ved anvendelse av kloroform / metanol ekstraksjon er en nøyaktig og kvantitativ måling av leverlipider. Totalt triglyserid og kolesterolnivåer kan måles med biokjemiske metoder. Viktigere, kan også brukes til lipid ekstraksjon analyse og Oil Red O farging i genetisk manipulert eller farmasøytisk behandlede hepatocytter.

Fordelen med den foreliggende fremgangsmåte er utnyttelsen av flere optimaliserte fremgangsmåter for å generere hepatiske steatotic modellerog til omfattende karakterisere fenotyper både in vivo og in vitro. De DIO musemodeller kan rekapitulere de patologi og metabolske fenotyper av menneskelig fatty leversykdom. Andre metabolske parametere hos mennesker kan replikeres i denne modellen også 8. Genereringen av den steatotic hepatocytter modell som reaksjon på høy glukose pluss insulin er effektiv, nyttig og overvinner begrensningen av kostbart og tidkrevende arbeid mus. Samlet utgjør disse metodene er tilstrekkelig og viktig for studier av lever lipid dysfunksjon og insulinresistens under nærings overbelastning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alle dyr eksperimentelle protokoller ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk komité ved Institutt for Nutritional Sciences, Shanghai Institutes for Biological Sciences, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina).

1. DIO mus Modell

  1. HFHS fôring
    1. Mate åtte uker gammel mannlig C57BL / 6 mus med en HFHS som inneholder 40 kcal% fett og 40 kcal% sukrose. Huse dem i 12 timer mørke-lys syklus vilkår.
    2. Hold mus i HFHS diett-fôring betingelse for fire til seksten uker. Kontroller kroppsvekt ukentlig.
  2. Kroppssammensetning analyse og pseudo-farge bildeanalyse
    1. Emne musene til en kroppssammensetning analysator analyse.
      1. Sikre bevisste, ikke bedøvet mus i et plastrør i. Mål kroppen fettmasse, fettfri masse, og væsker ved hjelp av en NMR-system, som beskrevet tidligere to.
    2. Skanne hele kroppen av hver mus ved hjelp av en MR-system.
      1. Anesthetize mus med 1% avertin via intraperitoneal injeksjon (25 pl / g) og utfører bildeanalyse i spesialiserte glassrør.
        MERK: Prosessen med bildebehandling varer i nesten 0,5 timer for hver mus. Når målingen er fullført, returnerer musene til deres bur.
    3. Skann hele likene av mus i dorsal, midtre og ventral lag; skanne leveren i vertikal retning. Bruk en 0,55 T magnet og følgende instrumentelle parametere: K plass = 192 x 256 mikrometer, seksjon tykkelse = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, og antall skanninger = 8. Scan bruker samme magnetiske tilstanden for alle grupper av mus.
    4. Kartlegge gråtonebilde på en pseudo-fargebilde i henhold til signalintensitet 9.
  3. mus dødshjelp
    1. Steril dissecting verktøy, for eksempel tenger og sakser.
    2. Hell tilstrekkelig isofluran på et papirhåndkle og la isofluran fordampe i en glasskrukke. Sørg for at musene blir avlivet av isofluran.
    3. Fest mus på et operasjonsbord. Spray hver magen med 75% etanol, lage et snitt i dermis av xiphoid prosessen ved hjelp av saks, og rive dermis på langs gjennom midtlinjen med hendene for å avsløre bukhinnen.
    4. Klem xiphoid prosessen med pinsett og kuttet peritoneum i bredden ved bunnen av ribbene for å eksponere den indre organer.
    5. Samle blod i EDTA-belagte rør av hjertestans punktering.
    6. Skjær membranen langs leveren og fjerne leveren fra enterocoelia med lekkert saks nøye. Skjær tre stykker av levervev for følgende lipid målinger: a) 6 x 3 x 3 mm for H & E-farging, b) 6 x 3 x 3 mm for Oil Red O-farging, og c) 20-40 mg av leveren for kloroform / metanol utvinning.
  4. H & E farging
    1. Feste leveren i 4% fosfat-bufret formalin-acetat ved 4 ° C over natten og deretter legge den i parafinvoks.
    2. Skjær parafinsnitt (5 um), og montere dem på objektglass for H & E-farging, som tidligere beskrevet 3, 10.
  5. Olje Red O farging
    1. Regent forberedelse
      1. Forbered Oil Red O arbeidsløsning med 10% formalin, 60% isopropanol, Hematoxylin, og glycerol gelé. Oppløs 0,5 g Oil Red O pulver med 100 ml isopropanol og varme den i et 60 ° C bad for å lage en 0,5% stamløsning.
      2. Fortynn med dobbelt destillert vann (DDH 2 O) ved en 3: 2-forhold (3 ml av stamoppløsning og 2 ml DDH 2 O). Filtrer den arbeidsløsning og la stå i minst 10 min ved romtemperatur.
    2. Embed leveren i optimal skjæring temperatur (OCT) compound i aplastic embedding boks. Fryses ved -20 ° C i 30 min. Skjær den i 8-mikrometer seksjoner i en fryser mikrotom, montere vev på et lysbilde, og plassere den i romtemperatur i 30 min.
    3. Plasser et papirhåndkle i bunnen av en farging kar og hell en liten mengde på 10% formalin våt papirhåndkle. Plasser lysbildet i fargebadet og fikse frosne snitt i formaldehyddamper i 5 min ved 4 ° C.
    4. Dypp raset i 60% isopropanol i fargebadet for 3 s; gjenta en gang.
    5. Tilsett noen dråper olje Red O arbeidsløsning til raset for å dekke alle vev og inkuberes i 15 min. Beskytte vev mot lys ved romtemperatur.
    6. Skyll raset i nye 60% isopropanol i fargebadet for 3 s; gjenta to ganger.
    7. Skyll forsiktig raset gjennom destillert vann to ganger og fjerne vannet rundt vev. Pass på ikke å tørke vev.
    8. Plasser raset i Hematoxylin i 1 min og skyll forsiktig med vann fra springen for 5-10min. Skyll forsiktig raset i destillert vann to ganger, og holde den i destillert vann til den er klar til å sette på dekkglass.
    9. Varme opp glycerol gelé i mikrobølgeovnen og plassere flere dråper på toppen av vev. Forsiktig dekkglass på toppen og tar seg ikke å danne bobler.
    10. Observer flekken under et mikroskop og fange karakteristiske bilder med 20X og 40X mål.
  6. Måling av lever lipider
    1. Plasser dissekert levervevet i en ny to-ml plast sentrifugerør. Homogenisere i 1 ml PBS med en homogenisator og overføre lysat til en ny 15-mL glassrør.
    2. Tilsett 5 ml kloroform / metanol (2: 1, v / v) løsning, vortex blandingen kraftig i 1 min, og lar stå i 2 timer på is.
    3. Sentrifuger ved 1650 xg i 10 min ved 4 ° C; blandingen skal skilles i 3 lag: det øvre lag metanol, den midterste protein platen, og den nederste kloroform og lipider.
    4. Tran sfer bunnfasen inn i en ny glassrør ved hjelp av et glass Pasteur pipette; det er ikke nødvendig for å få hver dråpe av bunnfraksjonen. Sett røret til side på is.
    5. Legg 600 pl 4 mM MgCl2 og 1,5 ml kloroform til supernatantfraksjonen til venstre i det foregående og vortex kraftig. Inkuber på is i 30 minutter og sentrifuger ved 1650 xg i 10 min ved 4 ° C.
    6. Kombiner den nedre fase med den første bunnfasen rør ved hjelp av Pasteur-pipette. Kast de øvre og midtre lag.
    7. Fordamp kloroformen under nitrogengass i et 37 ° C bad. Vask sidene av glassrørene grundig med 200 ul av 1% Triton X-100 / kloroform (v / v). Fordampe under nitrogengass. Oppløse lipid med 200 mL av DDH 2 O og vortex godt å ta den endelige emulsjon.
    8. Måle den totale triglyserider (TG) og kolesterol (TC) nivåer ved hjelp av et triglyserid eller cholesterol sett i overensstemmelse med produsentens protokollxref "> 3.
      MERK: lipid-verdier er normalisert til de av proteinkonsentrasjoner i den opprinnelige homogenat, som bestemt ved protein kvantifisering 3.

