Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

واستغلت الكريستال السائل جسيمات متناهية الصغر (LCNP) nanocarrier كوسيلة لإيصال تسيطر عليها شحنة مسعور إلى غشاء البلازما من الخلايا الحية.

Abstract

والتسليم المراقب وكلاء المخدرات / التصوير للخلايا هو أمر حاسم لتطوير علاجات ولدراسة العمليات الإشارات الخلوية. في الآونة الأخيرة، وقد أظهرت النانوية (NPS) وعد كبير في تطوير نظم تسليم مثل هذه. هنا، وقد تم استخدام الكريستال السائل NP (LCNP) نظام تسليم المستندة للالتسليم المراقب صبغة غير قابلة للذوبان في الماء، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو)، من داخل نواة NP إلى المنطقة مسعور من البلازما غشاء طبقة ثنائية. خلال توليفة من مصادر القدرة النووية، تأسست الصبغة بكفاءة في صلب LCNP مسعور، وهو ما أكدته التحاليل الطيفية متعددة. الإقتران من مضاد للفيروسات الكولسترول مشتق إلى السطح NP (ديو-LCNP-PEG-تشول) تمكين الربط من مصادر القدرة النووية محملة صبغ إلى غشاء البلازما في كلوة 293T / 17 الخلايا. ليزر المسح المجهري متحد البؤر وفورستر نقل الطاقة الرنين وقت حل (الحنق) التصوير وأكد الممرإيف هروب رأس المال من ديو من صميم LCNP واندماجها طبقة ثنائية غشاء البلازما. وأخيرا، تقديم ديو باعتباره LCNP-PEG-تشول الموهن السمسة ديو. شكل NP ديو عرضت ~ 30-40٪ أقل سمية مقارنة ديو تسليمها خالية من حل الجزء الأكبر. يوضح هذا النهج فائدة منصة LCNP كما طريقة فعالة لإيصال غشاء محددة وتعديل من الشحنات الجزيئية مسعور.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

منذ ظهور تفاعل المواد النانوية (المواد ≤100 نانومتر في بعد واحد على الأقل) مع الخلايا الحية، وكان هدف الاستمرار في الاستفادة من خصائص فريدة من نوعها تعتمد على حجم الجسيمات النانوية (NPS) لمختلف التطبيقات. وتشمل هذه التطبيقات الخلايا والأنسجة وصفها / التصوير (على حد سواء في التجارب المختبرية والحية)، والاستشعار في الوقت الحقيقي، والتسليم المراقب للمخدرات وغيرها من الشحنات 1. ومن أمثلة هذه الخصائص NP ذات الصلة انبعاث تعتمد على حجم البلورات النانوية أشباه الموصلات (النقاط الكمومية، نقاط الكمية)؛ خصائص ضوئي؛ ضوحراري من جزيئات الذهب. قدرة التحميل كبيرة من جوهر مائي من الجسيمات الشحمية. والتوصيل الباليستية من المتآصلة الكربون، مثل الأنابيب النانوية الكربونية جدار واحد والجرافين.

وفي الآونة الأخيرة، ظهرت فائدة كبيرة في استخدام مصادر الطاقة النووية للتعديل تسيطر المخدرات والبضائع الأخرى، مثل التباين / التصوير لأيها السادة. هنا، فإن الأساس المنطقي هو أن يعزز إلى حد كبير / تحسين الذوبان الكلي، جرعة تسليمها، وقت الدورة الدموية، وإزالة في نهاية المطاف من شحن المخدرات من خلال تقديم أنها صيغة NP. وجاء ذلك ليكون المعروفة باسم تسليم المخدرات بوساطة NP (NMDD)، وهناك حاليا سبع وافقت ادارة الاغذية والعقاقير التركيبات الدوائية NP لاستخدامها في عيادة لعلاج مختلف أنواع السرطان ومئات أخرى في مراحل مختلفة من التجارب السريرية. في جوهرها، والهدف من ذلك هو "تحقيق المزيد بموارد أقل." وهذا هو، لاستخدام NP كما سقالة لتقديم المزيد من المخدرات مع الإدارات الجرعات أقل من خلال الاستفادة من مساحة كبيرة: حجم (على سبيل المثال، والجسيمات الصلبة، مثل نقاط الكمية وأكاسيد المعادن) من مصادر القدرة النووية أو حجم الداخلية كبيرة من أجل تحميل حمولات شحن كبيرة (على سبيل المثال، الجسيمات الشحمية أو المذيلات). والغرض هنا هو للحد من ضرورة لعدة الجرعات تسليمها بشكل منتظم وفي الوقت نفسه تعزيز الاستقرار المائي وتعزيز الدورة الدموية، وخاصة بالنسبة للتحدي الشحنات المخدرات مسعور أنه في حين فعالة للغاية، القابلة للذوبان لماما في الأوساط المائية.

وهكذا، كان الهدف من العمل الموصوفة هنا لتحديد إمكانية استخدام رواية NP سقالة للتسليم محددة ورقابة من الشحنات مسعور إلى محبة للدهون طبقة ثنائية غشاء البلازما. كان الدافع للعمل ذوبان محدود الكامنة وصعوبة في إيصال الجزيئات الكارهة للماء إلى خلايا من الأوساط المائية. عادة، وتسليم هذه الجزيئات الكارهة للماء يتطلب استخدام المذيبات العضوية (على سبيل المثال، دمس) أو السطحي محبة للجهتين (على سبيل المثال، Poloxamers)، التي يمكن أن تكون سامة وتسوية الخلايا والأنسجة الحيوية أو ناقلات مذيلة، الذي يمكن أن يكون محدودا تحميل الداخلي القدرات. كان الناقل NP اختار هنا رواية الكريستال السائل NP (LCNP) صياغة وضعت من قبل 3 والتي أثبتت في السابق لتحقيق ~ 40 أضعاف التحسن في كفاءة دوكسوروبيسين المخدرات المضادة للسرطان في الخلايا المستزرعة 4.

في العمل الموصوفة هنا، كانت البضائع تمثيلية اختيار الجهدية غشاء صبغ، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو). ديو هو صبغة غير قابلة للذوبان المياه التي استخدمت لتقدمي والبحث عن المفقودين إلى الوراء في المعيشة والخلايا العصبية ثابتة، غشاء القياسات المحتملة، وغشاء العام وسم 9. نظرا لطبيعتها مسعور، وعادة ما أضاف ديو مباشرة إلى الطبقات الوحيدة أو أنسجة الخلايا في شكل بلوري 10، أو المحتضنة ذلك بتركيزات عالية جدا (~ 1-20 ميكرون) بعد التخفيف من محلول المخزون تركيز 11 و 12.

محتوى "> هنا، كان نهج استخدام للمنصة LCNP، وأدرجت NP متعدد الوظائف الذي الداخلي الأساسي هو مسعور تماما والتي السطح هو ماء وقابلة للbioconjugation في وقت واحد، وسيلة لتسليم ديو. ديو في صلب LCNP خلال التوليف ، وسطح NP ثم يتم functionalized مع الكوليسترول شاردة مضاد للفيروسات لتعزيز غشاء ملزمة للفرقة ديو-LCNP إلى غشاء البلازما. أدى هذا النهج في نظام التسليم التي تقسم ديو في غشاء البلازما مع قدر أكبر من الدقة والإقامة الغشاء الوقت من شكل خال من ديو تسليم من حل الجزء الأكبر (ديو مجاني). وعلاوة على ذلك، أظهرت هذه الطريقة أن تسليم بوساطة LCNP ديو ينظم بشكل كبير ويدفع معدل تقسيم معين من الصبغة في محبة للدهون طبقة ثنائية الغشاء البلازمي، وهذا هو تحقق مع الحد بصورة متزامنة والسمية الخلوية للخال من المخدرات التي كتبها ~ 40٪ عن طريق تقديم أنها صيغة LCNP.

الحمار = "jove_content"> ومن المتوقع أن المنهجية الواردة في هذه الوثيقة ستكون قوية تقنية تمكن للباحثين الذين ينطوي أو يتطلب تسليم الخلوي من الشحنات مسعور للغاية القابلة للذوبان لماما أو غير قابلة للذوبان تماما في محلول مائي العمل.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. إعداد ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

  1. حل السائل البلوري diacrylate عبر ربط وكيل (DACTP11، 45 ملغ)، 3،3'-dioctadecyloxacarbocyanine فوق كلورات (ديو، 2 ملغ)، والبادئ الجذور الحرة (azobisisobutyronitrile، 1 ملغ) عن البلمرة في 2 مل من الكلوروفورم. هذا إضافة إلى محلول مائي السطحي-functionalized اكريليت (AC10COONa، 13 ملغ في 7 مل).
  2. يحرك الخليط لمدة 1 ساعة ويصوتن في 80٪ السعة لمدة 5 دقائق لإنتاج miniemulsion تتكون من قطرات صغيرة من المواد العضوية التي تحيط بها السطحي polymerizable في الماء.
  3. حرارة الخليط إلى 64 درجة مئوية في حمام الزيت لبدء البلمرة كل من وكيل عبر ربط والسطحي مثل الكلوروفورم يتبخر ببطء، وترك تعليق NP ديو المحتوية على أن يستقر بها السطحي.
  4. تصفية تعليق NP (3 مرات) من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون لإزالة أي التجميع. ستوإعادة الحل NP تصفيتها في 4 درجات مئوية حتى استخدامها مرة أخرى.
  5. تصريف PEG-تشول إلى ديو-LCNP عبر اقتران EDC.
    1. حل تشول-PEG-NH 2 · حمض الهيدروكلوريك (PEG-تشول، 0.9 ملم) في 25 ملي العازلة HEPES (7.0 درجة الحموضة).
    2. إعداد محلول العمل التي تحتوي على N-هيدروكسي sulfosuccinimide ملح الصوديوم (المرافق الوطنية للهيدرولوجيا، 40 ملم) و 1 إيثيل-3- (3- (dimethylamino) -propyl) carbodiimide هيدروكلوريد (EDC، 400 ملم) في المخزن HEPES من الحلول الأسهم المركزة.
    3. على الفور إضافة 20 ميكرولتر من محلول العمل الطازجة المرافق الوطنية للهيدرولوجيا / EDC إلى 1.0 مل من ديو-LCNP في المخزن HEPES ويقلب لمدة 5 دقائق.
    4. إضافة 20 ميكرولتر من محلول المخزون من تشول-PEG-NH 2 · حمض الهيدروكلوريك إلى هذا الخليط ويقلب لمدة 2 ساعة.
    5. أجهزة الطرد المركزي لفترة وجيزة خليط التفاعل في أقصى سرعة (~ 2000 x ج) لمدة 30 ثانية باستخدام أجهزة الطرد المركزي الطاولة صغير وتمرير طاف من خلال PD-10 حجم الإقصاء اللوني العمود 13 معايرتها معDulbecco والفوسفات مخزنة المالحة (DPBS، 0.1X).

2. توصيف ديو-LCNP وديو-LCNP-PEG-تشول

  1. تأكيد نجاح الاقتران التساهمية PEG-تشول إلى السطح ديو-LCNP بواسطة الكهربائي للهلام.
    1. حل 0.5 غرام من الاغاروز في 50 مل (1X) من الكهربي تريس-بورات (TBE و 89 ملي تريس (الرقم الهيدروجيني 7.6)، 89 ملم حمض البوريك، و 2 ملي EDTA) العازلة. الحرارة الحل في فرن الميكروويف لإذابة الاغاروز. يسمح الحل ليبرد قليلا وتصب محتوياتها في لوحة هلام في المربع الكهربائي. إدراج مشط هلام لإنشاء آبار العينة.
    2. مرة واحدة وقد عززت هلام، إضافة المبلغ المطلوب (ما يكفي لغمر هلام في الغرفة) من TBE العازلة على التوالي إلى الغرفة.
    3. إضافة 35 ميكرولتر من عينة ديو-LCNP (المعدل مع الجلسرين، 5٪ ت / ت) لآبار جل وتشغيل لمدة 20 دقيقة في الجهد 110 V.
    4. صورة هلام باستخدام واي هلام نظام التصويرال الإثارة وانبعاث المرشحات في 488 نانومتر، و500-550 نانومتر، على التوالي.
  2. تقييم حجم الجسيمات والتوزيع التي تشتت الضوء الحيوي (DLS) عن طريق تمييع الحل ديو-LCNP (تخفيف ~ 200 أضعاف) في برنامج تلفزيوني (الرقم الهيدروجيني ~ 8، 0.1X) وقياس على صك DLS 14. قياس زيتا-إمكانات ديو-LCNPs باستخدام زيتا أداة قياس المحتملين المناسب.

3. إعداد خلية أطباق الثقافة للتجارب تسليم والتصوير

ملاحظة: يتم تنفيذ العلامات ديو-LCNP على كلوة 293T / 17 خلايا الكلى الجنينية البشرية (بين الممرات 5 و 15) التي هي مثقف كما هو موضح سابقا (4). إجراء التجارب تسليم والتصوير الخلية لاحقا كما هو موضح أدناه.

  1. إعداد أطباق زراعة الأنسجة قطرها 35 ملم (مزودة 14 ملم إدراج رقم 1 ساترة) من قبل طلائها مع فبرونيكتين البقري (~ 100 ميكرولتر في تركيز 20 ميكروغرام/ مل) في DPBS لمدة 2 ساعة على 37 درجة مئوية.
  2. إزالة حل فبرونيكتين الطلاء من الطبق الثقافة. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق الغسيل الأول أحادي الطبقة الخلية مع 3 مل من DPBS ثم بإضافة 2 مل من التربسين-EDTA (0.5٪ التربسين 0.25٪ EDTA).
  3. احتضان القارورة عند 37 درجة مئوية لمدة ~ 3 دقائق. إزالة التربسين-EDTA والعودة القارورة إلى حاضنة. مرة واحدة يتم فصل الخلايا من القارورة، تحييد التربسين بإضافة 4 مل من المتوسط ​​الشامل (Dulbecco لتعديل النسر المتوسط؛ DMEM، المعدل لاحتواء 10٪ مصل الجنين البقري، 5٪ البيروفات الصوديوم، و 5٪ مضاد حيوي / مضاد فطري) إلى قارورة . تحديد تركيز خلية في التعليق من اعدهم في عداد الخلية.
  4. ضبط تركيز الخلية إلى ~ 8 × 10 4 خلية / مل مع متوسط نمو. إضافة 3 مل من خلية إلى تعليق الطبق والثقافة في الحاضنة بين عشية وضحاها. في اليوم التالي، وينبغي أن تكون الخلايا في ~ 70٪ confluency وينبغي أن تكون جاهزة للاستخدام. كافكثافة الخلية هو أمر حاسم لوضع العلامات قوي وفعال من نسبة عالية من الخلايا.

4. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والتصوير من الخلايا الثابتة

  1. إعداد 1 مل حلول ديو، ديو-LCNP، وديو-LCNP-PEG-تشول في المتوسط تسليم (HEPES-DMEM؛ DMEM تحتوي على 25 ملي HEPES) عن طريق تمييع الحلول الأسهم ديو الحرة وديو-LCNPs. وتركيزات ديو مناسبة لحضانة على الخلايا أن يكون ~ 1-10 ميكرومتر (معبرا عنها إما تركيز ديو الحرة أو ديو في شكل ديو-LCNP).
  2. إزالة المتوسطة النمو من الأطباق الثقافة باستخدام ماصة المصلية وغسل الطبقات الوحيدة الخلية (راجع الخطوة 3) مرتين مع HEPES-DMEM (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة HEPES-DMEM باستخدام ماصة إلى / من على حافة الأطباق.
  3. إضافة 0.2 مل من ديو حلول خالية أو ديو-LCNP تسليم مستعدة لمركز أطباق ثقافة والعودة الأطباق إلى طncubator لفترة مناسبة من الوقت (عادة 15 أو 30 دقيقة، اعتمادا على احتياجات التجربة). حضانة مرات أطول إضافة إلى وضع العلامات الخلوي أكثر غير محدد من مجالات غير غشائي (على سبيل المثال، العصارة الخلوية).
  4. بعد فترة الحضانة، وإزالة الحلول تسليم باستخدام ماصة المصلية. غسل الطبقات الوحيدة الخلية مرتين مع DPBS (2 مل كل غسل). أداء يغسل بإضافة بلطف وإزالة DPBS إلى / من على حافة الطبق.
  5. إصلاح الطبقات الوحيدة الخلية باستخدام بارافورمالدهيد 4٪ (المعد في DPBS) لمدة 15 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
    تنبيه: لامتصاص العرق غير قابل للاشتعال، مهيج الجهاز التنفسي، ويشتبه بأنها مسرطنة.
  6. إزالة حل لامتصاص العرق باستخدام ماصة، ويغسل بلطف الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) من خلال إضافة وإزالة DPBS باستخدام ماصة لل/ من على حافة الأطباق.
  7. الخلايا الثابتة هي جاهزة للتصوير لوجود إشارة مضان الغشائي باستخدام المسح الضوئي ليزر متحد البؤرالمجهري (CLSM). إجراء التصوير على الفور، أو بدلا من ذلك، استبدل المتوسطة مع DPBS تحتوي على 0.05٪ نان 3 وتخزين الأطباق في 4 درجات مئوية.
    تنبيه: نان 3 غير سامة. توخي الحذر الشديد عند استخدام نان 3.
    ملاحظة: الثابتة العينات المخزنة بهذه الطريقة يجب تصويرها خلال 48 ساعة من أجل تحقيق النتائج المثلى.

5. التسليم الخلوي ديو وديو-LCNPs والحنق التصوير في الخلايا الحية

ملاحظة: في هذه الطريقة، colabeled الخلايا مع 6 ميكرومتر كل ديو-LCNP-PEG-تشول (حيث ديو هو المانحة الحنق) و1،1'-dioctadecyl-3،3،3 "، بيركلورات 3'-tetramethylindocarbocyanine (صلاح الغيدان مجانا، حيث الجاذبة هو متقبل الحنق). ويؤكد الافراج عن ديو من ديو-LCNP-PEG-تشول وإدماجه في غشاء البلازما من قبل الزيادة الملحوظة في نقل الطاقة من المانحين ديو إلى متقبل الجاذبة.

  1. خلايا التسمية بالتتابع مع ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة الصحائفالبريد باستخدام الطريقة الموضحة في الخطوة 4.
  2. بعد التلوين، وغسل الخلايا 1 مرة مع DPBS (2 مل) باستخدام ماصة المصلية واستبدال غسل العازلة مع 2 مل من محلول التصوير الخلية الحية (LCIS).
  3. على خشبة المسرح المجهر مجهزة غرفة الحضانة ساخنة، صورة عينة الخلايا الحية باستخدام المجهر متحد البؤر (الهدف 60X) مع تكوين الحنق التصوير في 30 فترات دقيقة على مدى 4 ساعات بواسطة مثير المتبرع ديو في 488 نانومتر، وجمع الانبعاثات الكامل أطياف من كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة 490-700 نانومتر مع الطيف للكشف عن 32 قناة.
  4. ملاحظة: للحصول على مزيد من المعلومات حول التصوير الحنق، يرجى أنظر المرجع 15.
  5. تحديد كثافة الانبعاثات وقت حل كل من الجهات المانحة ديو ومتقبل الجاذبة من خلايا ملطخة ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة. حساب متقبل / المانحة وقت حل الحنق نسبة (الجاذبة EMI / ديو EMI) للصور، والتي سوف تزيد باطراد، وفي نهاية المطاف لوحةاو مرة واحدة كمية من ديو المانحة قسمت إلى الغشاء قد وصل إلى أقصى 16.

6. السمسة الفحص ديو وديو-LCNPs إلى كلوة 293T / 17 خلايا

ملاحظة: يتم تقييم السمية الخلوية من المواد ديو-LCNP باستخدام انتشار فحص 17 صبغية-نتروبلو. الخلايا المستزرعة في لوحة multiwell في وجود تركيزات مختلفة من المواد في ظل الظروف التي تحاكي التسليم / وضع العلامات. ثم يتم تربيتها الخلايا لمدة 72 ساعة للسماح للانتشار. صبغة (MTS، (3- (4،5-dimethylthiazol-2-YL) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfophenyl) -2H-نتروبلو) ثم يتم إضافته إلى الآبار، وتنشط عملية الأيض خلايا تحويل الصبغة إلى منتج formazan الأزرق، وكمية من تشكيل اللون يتناسب طرديا مع عدد من خلايا قابلة للحياة.

  1. حصاد كلوة 293 T1 / 7 خلايا من القارورة T-25 عن طريق اتباع الإجراء الموضح في الخطوة 3.2.Seedكلوة 293T 17 خلية / (5000 خلية / 100 ميكرولتر / جيد) إلى آبار لوحة 96-جيدا المعالجة زراعة الأنسجة والثقافة لمدة 24 ساعة.
  2. تماما إزالة وسائل الإعلام والثقافة من الآبار باستخدام micropipette وإضافة 50 ميكرولتر من HEPES-DMEM تحتوي على ديو الحرة، ديو-LCNPs، أو ديو-LCNP-PEG-تشول إلى زيادة تركيزات لتكرار الآبار. احتضان على الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة.
    ملاحظة: عادة، ويكرر ذلك في ثلاث نسخ أو quadruplicate كافية لتكشف عن بيانات موثوقة إحصائيا.
    1. بعد الحضانة، وإزالة المتوسطة تسليم تحتوي على مواد باستخدام micropipette واستبدالها مع 100 ميكرولتر من متوسط ​​النمو. ثقافة الخلايا لمدة 72 ساعة.
  3. إضافة 20 ميكرولتر من الركيزة نتروبلو إلى كل بئر، والعودة إلى لوحة الحاضنة، والسماح بتشكيل اللون بالمضي قدما عند 37 درجة مئوية لمدة 4 ساعات. قراءة الامتصاصية (ABS) من الناتج formazan في 570 نانومتر (الدنيا امتصاص لديو-LCNPs المستخدمة في هذا ستودى) و 650 نانومتر (لالطرح الامتصاصية الخلفية غير محددة) باستخدام قارئ وحة microtiter.
  4. رسم القيمة التفاضلية الامتصاصية (القيمة المطلقة 570 - القيمة المطلقة 650) مقابل تركيز المواد وتقديم تقرير عن نتائج كنسبة مئوية من تكاثر الخلايا السيطرة (درجة انتشار الخلايا في خلية ثقافة المتوسط فقط).

تحليل 7. البيانات

  1. إحصائية تحليل البيانات مع تحليل أحادي المتغير التباين (ANOVA). للمقارنات المتعددة، وتطبيق اختبار بونفيروني وخاصة في مرحلة ما بعد. توفير كافة القيم المتوسطة كما ± الخطأ المعياري للمتوسط ​​(SEM) مالم يذكر غير ذلك.
    وكانت احتمال مقبول لأهمية ف <0.05: ملاحظة.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

أعدت LCNPs التي تم تحميلها جوهر مسعور من NP مع ممثل غشاء وضع العلامات التحقيق لإثبات فائدة من LCNP باعتباره وسيلة فعالة لتقديم الشحنات مسعور. لهذا الغرض، وكانت البضائع اختيار عالية غير قابلة للذوبان في الماء الجهدية غشاء وضع العلامات صبغ، ديو. تم توليفها LCNPs تحميل ديو (ديو-LCNPs) باستخدام تقنية مصغرة مستحلب مرحلتين مع المكونات الكيميائية DACTP11، AC10COONa، وديو، كما هو مبين في الشكل 1 18. في هذا النظام NP، شبكة البوليمر مرتبطة تساهميا الوكيل عبر ربط البلورية DACTP11 يوفر الأساسية مسعور مستقر حيث يتواجد ديو في مجالات محصورة في شبكة crosslinked. مجموعات الكربوكسيل على سطح NP توفر الاستقرار الغروية إلى الجسيمات في الأوساط المائية بينما يخدم أيضا مجموعة وظيفية "مقبض" لإلحاق بروابط استهداف الخلايا(والبيولوجية الأخرى). إلى حبل في ديو-LCNPs إلى غشاء البلازما، وهي منتهية أمين مضاد للفيروسات الكولسترول شاردة (PEG-تشول) كان يعلق تساهمي إلى السطح LCNP عبر اقتران EDC (الشكل 1). بعد تركيب NP وتأكيد bioconjugation ناجحة، وقدرة ديو-LCNPs لتسمية الغشاء البلازمي للخلايا الحية، وتسليم البضائع ديو جزءا لا يتجزأ من الجزء محبة للدهون من طبقة ثنائية الغشاء البلازمي مع تحسين النوعية وحركية بالمقارنة مع مجانا تم تقييم النموذج (ديو الحرة) سلمت من حل الجزء الأكبر.

كما هو مبين في الشكل ديو مجانا (6.0 ميكرومتر) ملطخة بقوة غشاء البلازما مع كفاءة عالية (ما يقرب من 100٪ من الخلايا المسمى) بعد 15 دقيقة من الحضانة مع كلوة 293T / 17 الخلايا. ومع ذلك، لوحظ استيعاب الخلوي كبير من ديو مجانا عند سوى زيادة متواضعة فيفترة حضانة لمدة 30 دقيقة (الشكل 2 ألف وجيم). تم تحديد مدى ديو الداخلي المجاني عن طريق التجارب colocalization وقت حل فيه حضنت أولا الخلايا مع 6.0 ميكرومتر ديو مجانا (30 دقيقة). ثم أقيل ديو المحتوية مجانا حضانة المتوسطة، وكانت الخلايا مثقف في وقت لاحق لمدة تصل إلى 4 ساعات. تم counterstained أغشية البلازما من الخلايا مع غشاء فسفوليبيد المسمى صبغ (phosphoethanolamine مترافق لرودامين باء؛ PE-رودا). كما هو مبين في الشكل 2 بعد 15 دقيقة من الحضانة، وcolocalized ما يقرب من 100٪ من ديو مجانا مع علامة PE-رودا (معامل colocalization بيرسون، PCC = 0.99 ± 0.01). ومع ذلك، وبعد 30 دقيقة من الحضانة ~ بقيت 80٪ من ديو مجانا منضمة إلى غشاء (~ 20٪ المنضوية). ارتفعت درجة ديو استيعاب مجانا باطراد مع التم تمديد وقت ه حضانة لطالما 4 ساعات، وهذا انعكس في انخفاض يصاحب ذلك في PCC بين ديو ورودا-PE (الشكل 2 C). وكشف صالح من البيانات إلى مرحلة واحدة تسوس الأسي المعادلة التي تدخيل مجانا ديو وصلت إلى الحد الأقصى من ~ 50٪ في 1 ساعة، بمعدل استيعاب (ك = 0.045 دقيقة -1) ونصف العمر (15 دقيقة) تعكس امتصاص الخلوي السريع والفعال للديو الحرة. وتوضح هذه البيانات تعتمد على الوقت التحول السريع ديو خالية من غشاء البلازما إلى العصارة الخلوية، حيث ظلوا مستبعدين إلى حد كبير من النواة على مدى فترة زمنية 4 ساعات فحصها.

ونظرا لامتصاص الخلوي غير المنضبط للديو مجانا، أصبح هدف لتعديل هذا السلوك من خلال تقديم ديو بمثابة صياغة LCNP-PEG-تشول NP. عندما ألقى باعتبارها bioconjugate LCNP-PEG-تشول، وRESID غشاء أكثر ثباتاولوحظ الوقت سينعقد في ديو مقارنة ديو مجانا (الشكل 2 ب). بعد 15 دقيقة من حضانة ديو-LCNP-PEG-تشول مع الخلايا، ويقع ما يقرب من 100٪ من إشارة ديو في غشاء البلازما، حيث تم colocalized مع الغشاء علامة PE-رودا، وهي النتيجة التي كانت مماثلة ل تلك التي لوحظت لديو الحرة. ولوحظ، مع ذلك، أنه في حين أن وضع العلامات ديو الحرة للغشاء موحدة تماما ومتجاورة، كان النمط تلطيخ من ديو-LCNP-PEG-تشول بعد 15 دقيقة من الحضانة أكثر منقط وليس ما يقرب من موحدة في الطبيعة (الشكل 2 ب). وأشارت هذه النتيجة أن ديو-LCNP-PEG-تشول مصادر القدرة النووية كانوا يجمعون في مناطق منفصلة داخل غشاء البلازما. عندما تمت زيادة فترة حضانة لمدة 30 دقيقة، ~ لا تزال 94٪ من إشارة ديو في الغشاء (مقارنة ب ~ 80٪ عن ديو الحرة في هذه المرحلة الزمنية نفسها) (الشكل 2 B و2C). وأصبح هذا الاتجاه أكثر وضوحا كما كانت الخلايا المستزرعة مع مصادر القدرة النووية ديو-LCNP-PEG-تشول لفترات أطول على نحو متزايد بعد أولية حضانة 30 دقيقة. على سبيل المثال، بعد ثقافة لمدة 1 ساعة بعد الحضانة الأولية، وظلت ما يقرب من 80٪ من إشارة ديو-LCNP-PEG-تشول NP غشائي وcolocalized مع علامة PE-رودا (مقارنة ب ~ 55٪ عن ديو مجاني). والجدير بالذكر، بلغ استيعاب الخلوي من ديو-LCNP-PEG-تشول مصادر القدرة النووية بحد أقصى 30٪ في 2 ساعة (70٪ الاحتفاظ الغشاء). وهذا يتوافق مع معدل امتصاص الخلوية (ك = 0.024 دقيقة -1، عمر النصف = 29 دقيقة) هذا هو بالضبط نصف من تلك التي لوحظت لاستيعاب ديو الحرة.

بعد ذلك، قدرة الحمولة ديو جزءا لا يتجزأ من NP-إلى هروب رأس المال بكفاءة من جوهر LCNP وتدخل إلى البيئة محبة للدهون من طبقة ثنائية غشاء البلازما في الطريقة التي تسيطر عليها والوقت التي تعتمد تم تحديدها. إلىتقييم هذا، وضعت إستراتيجية تعتمد الحنق، حيث يخدم ديو كمانح الحنق تشارك في نقل الطاقة إلى صبغ متقبل، الجاذبة. كما هو متوقع، على وضع العلامات الأولي (ر = 0 دقيقة)، سيطر إشارة الانبعاثات من قبل الجهة المانحة ديو الواردة ضمن NPS-غشاء المربوطة (الشكل 3 B). الحنق التصوير من هذا نفس المجال 4 ساعات في وقت لاحق (ر = 240 دقيقة)، ومع ذلك، كشفت عن وجود زيادة كبيرة في إشارة الانبعاثات من متقبل الجاذبة، وتوفير أدلة قوية على الانتقال من الجهات المانحة ديو من صميم LCNP في طبقة ثنائية الغشاء البلازمي (الشكل 3 C). أظهرت دراسة الطبيعة وقت حل هذا التحول انخفاض مطرد في الانبعاثات المانحة ديو إلى جانب وجود زيادة مقابلة في الانبعاثات متقبل الجاذبة خلال نافذة التجريبي 4 ساعات (الشكل 3 D). والجدير بالذكر أن وصلت كفاءة الحنق خلال هذه المرحلة الانتقالية ماكسي لماما في ~ 180 دقيقة وضع العلامات بعد الأولي، مما يشير إلى أن هروب رأس المال وغشاء تقسيم الجهة المانحة ديو قد وصلت إلى الحد الأقصى في هذه المرحلة الزمنية (الشكل 3 E). وقد وفرت هذه البيانات دليلا قويا على تقسيم وقت حل من ديو من NP إلى طبقة ثنائية غشاء البلازما التي وصلت إلى الحد الأقصى ~ 3 ساعات في مرحلة ما بعد الأولية وضع العلامات مع ديو-LCNP-PEG-تشول مصادر القدرة النووية.

وأخيرا، تم إجراء تحليل مقارن السمية الخلوية لديو مجانا مقابل ديو-LCNP-PEG-تشول. عندما حضنت مع كلوة 293T / 17 الخلايا (بتركيز ديو من 6 ميكرومتر في كلتا الحالتين)، كان واضحا أن التغليف من ديو داخل نواة LCNP الموهن السمية الخلوية لها. في حين ديو أثارت مجانا viabilities الخلوية ~ 50٪، والخلايا المحتضنة مع ديو-LCNP-PEG-تشول أظهرت viabilities الخلوية ~ 90٪. (الشكل 4). تراكميا، إلى جانب بيانات الخلية وضع العلامات مع TOXI الخلوي وتظهر البيانات مدينة التحسينات في كل من كفاءة وسم غشاء أساس ديو والتشكيل من السمية الخلوية ديو.

شكل 1
الشكل 1: تمثيل تخطيطي ملزم غشاء ديو-LCNP-PEG-تشول. يتكون ديو-LCNP من الكريستال السائل عبر ربط وكيل أكريليت (DACTP11)؛ السطحي polymerizable منتهية الكربوكسيل (AC10COONa)؛ وصبغ محبة للدهون، ديو. كان مترافق الكولسترول إنهاء بولي (جلايكول الإثيلين) (PEG-تشول) لديو-LCNP عبر اقتران EDC. إضافة تشول إلى السطح ديو-LCNP تتوسط تفضيلية ملزمة للNP إلى غشاء البلازما. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

"1"> الشكل 2
الشكل 2: وقت حل امتصاص الخلوية من ديو الحرة في كلوة 293 T / 17 الخلايا. وقد حضنت ديو مجانا (6.0 ميكرومتر، لوحة (A) أو ديو-LCNP-PEG-تشول ([ديو] = 6.0 ميكرومتر، لوحة (ب) على الطبقات الوحيدة الخلية لمدة 15 دقيقة، وإزالتها، واستبدالها المتوسطة النمو، وكانت الخلايا مثقف لالأوقات المحددة (تصل إلى 4 ساعات). خلايا كانت ملطخة في وقت لاحق مع PE-رودا (2.0 ميكرومتر) والثابتة. تم تصوير هذه العينات لديو (الخضراء) وغشاء ملزمة PE-رودا (أحمر) باستخدام CLSM. ( C) مؤامرة حلها الوقت للفي المئة من بغشاء ديو إشارة حرة أو ديو-LCNP-PEG-تشول بوصفها وظيفة من زيادة فترة حضانة. وقد تم الحصول على البيانات من معامل colocalization بيرسون (PCC، ن = 3 & #177؛ الانحراف المعياري) الأخضر (ديو) والحمراء قنوات (PE-رودا)، ويعبر عنه كنسبة مئوية (± SEM) بعد تطبيع للPCC الموافق 15 دقيقة من الحضانة. شريط النطاق = 20 ميكرون. أعيد طبعها بإذن من المرجع 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (3)
الرقم 3: حل وقت-الحنق يؤكد هروب رأس المال من ديو من ديو-LCNP-PEG-تشول إلى غشاء البلازما. تم costained HEK293T / 17 الخلايا مع ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة، حيث ديو (أخضر ينبعث منها) والجاذبة (الحمراء التي تنبعث منها) الأصباغ بمثابة الجهة المانحة الحنق ومتقبل، على التوالي. صورة (A) مدينة دبي للإنترنت من الخلايا الحية costained مع ديو-LCNP-PEG-تشول ([ديو] = 6.0 ميكرومتر) والجاذبة (6.0 ميكرومتر). لياليتم تصوير وافرة لمراقبة التغير في إشارة الحنق خلال الفترة من 4 ساعات. (ب) و (ج) هي الصور الحنق من الخلية الحية على المستوى البؤري نفسها في ر = 0 دقيقة و t = 240 دقيقة على التوالي. (D) تطبيع، وكثافة الانبعاثات وقت حل المتبرع ديو ومتقبل الجاذبة من خلايا ملطخة ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة وتصويرها في وضع الإثارة الحنق. نسبة الحنق (E) حل الوقت (الجاذبة EMI / ديو EMI) للخلايا المسمى مع ديو-LCNP-PEG-تشول والجاذبة وتصويرها في التكوين الحنق. شريط النطاق = 20 ميكرون. أعيد طبعها بإذن من المرجع 18. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الشكل (4)
الشكل (4) الكمي للخلايا. حضنت ديو الحرة، LCNP، ديو-LCNPs، أو ديو-LCNP-PEG-شول على كلوة 293T / 17 الطبقات الوحيدة الخلية لمدة 15 دقيقة ثم يزال. وجرفت المياه الخلايا وزرعها في وسط النمو لمدة 72 ساعة قبل MTS الفحص. يمثل الرسم البياني شريط المقارنة بين بقاء الخلية (ن = 5 ± SEM) من ديو الحرة، LCNP، ديو-LCNP، وديو-LCNP-PEG-تشول في [ديو] = 6.0 ميكرومتر. الفرق بين ديو الحرة وLCNP، ديو-LCNP، أو ديو-LCNP-PEG-تشول ومعنوي (p <0.001) في 72 ساعة من الحضانة. أعيد طبعها بإذن من المرجع 18. تم تحليل البيانات باستخدام تحليل أحادي المتغير التباين (ANOVA)؛ تم استخدام اختبار اللاحق للبونفيروني للمقارنات متعددة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

هدف استمرار NMDD هو استهداف للرقابة وتسليم التركيبات الدوائية إلى الخلايا والأنسجة، جنبا إلى جنب مع متزامنة تحسين فعالية الدواء. واحد فئة معينة من جزيئات الدواء التي قد يشكلها هذا تحديا كبيرا هو مسعور وكلاء الأدوية / التصوير التي لديها لماما دون الذوبان في الوسط المائي. ابتليت هذه المشكلة الانتقال من المخدرات القوية من في أنظمة زراعة الخلايا في المختبر لإعداد سريرية، وأسفرت عن عدد من جزيئات الدواء واعدة بأنها "على الرف" أو التخلي عنها وعدم متابعتها بشكل أكبر في إعداد سريرية. Wortmannin (Wtmn)، على سبيل المثال، هو المانع من امكانات فوسفتيدلينوستول 3 "تحركات وفوسفتيدلينوستول 3" تحركات ذات الصلة كيناز ولديها امكانات كبيرة وكيلا المضادة للسرطان، ولكن افتقارها للذوبان في الماء وأعاق تقدمه في التجارب السريرية.

في الآونة الأخيرة، Karve وآخرون. أظهرت تحسن سول المياهubility من Wtmn عندما وضعت باعتبارها الدهون البوليمر NP التجمع 19. الساحة احدة يمكن أن تستفيد كثيرا من هذا النوع من تحسين التسليم، والتي تسيطر عليها باعتبارها صياغة NP هي إيصال الأدوية الطاردة للماء والتصوير وكلاء لغشاء البلازما. وهكذا، فإن الهدف هنا لمعالجة هذه العقبة التقنية ووضع منهجية للتغلب على هذه العقبة التكنولوجية.

في تطوير هذه المنهجية، صبغة استهداف غشاء النموذج، ديو تم اختيار، ما برح تاريخيا تعاني من ضعف القابلية للذوبان في الأوساط المائية. هذا يضفي تحديات كبيرة في إيصال معين من الصبغة إلى غشاء البلازما. ومن بين هذه التحديات هي الحاجة لإضافة شكل بلوري من الصبغة مباشرة إلى الخلايا أو الأنسجة أو 10 لاحتضان الخلايا مع تركيزات عالية جدا من ديو بعد التخفيف من الحلول الأسهم المحتوية على مذيبات مثل DMSO 11 و 12.هنا كان نهج ذو شقين: 1) إدراج ديو في صلب مسعور من LCNPs خلال التوليف NP و 2) تعديل تساهميا وكما توليفها-ديو-LCNPs مع مضاد للفيروسات الكولسترول المترافقة (ديو-LCNP-PEG-تشول) لتسهيل التفاعل المباشر لمصادر القدرة النووية تحميل ديو مع غشاء البلازما. وبالفعل، تحسنت هذا النهج بشكل فعال عددا من جوانب تقديم ديو إلى غشاء البلازما.

أولا، كان تضاعفت فترة بقاء غشاء ديو فعال عندما ألقى كتركيبة LCNP مقارنة عندما تم تسليم ديو خالية من حل الجزء الأكبر. ويعزى هذا الوقت الإقامة غشاء موسعة لتوطين ديو-LCNP-PEG-تشول تقارن إلى microdomains طوف الدهون في غشاء البلازما، وهو ما أكدته التجارب شارك في تلطيخ. ثانيا، تم تأكيد تقسيم البضائع ديو في طبقة ثنائية الدهون من خلال التجارب الحنق الذي خدم ديو كما المتبرع إلى متقبل الجاذبة غشاء المقيمين. وأخيرا، فإنبطيئة، وإطلاق سراح المستمر من البضائع ديو في طبقة ثنائية الغشاء قلصت بشكل فعال السمية الخلوية للديو كتبها ~ 40٪.

من المهم تسليط الضوء على عدة نقاط في البروتوكول التي تعتبر بالغة الأهمية لتحقيق النجاح. أولا، تحميل في المئة من ديو في صلب LCNP يجب أن يكون الأمثل تجريبيا في تركيب محاكمة تدير للحصول على التوازن بين الجيل عالية الجودة ديو-LCNP-PEG-تشول مصادر القدرة النووية والمستوى المطلوب من إشارة مضان في التجارب تسليم الخلوية . وبالمثل، يجب أن يكون الأمثل bioconjugation شاردة تشول-PEG-NH2 إلى السطح ديو-LCNP للحصول على المستوى المطلوب من العلامات الخلوي. وأخيرا، فإن عدد الخلايا تطبيقها على أطباق الثقافة المغلفة فبرونيكتين أمر بالغ الأهمية للنجاح، ويجب الحرص على البذور الخلايا في مناطق ذات كثافة من ~ 8 × 10 4 خلية / مل (~ 2.4 × 10 5 خلايا لكل طبق) . عندما يتم المصنف خلايا قليلة جدا، فإنه يؤدي إلى وضع العلامات غشاء غير فعالة، في حين بذر مLLS النتائج كثيفة جدا في الحصول على صور الفقيرة التي لا تظهر بوضوح وضع العلامات غشائي.

واحد الحد المحتمل للبروتوكول كما هو موضح هو أن كفاءة إدماج مختلف الأصباغ والأدوية الأخرى التي تستهدف غشاء سوف تختلف تبعا لللا مائية من البضائع صبغ / المخدرات. في هذه الحالات، فإن بروتوكول التوليف LCNP يتعين اختباره تجريبيا لتحديد الظروف المثلى لتركيب المثالي صبغ / المخدرات التأسيس البضائع.

باختصار، لقد تم تطوير طريقة لأسلوب التسليم المراقب على أساس LCNP من شحنة صبغ مسعور إلى غشاء البلازما من الخلايا الحية أن يتغلب على كثير من التحديات التقنية المرتبطة بتسليم الخلوي من الشحنات غير قابلة للذوبان في الماء. أهمية الشاملة للطريقة هو أنه من الواضح يحسن تسليم محددة من البضائع إلى غشاء البلازما بينما المخففة في وقت واحد والسمية الخلوية المصاحبة التي هي ASSOCiated مع تسليم الشحنات مسعور في تركيزات عالية من حل الجزء الأكبر. هذا النهج ينبغي أن تجد فائدة كبيرة في إيصال الشحنات وكيل صبغ / التصوير مسعور الصعبة بالمثل، ومن المرجح أن تساعد على تسهيل انتقال فعالة، ولكن للذوبان في الماء ضعيف، الشحنات من النظام التجريبي لإعداد سريرية.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

الكتاب تعلن أنه ليس لديهم مصالح مالية المتنافسة.

Acknowledgments

وأيد هذا العمل من قبل برنامج تمويل قاعدة المختبر الوطني المرجعي (وحدة العمل MA041-06-41-4943). معتمد على من قبل المجلس الوطني للبحوث ما بعد الدكتوراه بحوث زمالة.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7, (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3, (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8, (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208, (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11, (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93, (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101, (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97, (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274, (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27, (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (21), 8230-8235 (2012).
استهدفت البلازما غشاء تسليم ومسعور الشحن مغلف في الكريستال السائل الجسيمات النانوية الناقل
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter