Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove

Medicine

Optimerad Analys av doi: 10.3791/55178 Published: March 11, 2017

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Fetma är ett växande hälsoproblem i utvecklade länder och utvecklingsländer. Det har rapporterats att vara en av de samtidiga sjukdomar som ofta förknippas med alkoholfria fettlever (NAFLD), med en prevalens mellan 30 och 100 procent i NAFLD patienter 1. Grund av den starka korrelationen mellan fettlever och fetma, är dietframkallad fetma (DIO) musmodeller används i stor utsträckning för att studera de komplexa molekylära mekanismer som är förknippade med utvecklingen av NAFLD 2, 3, 4, 5, 6. Leversteatos är det tidigaste stadiet av NAFLD, och det kan utvecklas till nonalcoholic steatohepatitis (NASH), cirros, och i slutändan, levercancer 7. Därför är det övergripande målet med denna metod för att generera djur- och cellmodeller av lever steatotic villkor och prOvide detaljerade protokoll för effektiv och korrekt lipid mätning. Dessa modeller och mätningar är också användbara för undersökning av andra metabola störningar, såsom insulinresistens och typ 2 diabetes.

Fetma har identifierats att vara en av de viktigaste riskfaktorerna för NAFLD, en fettrik är hög sackaros diet (HFHS) som imiterar västerländsk fettrik kost som används för att framkalla fetma hos möss. Därefter kan bedömas graden av leversteatos med olika metoder. Först, kroppsvikt och kroppssammansättning analys med kärnmagnetisk resonans (NMR) visar fettinlagring under matdags. Fettmassan och mager massa kan kvantifieras i ett icke-invasivt och i realtid sätt.

Dessutom är magnetisk resonanstomografi (MRI) som används för att visa både hela kroppen och levern distribution av fett. Den gråskala Signalen från MRI-analys, kan omvandlas till ett läsbart pseudofärgbild, och intensiteten avgråskala och färg är hemi-kvantifierbara. Denna teknik ger unika fördelar för mätning av lipid-ackumulering i levande djur. För det andra är histologisk analys av levern den mest använda metoden för att bestämma leversteatos. Hematoxylin och eosin (H & E) färgning ger histologiska information, såsom hepatocyte morfologi och makrofag infiltration, medan Oil Red O färgning visar storleken och läget för lipiddropparna i hepatocyter. För det tredje, är analysen av fetthalten med användning av kloroform / metanol extraktion en noggrann och kvantitativ mätning av lever lipider. Totala triglycerider och kolesterolnivåer kan mätas med biokemiska metoder. Viktigt kan lipidextraktion analys och Oil Red O färgning också användas i genetiskt manipulerade eller farmaceutiskt behandlade leverceller.

Fördelen med föreliggande förfarande är dess användning av flera optimerade metoder för att generera lever steatotic modelleroch att övergripande karakterisera fenotyper både in vivo och in vitro. modeller DIO möss kan sammanfatta de patologi och metaboliska fenotyper av mänsklig fettlever. Andra metaboliska parametrar hos människa kan replikeras i denna modell samt 8. Genereringen av steatotic hepatocyt modell som svar på hög glukos plus insulin är effektiv, användbar och övervinner begränsningen av kostsamma och tidskrävande mus arbete. Sammantaget ger dessa metoder är tillräckliga och väsentliga för att studera lever lipid dysfunktion och insulinresistens under närings överbelastning.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Alla djurexperimentella protokoll godkändes av den institutionella djurvård och användning kommittén vid Institutet för näringsrika vetenskaper, Shanghai institut för biologiska vetenskaper, Chinese Academy of Sciences (Shanghai, Kina).

1. DIO musmodell

  1. HFHS utfodring
    1. Mata åtta veckor gammal hane C57BL / 6-möss med en HFHS som innehåller 40 kcal% fett och 40 kcal% sackaros. Hysa dem i 12 timmar mörker ljus cykelförhållanden.
    2. Håll mössen i HFHS diet matning förutsättning för fyra till sexton veckor. Kontrollera kroppsvikt per vecka.
  2. Kroppen kompositionsanalys och pseudofärgbild analys
    1. Utsätta möss till en kroppssammansättning analysator analys.
      1. Säkra medvetna, ej sövda möss i ett plaströr i. Mät kroppsfett massa, muskelmassa, och vätskor med hjälp av ett NMR-system, som beskrivits tidigare två.
    2. Skanna hela kroppen av varje mus med hjälp av ett MRI-system.
      1. Söva möss med 1% Avertin via intraperitoneal injektion (25 ml / g) och utför bildanalys i specialiserade glasrör.
        OBS: Processen att avbildning varar i nästan 0,5 h för varje mus. När mätningen är klar, åter möss till sin bur.
    3. Scan hela kroppar av mössen i rygg, mitten och ventrala skikt; skanna levern i den vertikala riktningen. Använd en 0,55 T magnet och följande instrumentella parametrar: K utrymme = 192 x 256 pm, snittjocklek = 3 mm, TE = 14,8 ms, TR = 400 ms, FOVRead = 100 mm, FOVPhase = 100 mm, och antalet avsökningar = 8. Skanna med samma magnetiska villkor för alla grupper av möss.
    4. Map gråskalebilden på en pseudo-färgbild i enlighet med den signalintensitet 9.
  3. mus eutanasi
    1. sterilisera dissecting verktyg, såsom pincett och sax.
    2. Pour tillräcklig isofluran på en pappershandduk och låt isofluran förångas i en glasburk. Säkerställa att mössen avlivas av isofluran.
    3. Fäst möss på ett operationsbord. Spraya varje buken med 75% etanol, göra ett snitt i dermis av xiphoid processen med hjälp av en sax, och riva dermis längdled genom mittlinjen med händerna för att exponera bukhinnan.
    4. Klämma xiphoid process med pincett och skär bukhinnan bredd genom botten av ribborna för att exponera inälvorna.
    5. Samla blod i EDTA-belagda rör genom hjärtpunktion.
    6. Skär membranet längs levern och försiktigt bort levern från enterocoelia med fina saxar. Skär tre bitar av levervävnad för följande lipid mätningar: a) 6 x 3 x 3 mm för H & E-färgning, b) 6 x 3 x 3 mm för Oil Red O-färgning, och c) från 20 till 40 mg av levern för kloroform / metanol extraktion.
  4. H & E-färgning
    1. Fixera levern i 4% fosfatbuffrad formalin acetat vid 4 ° C över natten och sedan bädda in den i paraffinvax.
    2. Skär paraffinsnitt (5 pm) och montera dem på objektglas för H & E-färgning, som tidigare beskrivits 3, 10.
  5. Oil Red O färgning
    1. regent beredning
      1. Förbered Oil Red O arbetslösning med 10% formalin, 60% isopropanol, hematoxylin och glycerol gelé. Lös upp 0,5 g av Oil Red O-pulver med 100 ml isopropanol och värm i ett 60 ° C bad för att göra en 0,5% förrådslösning.
      2. Späd med dubbla destillerat vatten (DDH 2 O) på en 3: 2-förhållande (3 ml stamlösning och 2 ml DDH 2 O). Filtrera den arbetslösning och låt stå i minst 10 min vid rumstemperatur.
    2. Bädda levern i optimala skärtemperatur (oktober) förening i apLastic inbäddning box. Frysa den vid -20 ° C under 30 min. Skär den i 8-pm sektioner i en frysning mikrotom, montera vävnaden på ett objektglas, och placera den vid rumstemperatur under 30 minuter.
    3. Placera en pappershandduk i botten av en färgnings badkar och häll en liten mängd av 10% formalin för att väta pappershandduk. Placera bilden i färgning tub och fixera de frusna sektioner i formaldehydångor under 5 min vid 4 ° C.
    4. Doppa bilden i 60% isopropanol i färgning badkar för 3 s; upprepa en gång.
    5. Tillsätt några droppar av Oil Red O arbetar lösning på bilden för att täcka alla vävnader och inkubera under 15 minuter. Skydda vävnaden från ljus vid rumstemperatur.
    6. Skölj objektglaset i nya 60% isopropanol i färgning badkar för 3 s; Upprepa två gånger.
    7. Skölj försiktigt glida genom destillerat vatten två gånger och avlägsna vattnet runt vävnaden. Var noga med att inte torka vävnaden.
    8. Placera bilden i Hematoxylin under 1 min och skölj försiktigt med kranvatten under 5-10min. Skölj försiktigt glida i destillerat vatten två gånger och hålla den i destillerat vatten tills redo att sätta på täckglas.
    9. Värm upp glycerol gelé i mikrovågsugnen och placera flera droppar ovanpå vävnaden. Placera försiktigt täck ovanpå och se till att inte bilda bubblor.
    10. Observera fläcken under ett mikroskop och fånga karaktäristiska bilder med 20X och 40X mål.
  6. Mätning av lever lipider
    1. Placera dissekerade levervävnaden i ett nytt 2-ml centrifugrör av plast. Homogenisera i 1 ml PBS med en homogenisator och överföra lysatet till en ny 15-ml glasrör.
    2. Tillsätt 5 ml kloroform / metanol (2: 1, volym / volym) lösning, vortexa blandningen kraftigt under 1 min, och låt stå i 2 h på is.
    3. Centrifugera vid 1650 xg under 10 min vid 4 ° C; blandningen bör separera i 3 skikt: den övre metanolskiktet, den mellersta protein skiv, och botten kloroform och lipider.
    4. Tran Sfer bottenfasen till ett nytt glasrör med en glas Pasteur-pipett; finns det inget behov för att få varje droppe av bottenfraktionen. Ställ röret åt sidan på is.
    5. Lägga 600 mikroliter av 4 mM MgCl2 och 1,5 ml kloroform till supernatanten fraktionen kvar i den föregående röret och skaka kraftigt. Inkubera på is under 30 min och centrifugera vid 1650 xg under 10 min vid 4 ° C.
    6. Kombinera bottenfasen med den första bottenfasen rör med användning av Pasteur-pipett. Kasta de övre och mellersta skikt.
    7. Indunsta kloroformen under kvävgas i ett 37 ° C bad. Tvätta sidorna av glasrören grundligt med 200 mikroliter av 1% Triton X-100 / kloroform (vol / vol). Indunsta under kvävgas. Upplösa fett med 200 mikroliter av DDH 2 O och virvel väl för att göra den slutliga emulsionen.
    8. Mäta den totala triglycerid (TG) och kolesterol (TC) halter med användning av en triglycerid eller kolesterol kit enligt tillverkarens protokollxref "> 3.
      OBS: De lipidvärden normaliseras till de av de proteinkoncentrationer i den initiala homogenat, såsom bestämt genom protein kvantifiering 3.

2. Primär Mouse Hepatocyte Modell

  1. Isolering av mus primära hepatocyter
    1. Söva varje mus med 6% kloralhydrat (10 pl / g intraperitonealt).
    2. Isolera primära hepatocyter, såsom tidigare beskrivits 10. Växa celler på kollagenbelagda täckglas av glas i en 6-brunnsplatta för Oil Red O färgning. För lipidextraktion, utsäde cellerna på en 10-cm cellodlingsskål 10.
  2. Cell behandling och Oil Red O färgning
    1. Ersätta mediet med 2 ml av svält-medium och inkubera vid 37 ° C under 24 h. Behandla det med 30 mM glukos och 100 nM insulin. Inkubera den i en 37 ° C odlings inkubator under 24 timmar.
    2. Aspirera mediet. Tillsätt 2 ml PBS och snurra försiktigt för att skölja mediet; upprepa en gång.
    3. Fixera täckglas till objektglaset med ett gummiband. Exponera cellerna vidhäftande till den yttre ytan. Utför Oil Red O-färgning såsom beskrivits ovan (steg 1,5).
      OBS! Basala nivåer av lipidackumulering stimuleras med en hög glukos plus insulinbehandling efter serumsvält. Lipid droppar kan göras synliga genom Oil Red O färgning.
  3. Mätning av lipider
    1. Behandla hepatocyterna med hög glukos plus insulin i samma skick (steg 2.2.1). Tillsätt 1 ml PBS till varje 10-cm cellkulturskål. Skrapa bort cellerna och skörda dem in i nya 15 ml-glasrör, från vilka alikvoter av 100 | il överförs till färskt 1,5-ml rör för protein kvantifiering.
    2. Lägg 4 ml kloroform / metanol (2: 1, volym / volym) till den återstående 900 | il av celler. Sonikera för ungefärliga 20 pip och sedan skaka kraftigt för att frigöralipiden i cellerna. Inkubera blandningen på is under 2 h. Utför lipidextraktion (steg 1,6).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Såsom visas i figur 1 A, var muskroppsvikt ökat till 45 ± 1,2 g efter 16 veckors HFHS matning, som är ungefär 1,5 gånger högre än foderdiet matningsgruppen. NMR-kroppssammansättning analyser som visar den fettmassa och mager massa av möss betecknas (Figur 1B). Fettfördelningarna av hela kroppen och i levern bestämdes genom MRI, och representativa pseudo-färgbilder i levande, medveten möss visas i figur 1C-D. Kroppsvikten och kroppssammansättning mättes och visualiseras under HFHS dieten matningsprocessen.

För att ytterligare dissekera steatotic fenotyper, avlivades mössen och en lever histologisk analys utfördes. H & E och Oil Red O färgning av levrarna visas i figur 2A-B, i vilken lipiddroppar växa sig större och upptar utrymmena i de flestahepatocyter efter 4 månaders HFHS kost utfodring. Graden av leversteatos av HFHS diet matade möss lätt visualiseras genom att jämföra med chow kost livnärde möss. De viktigaste komponenterna i lipiden, såsom triglycerid och kolesterol, mättes med kloroform / metanol extraktion (figur 2C). I DIO-möss, orsakad överskottet näringsöverbelastnings onormal triglycerid ackumulering i levern. Med data från NMR, MRI, och histologisk analys, kan graden av avsättande av lipider bestämmas effektivt och korrekt.

Såsom visas i figur 3, var lipidnivåerna i primära hepatocyter som induceras av hög glukos plus insulin för 24 h. De ackumulerade lipiddroppar bestämdes genom Oil Red O-färgning (figur 3A), och den kvantitativa lipid-analys användes därefter för att mäta de triglycerid och kolesterolnivåer i hepatocyter (Figur 3B). Baserat på det härmodell, kan effekterna av genetisk modifiering eller läkemedelsbehandling på lipidhomeostas i hepatocyter undersökas på ett effektivt och snabbt sätt.

figur 2
Figur 1. Hög fetthalt, hög-sackaros diet (HFHS) ökar fetma och leversteatos i möss. Åtta veckor gamla C57BL / 6 möss matades på en chow eller HFHS diet för 8 veckor och 16 veckor, respektive. (A) Kroppsvikt av mössen. (B) Kroppens sammansättning av mössen. (C - D) representant magnetresonansbild av musen och levern. Det vita området i gråskalebilden indikerar den fett, medan det röda området i pseudofärgbild indikerar fettet. De data representeras som medelvärdet ± standardfelet (SEM), n = 5-8. * P <0,05 kontra chow kost livnärde möss. Felgränserna representerar SEM. Statistical-analys utfördes med användning av ett oparat, tvåsvansat Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

figur 2
Figur 2. Analys av leversteatos hos möss som utfodrats med en HFHS diet. Åtta veckor gamla C57BL / 6 möss matades på en chow eller HFHS diet för 8 veckor och 16 veckor, respektive. (A) representant brutto morfologi enterocoelia och lever. (B) representant H & E och Oil Red O färgning (skala bar: 50 pm). Oil Red O fläckar fett och neutralt fett, och röda prickar indikerar lipiddropparna ackumulerats i hepatocyter. (C) Totala triglycerider och kolesterolnivåer i levern lipid extraktioner med hjälp av kloroform / metanol metod. Data normaliserades till than levervikten, och representeras som medelvärde ± standardfelet (SEM), n = 5-8. * P <0,05 kontra möss som utfodrats med foderdiet. Felgränserna representerar SEM. Statistisk analys utfördes med användning av ett oparat, tvåsvansat Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Figur 3
Figur 3. leversteatos induceras i mus primära hepatocyter utsätts för hög glukos plus insulin. (A) Oil Red O färgning av odlade primära hepatocyter behandlade utan eller med glukos och insulin, såsom anges (skala staplar: 50 | j, m). (B) Triglycerid nivå i de primära hepatocyter mättes och normaliserades till proteinkoncentrationen. De data representeras som medelvärde ±standardfelet (SEM). * P <0,05 jämfört med kontrollgruppen. Felgränserna representerar SEM. Statistisk analys utfördes med användning av ett oparat, tvåsvansat Students t-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

NAFLD är en serie av progressiva leversjukdomar som är förknippade med metabolt syndrom, fetma, insulinresistens, eller typ 2 diabetes mellitus (T2DM) 11. Det kännetecknande för NAFLD är steatosis, ansamling av lipid i hepatocyter. Här är ett spektrum av metoder som presenteras för att karakterisera fenotyper och parametrar för leversteatos hjälp DIO möss och mus primära hepatocyter. Detta förfarande kan vara till hjälp för att belysa molekylära mekanismer NAFLD och andra metabola sjukdomar.

Kombinera in vivo och in vitro, dessa metoder ger omfattande analyser och bedömningar av leversteatos. För närvarande, djurmodeller av NAFLD består huvudsakligen av genetiska och närings modeller. Den HFHS kost som används här är avsedd att efterlikna den moderna kosten stil och är tillräcklig för att inducera fetma och leversteatos i möss. Men för att studera de molekylära mekanismer i development lipid avreglering, innehåller cellbaserad analys uppenbara fördelar jämfört med djurstudie, inklusive enkel hantering av genetisk mutation eller farmakologisk behandling, samt relativt låga kostnader och tid åtaganden. Att generera leversteatos i mus primära hepatocyter används höga koncentrationer av glukos plus insulin som används för att inducera lipidackumulering, som är en ny och effektiv in vitro-modell för att efterlikna in vivo-diet-inducerad hyperglykemi och hyperinsulinemi. Denna behandling är också tillämpbar på andra levercellinjer, såsom HepG2-celler. Med tanke på att genetiskt modifierade leverceller är tillgängliga för en mängd olika farmaceutiska behandlingar, in vitro steatotic modellen beskrivs här övervinner begränsningen och tidskrävande steg för generering av djurmodeller med hjälp av GAIN- och förlust av funktions metoder.

Kroppen sammansättningsanalyser, inklusive NMR och MRI, ger icke-invasiva och realtidsdata omlipid i hela kroppen och lever. Det är en icke-invasiv, tidsbesparande, visualizable, och semi-kvalitativ mätning. Dessutom kan noggrannheten av kroppssammansättningsanalyser förbättras avsevärt genom att kombinera andra histologiska och biokemiska mätningar. Det är kritiskt och nödvändigt att bestämma leversteatos in vivo och in vitro med användning av H & E-färgning, Oil Red O-färgning, och lipid mätning, vilka alla är guld-standardmått för att diagnostisera och klassificering av leversteatos.

En av begränsningarna i den nuvarande metoden är dess oförmåga att mäta inflammation och kollagenavsättning när enkel steatos utvecklas till hepatit, fibros, och i slutändan, cirros och levercancer. Med tanke på att kost-inducerad obesa möss har en låg risk för utveckling av NASH, är det nuvarande protokollet är tillräckligt för att utvärdera leversteatos hos DIO möss. Men i det skick av NASH, andra biokemiska mätningar, såsom plasma alanine (ALAT) och aspartataminotransferas (AST) nivåer, bör utnyttjas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Finansiering: Detta arbete har finansierats med bidrag från National Natural Science Foundation i Kina (nr 81.270.930, 31.471.129 och 31.671.224) och hundra talenter Program av Chinese Academy of Sciences (2013OHTP04) till YL

Materials

Name Company Catalog Number Comments
O.C.T compound SAKURA 4583
Oil Red O Sigma O0625-25G
Infinity Triglycerides kit Fisher Scientific TR22421
Infinity Cholesterol kit Fisher Scientific TR13421
Collagen type I, Rat tail Millipore 08-115
DMEM (low glucose) Invitrogen 11885-092
Penicillin / Streptomycin Invitrogen 15140-122
FBS Invitrogen 10099141
PBS cellgro R21-040-CVR
HBSS cellgro 20-021-CV
Insulin TOCRIS Bioscience 3435 dissolve in PBS, 1 mM for stock
Glucose Sigma G8270-100G
Microscope Olympus BX53
Peristaltic pump Longerpump BT100-2J
10 cm cell culture dish Corning 420167
6-well-plate Corning 3516
BCA assay Beyotime P0010
Nuclear Magnetic Resonance Niumag technology MiniQMR23-060H-I
High fat high surcose diet (HFHS) Research Diets D12327

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Angulo, P. Medical progress - Nonalcoholic fatty liver disease. New England Journal of Medicine. 346, (16), 1221-1231 (2002).
  2. Chen, X., et al. Hepatic ATF6 Increases Fatty Acid Oxidation to Attenuate Hepatic Steatosis in Mice through Peroxisome Proliferator-Activated Receptor Alpha. Diabetes. 65, (7), 1904-1915 (2016).
  3. Li, Y., et al. AMPK phosphorylates and inhibits SREBP activity to attenuate hepatic steatosis and atherosclerosis in diet-induced insulin-resistant mice. Cell Metab. 13, (4), 376-388 (2011).
  4. Li, Y., et al. Hepatic SIRT1 attenuates hepatic steatosis and controls energy balance in mice by inducing fibroblast growth factor 21. Gastroenterology. 146, (2), 539-549 (2014).
  5. Esau, C., et al. miR-122 regulation of lipid metabolism revealed by in vivo antisense targeting. Cell Metabolism. 3, (2), 87-98 (2006).
  6. Kanda, H., et al. MCP-1 contributes to macrophage infiltration into adipose tissue, insulin resistance, and hepatic steatosis in obesity. Journal of Clinical Investigation. 116, (6), 1494-1505 (2006).
  7. Cohen, J. C., Horton, J. D., Hobbs, H. H. Human fatty liver disease: old questions and new insights. Science. 332, (6037), 1519-1523 (2011).
  8. Hebbard, L., George, J. Animal models of nonalcoholic fatty liver disease. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 8, (1), 35-44 (2011).
  9. Chen, Y., et al. Highly effective inhibition of lung cancer growth and metastasis by systemic delivery of siRNA via multimodal mesoporous silica-based nanocarrier. Biomaterials. 35, (38), 10058-10069 (2014).
  10. Gong, Q., et al. Fibroblast growth factor 21 improves hepatic insulin sensitivity by inhibiting mammalian target of rapamycin complex 1 in mice. Hepatology. 64, (2), 425-438 (2016).
  11. Anstee, Q. M., Targher, G., Day, C. P. Progression of NAFLD to diabetes mellitus, cardiovascular disease or cirrhosis. Nat Rev Gastroenterol Hepatol. 10, (6), 330-344 (2013).
Optimerad Analys av<em&gt; In Vivo</em&gt; och<em&gt; In Vitro</em&gt; Leversteatos
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).More

Cui, A., Hu, Z., Han, Y., Yang, Y., Li, Y. Optimized Analysis of In Vivo and In Vitro Hepatic Steatosis. J. Vis. Exp. (121), e55178, doi:10.3791/55178 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
simple hit counter