2. Primær Mouse hepatocytter Model

  1. Isolering av mus primære hepatocytter
    1. Anesthetize hver mus med 6% kloralhydrat (10 mL / g intraperitonealt).
    2. Isoler primære hepatocytter, som tidligere beskrevet 10. Dyrke cellene på kollagen-belagte dekkglass i en 6-brønns plate for Oil Red O farging. For lipid ekstraksjon, frø cellene på en 10-cm cellekultur fatet 10.
  2. Cell behandling og Oil Red O farging
    1. Erstatte mediet med 2 ml av sultemedium og inkuber ved 37 ° C i 24 timer. Behandle det med 30 mM glukose og 100 nM insulin. Inkuber det i en 37 ° C inkubator kultur i 24 timer.
    2. Aspirer medium. Tilsett 2 ml PBS og virvle forsiktig å skylle medium; gjenta en gang.
    3. Fest dekk til lysbildet med en gummistrikk. Utsette cellene vedheftende til den ytre overflate. Utfør Oil Red O-farging som beskrevet ovenfor (trinn 1.5).
      MERK: basale nivåer av lipid akkumulering blir stimulert med en høy glukose pluss insulinbehandling etter serum sult. Lipid dråper er visualisert ved Oil Red O farging.
  3. Måling av lipider
    1. Unn hepatocytter med høy glukose pluss insulin i samme tilstand (trinn 2.2.1). Tilsett 1 ml PBS til hver 10 cm cellekulturskål. Skrape av cellene og høste dem inn i nye 15-ml glassrør, som prøver av 100 mL overføres til friske 1,5 ml rør for protein kvantifisering.
    2. Tilsett 4 ml kloroform / metanol (2: 1, v / v) til den resterende 900 ul av celler. Sonicate for omtrentlig 20 pip og deretter vortex kraftig for å frigjørelipid i cellene. Inkuber blandingen på is i 2 timer. Utfør lipidekstrahering (trinn 1.6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Som vist i figur 1A, ble musekroppsvekten økte til 45 ± 1,2 g etter 16 ukers HFHS foring, som er omtrent 1,5 ganger høyere enn grøtdiett foring gruppe. NMR-kroppssammensetning analyser viser fettmasse og mager masse av mus er indikert (figur 1B). Fett distribusjoner av hele kroppen og i leveren ble bestemt av MRI, og representative pseudo-fargebilder i levende, bevisst mus er vist i figur 1C-D. Kroppsvekt og kroppssammensetning ble målt og visualisert under HFHS diett fôringsprosessen.

For ytterligere å dissekere steatotic fenotyper, ble musene avlivet og lever- histologisk analyse ble utført. H & E og Oil Red O farging av leveren er vist i figur 2A-B, hvori lipiddråper vokse seg større og opptar mellomrommene i mestleverceller etter 4 måneder med HFHS kosthold fôring. Graden av leversteatose av HFHS diett-matet mus er lett visualisert ved å sammenligne med chow diett-matet mus. De viktigste komponentene i lipid, slik som kolesterol og triglyserider ble målt med kloroform / metanol ekstraksjon (figur 2C). I DIO mus, overskuddet av næringsoverskudd som skyldes unormal triglycerid opphopning i leveren. Med data fra NMR-, MRI, og histologisk analyse, kan graden av lipidavsetning bestemmes effektivt og nøyaktig.

Som vist i figur 3, ble lipid nivåer i primære hepatocytter indusert ved høy glukose pluss insulin i 24 timer. De akkumulerte lipid-dråper ble bestemt ved Oil Red O farging (figur 3A), og den kvantitative lipid-analyse ble brukt for deretter å måle triglyserid og kolesterolnivåer i hepatocytter (figur 3B). Basert på dennemodellen, kan effekten av genmodifisering eller farmasøytisk behandling på lipid homeostase i hepatocytter bli undersøkt på en effektiv og rask måte.

Figur 2
Figur 1. Høy fett, høy-sukrose diett (HFHS) øker fedme og hepatisk steatose i mus. Åtte ukers-gammel mann C57BL / 6 mus ble matet på en chow eller HFHS diett i 8 uker og 16 uker, henholdsvis. (A) Kroppsvekt av mus. (B) Kroppssammensetning av musene. (C - D) Representative magnetisk resonans bilde av musen og leveren. Den hvite området i grå-skala bilde indikerer fett, mens det røde området i pseudo-fargebilde indikerer fett. Dataene er vist som gjennomsnitt ± standardfeil (SEM), n = 5-8. * P <0,05 versus Chow diett-matet mus. Feilstolpene representerer SEM. Statistical analyse ble utført ved hjelp av en uparet, to-tailed t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 2
Figur 2. Analyse av leversteatose i mus ble matet med HFHS kosthold. Åtte ukers-gammel mann C57BL / 6 mus ble matet på en chow eller HFHS diett i 8 uker og 16 uker, henholdsvis. (A) Representative grov morfologi enterocoelia og leveren. (B) Representant H & E og Oil Red O farging (skala barer: 50 mikrometer). Olje Red O flekker fett og nøytral fett, og røde prikker angir lipid dråper akkumulert i hepatocytter. (C) Totalt triglyserid og kolesterolnivåene i leveren lipid-ekstraksjon ved bruk av kloroform / metanol-metoden. Dataene ble normalisert til than levervekt, og er representert som gjennomsnittet ± standardfeil (SEM), n = 5-8. * P <0,05 sammenlignet med mus foret med grøtdiett. Feilstolpene representerer SEM. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en uparet, to-halet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3. leversteatose blir indusert i mus primære hepatocytter utsatt for høy glukose pluss insulin. (A) Olje Red O farging av dyrkede primære hepatocytter behandlet uten eller med glukose og insulin, som indikert (skala barer: 50 mikrometer). (B) triglyseridnivået i de primære hepatocytter ble målt og normalisert til proteinkonsentrasjon. Dataene er presentert som gjennomsnitt ±standardfeil (SEM). * P <0,05 sammenlignet med kontrollgruppen. Feilstolpene representerer SEM. Statistisk analyse ble utført ved anvendelse av en uparet, to-halet t-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NAFLD er en serie av progressiv leversykdommer som er forbundet med metabolsk syndrom, fedme, insulinresistens eller type 2-diabetes mellitus (diabetes mellitus type 2) 11. Kjennetegnet av NAFLD er steatose, akkumulering av lipid i hepatocytter. Her er et spekter av metoder presenteres for å karakterisere fenotyper og parametere for leversteatose bruker DIO mus og muse primære hepatocytter. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for å belyse de molekylære mekanismer for NAFLD og andre relaterte metabolske sykdommer.

Kombinere in vivo og in vitro analyser, disse metodene gir omfattende analyser og vurderinger av leversteatose. Foreløpig dyremodeller av NAFLD hovedsak bestå av genetiske og ernæringsmessige modeller. Den HFHS diett som er brukt her er ment å imitere den moderne kosten stil og er tilstrekkelig til å indusere fedme og hepatisk steatose i mus. Men for å studere de molekylære mekanismene i utvikledepment av lipid deregulering, inneholder cellebasert assay åpenbare fordeler i forhold til dyrestudie, inkludert enkel manipulering av genetisk mutasjon eller farmakologisk behandling, samt relativt lave kostnader og tid forpliktelser. For å generere hepatisk steatose i mus primære hepatocytter, blir høye konsentrasjoner av glukose pluss insulin brukt til å indusere lipidakkumulering, som er en ny og effektiv in vitro modell for å etterligne in vivo diett-indusert hyperglykemi og hyperinsulinemi. Denne behandlingen er også anvendelig til andre levercellelinjer, slik som HepG2 celler. Gitt at genmodifiserte hepatocytter er tilgjengelig for en rekke farmasøytiske behandlinger, in vitro steatotic modellen beskrevet her overvinner begrensning og tidkrevende trinn for generering av dyremodeller ved hjelp av gevinst-og tap-av-funksjon tilnærminger.

Den kroppssammensetning analyser, inkludert NMR og MRI, gir de ikke-invasive og sanntidsdata pålipid i hele kroppen og leveren. Det er en ikke-invasiv, tidsbesparende, visualizable, og semi-kvalitativ måling. I tillegg kan nøyaktigheten av analysene kroppssammensetningen bli betydelig forbedret ved å kombinere andre målinger histologiske og biokjemiske. Det er viktig og nødvendig for å bestemme hepatisk steatose in vivo og in vitro ved anvendelse av H & E farging, Oil Red O-farging, og lipid måling, som alle er gull-standard mål for diagnostisering og gradering hepatisk steatose.

En av begrensningene i den foreliggende fremgangsmåte er dens manglende evne til å måle betennelse og kollagen avsetning ved enkel steatose utvikler seg til hepatitt, fibrose, og til slutt, skrumplever og leverkreft. Gitt at diett-indusert overvektige mus har en lav risiko for utvikling av NASH, er tilstrekkelig til å vurdere leversteatose i DIO mus gjeldende protokollen. Imidlertid, i den tilstand av NASH, andre biokjemiske målinger, slik som plasma ALANIne (ALAT) og aspartataminotransferase (AST) nivåer, bør utnyttes.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Finansiering: Dette arbeidet ble støttet med tilskudd fra Natural Science Foundation National of China (No. 81270930, 31471129, og 31671224) og de hundre talenter Program av den kinesiske Academy of Sciences (2013OHTP04) til YL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346, (16), 1221-1231 (2002).
  2. Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65, (7), 1904-1915 (2016).
  3. Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13, (4), 376-388 (2011).
  4. Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146, (2), 539-549 (2014).
  5. Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3, (2), 87-98 (2006).
  6. Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116, (6), 1494-1505 (2006).
  7. Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332, (6037), 1519-1523 (2011).
  8. Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8, (1), 35-44 (2011).
  9. Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35, (38), 10058-10069 (2014).
  10. Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64, (2), 425-438 (2016).
  11. Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (6), 330-344 (2013).
Optimalisert Analyse av<em&gt; I Vivo</em&gt; og<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatose
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter