Summary
液晶ナノ粒子（LCNP）ナノキャリアは、生細胞の原形質膜に疎水性の貨物の制御送達のためのビヒクルとして利用されます。
Abstract
細胞への薬物/造影剤の制御送達は、治療薬の開発のためおよび細胞シグナル伝達プロセスの研究のために重要です。最近では、ナノ粒子（NPS）は、送達システムの開発にかなりの有望性を示しています。ここでは、液晶NP（LCNP）ベースの送達システムは、プラズマの疎水性領域にNPコア内で、水不溶性の染料、3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）の制御送達のために使用されています膜二重層。複数の分光分析によって確認されるようにNPの合成中に、染料を効率的に、疎水性LCNPコアに組み込まれました。 NP表面にPEG化コレステロール誘導体の結合（DIO-LCNP-PEG-Cholでは）HEK 293T / 17細胞における形質膜に色素を負荷したNPの結合を可能にしました。時間分解レーザー走査型共焦点顕微鏡および蛍光共鳴エネルギー移動（FRET）画像化は、パスを確認しましたLCNPコアと形質膜二重層中への挿入のDIOの流出をアイブ。最後に、LCNP-PEG-CholのようDIOの送達は、DIOの細胞毒性を弱毒化; DIOのNPの形は自由バルク溶液から配信DIOに比べ〜30から40パーセント低い毒性を示しました。このアプローチは、疎水性分子カーゴの膜特異的送達および変調のための効率的な様式としてLCNPプラットフォームの有用性を示します。
Introduction
生きた細胞を（少なくとも1つの次元での材料≤100nm）のナノ材料をインターフェースの登場以来、継続的な目標は、種々の用途のためのナノ粒子（NPS）のユニークなサイズ依存特性を活用することでした。これらのアプリケーションは、細胞および組織の標識/イメージング（in vitroおよびin vivoの両方）、リアルタイム検知、および薬物および他の貨物1の制御された送達が含まれます。このような関連NP特性の例としては、半導体ナノ結晶のサイズに依存放出（量子ドット、量子ドット）が含まれます。金ナノ粒子の光熱特性。リポソームの水性コアの大積載能力;このような単層カーボンナノチューブおよびグラフェン等の炭素同素体のバリスティック伝導。
最近では、かなりの関心は、このようなコントラスト/イメージングAとして、薬物および他の貨物の制御された変調のためのNPの使用中に生じました紳士。ここでは、理論的根拠は大幅に/強化NP製剤としてそれを提供することにより、薬物貨物の全体的な溶解性、送達用量、循環時間、および最終的なクリアランスを最適化することです。これは、NP-媒介薬物送達（NMDD）として知られるようになってきた、と様々な癌および臨床試験の様々な段階でより多くの何百を治療する診療所で使用するための7のFDA承認NPの薬物製剤は、現在存在します。本質的には、目標は「より少ないリソースでより多くを達成; "することですそれは、大きな表面積を利用して、より少ない投薬投与でより多くの薬物を送達するための足場としてNPを使用することである：NPの量（例えば、量子ドットと金属酸化物として、例えば 、硬質粒子）またはロードするためのそれらの大きな内部容積大型貨物ペイロード（ 例えば 、リポソームまたはミセル）。ここでの目的は、水安定性及び向上した循環を促進すると同時に、特に、複数の全身送達の投薬計画の必要性を低減することです非常に効果的ながら、水性媒体に難溶性である、挑戦的な疎水性薬物の貨物。
したがって、本明細書に記載の研究の目的は、親油性の形質膜二重層の疎水性の貨物の特異的かつ制御された送達のための新規NP足場を使用しての生存率を決定することでした。仕事のための動機は、水性媒体から細胞への疎水性分子の送達に固有の限られた溶解性と難しさでした。典型的には、このような疎水性分子の送達は、内部負荷が限られていることができ、有毒で妥協細胞および組織の生存率2、またはミセル担体とすることができる有機溶媒（ 例えば 、DMSO）または両親媒性の界面活性剤（ 例えば 、ポロキサマー）の使用を必要とします容量。ここで選択されたNP担体は、新規な液晶NP（LCNP）製剤3以前に開発され、それは〜40倍を達成するために、以前に示されていました培養細胞4における抗癌剤ドキソルビシンの有効性の改善。
本明細書中に記載の研究では、選択された代表貨物は電位差膜色素、3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO）でした。 DIOは、生きて固定ニューロン膜電位測定における順行性および逆行性トレースに使用されている水不溶性の色素であり、一般的な膜のための標識5、6、7、8、9。 、その疎水性の性質のために、DIOは、典型的には、結晶形10で細胞単層または組織に直接添加されていますが、非常に高濃度でインキュベートします 濃度原液11、12から希釈した後（〜1〜20μM）。
コンテンツ「LCNPプラットフォームへ>ここで、アプローチがあった使用は、DIO。DIOのための送達媒体として、その内部コア完全に疎水性であり、その表面が同時に親水性およびバイオコンジュゲーションに適している多機能NPは、合成中LCNPコアに組み込まれています、およびNP表面は、次いで、形質膜へのDIO-LCNPアンサンブルの膜結合を促進するためにペグ化コレステロール部分で官能化されている。このアプローチは、より忠実度と膜滞留して原形質膜にDIOに分配送達システムをもたらしDIOの遊離形態は、バルク溶液から送達より時間（DIO フリー ）。さらに、この方法は、DIOのLCNP媒介送達は、実質的に変調して、親油性の細胞膜二重層に色素の具体的な分割の割合を駆動することを示した。これは同時にLCNP製剤としてそれを提供することにより、40％〜によって遊離薬物の細胞毒性を低減しながら達成しました。Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
DIO-LCNPとDIO-LCNP-PEG-Cholでの調製
- 液晶ジアクリレート架橋剤（DACTP11、45 mg）を溶かし、3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine過塩素酸（DIO、2 mg）を、クロロホルム2ml中の重合のためのフリーラジカル開始剤（アゾビスイソブチロニトリル、1 mg）を。アクリレート官能化界面活性剤の水溶液（AC10COONa、7ミリリットル中13ミリグラム）にこれを追加します。
- 水中で重合性界面活性剤に囲まれた有機材料の小滴からなるミニエマルジョンを生成するために5分間、80％の振幅で1時間混合し、超音波処理をかき混ぜます。
- 油浴中で64℃に混合物を加熱 クロロホルムをゆっくりと界面活性剤によって安定化されたDIO含有NP懸濁液を残して、蒸発するように、架橋剤及び界面活性剤の両方の重合を開始します。
- 任意の凝集を除去するために、0.2μmのシリンジフィルターを通してNP懸濁液（3回）をフィルタリングします。サントさらに使用するまで4℃で濾過さNP溶液を再。
- EDCカップリングを介したDIO-LCNPへのPEG-Cholでの結合。
- チョル-PEG-NH 2を溶解・25mMのHEPES緩衝液（pH7.0）中のHCl（PEG-Cholで0.9ミリモル）。
- N -ヒドロキシスクシンナトリウム塩（NHSS、40ミリモル）、濃縮ストック溶液からのHEPES緩衝液中の1-エチル-3-（3-（ジメチルアミノ） -プロピル）カルボジイミド塩酸塩（EDC、400ミリモル）を含む作動溶液を調製します。
- すぐにHEPES緩衝液中DIO-LCNPの1.0ミリリットルにNHSS / EDCの新たに調製したワーキング溶液の20μlを添加し、5分間攪拌。
- この混合物にチョル-PEG-NH 2・HClをストック溶液20μlを加え、2時間撹拌します。
- 簡潔には、卓上小型遠心機を用いて30秒間最高速度（〜2,000×gで）で反応混合物を遠心分離し、で平衡化したPD-10サイズ排除クロマトグラフィーカラム13を介して上清を渡しダルベッコのリン酸緩衝食塩水（DPBS、0.1×）。
DIO-LCNPとDIO-LCNP-PEG-Cholでの2キャラクタリゼーション
- ゲル電気泳動によりDIO-LCNP表面にPEG-Cholでの成功共有結合を確認してください。
- 緩衝液;トリス - ホウ酸電気泳動（89 mMトリス（pHは7.6）、89 mMのホウ酸、および2 mMのEDTA TBE）の50ミリリットル（1×）でアガロースの0.5グラムを溶かし。アガロースを溶解し、マイクロ波オーブン中で溶液を加熱します。ソリューションは少し冷やすと電気ボックス内のゲルプレートに内容を注ぐできるようにします。サンプルウェルを作成するために、ゲルコームを挿入します。
- ゲルが固化した後、チャンバーにバッファを実行しているTBEの（チャンバー内のゲルを沈めるのに十分な）必要な量を追加します。
- ゲルのウェルに（グリセロール、5％v / vので改正）DIO-LCNPサンプルの35μlを添加して、110 Vの電圧で20分間実行します
- 画像ゲルイメージングシステムのWiを用いてゲルを番目の励起および発光フィルターはそれぞれ488 nmおよび500〜550 nmの、で。
- PBS（pH約8、0.1×）でDIO-LCNP溶液（〜200倍希釈）を希釈し、DLS機器14で測定することにより、動的光散乱（DLS）により粒子サイズおよび分布を評価します。適切なゼータ電位測定器を使用して、DIO-LCNPsのゼータ電位を測定します。
配信実験とイメージングのための細胞培養皿の調製
注：DIO-LCNP標識は、以前4に記載のように培養し（継代5と15の間）HEK 293T / 17ヒト胚性腎臓細胞上で行われます。送達実験および以下に説明するように後続の細胞イメージングを行います。
- 20μgの濃度のウシフィブロネクチン（〜100μlでそれらをコーティングすることにより、（14ミリメートル第1カバーガラスインサートを装着）35ミリメートルの直径の組織培養皿を準備/ ml）をDPBS中で37℃で2時間。
- 培養皿からフィブロネクチンコーティング溶液を除去します。収穫HEK最初の洗浄によってT-25フラスコから293 T1 / 7細胞をDPBS 3mLで、次いで、トリプシン-EDTA（0.5％トリプシン、0.25％EDTA）を2mlを添加することにより細胞単層。
- 〜3分間37℃でフラスコをインキュベートします。トリプシン-EDTAを削除し、インキュベーターにフラスコを返します。細胞をフラスコから分離された後、完全培地4mlを添加することによりトリプシンを中和フラスコに（; DMEMダルベッコ改変イーグル培地、10％ウシ胎児血清、5％ピルビン酸ナトリウム、および5％の抗生物質/抗真菌剤を含有するように修正しました） 。セルカウンタでそれらをカウントすることにより、懸濁液中の細胞濃度を決定します。
- 成長培地で〜8×10 4細胞/ mlに細胞濃度を調整します。一晩インキュベーター内で皿や文化に細胞懸濁液の3ミリリットルを追加します。翌日、細胞は〜70％コンフルエントであるべきであり、使用できる状態でなければなりません。十分な細胞密度は、細胞の割合が高いの堅牢かつ効率的な標識のために重要です。
4.細胞DIOとDIO-LCNPsの配信および固定細胞のイメージング
- 配信媒体にDIO、DIO-LCNP、およびDIO-LCNP-PEG-Cholの1 mlの溶液を調製する（HEPES-DMEM; DMEMは、25 mMのHEPESを含む）DIO 自由とDIO-LCNPsの原液を希釈することにより、細胞上でのインキュベーションのための適切なDIO濃度は〜1-10μM（DIO-LCNPの形で自由 DIOやDIOの濃度のいずれかで表される）になります。
- 血清学的ピペットを用いて培養皿から培地を除去し、細胞単層を洗浄HEPES-DMEM（2ミリリットル各洗浄）で2回（ステップ3を参照）。穏やかに/皿の端からピペットを用いて、HEPES-DMEMを追加および削除することにより、洗浄液を実行します。
- 培養皿の中心に準備されたDIO 無料またはDIO-LCNP配信ソリューションの0.2ミリリットルを追加し、私に料理を返します（実験の必要性に応じて、典型的には15または30分）の時間の適切な期間ncubator。より長いインキュベーション時間は、非膜状の領域のより非特異的な細胞の標識（ 例えば 、細胞質ゾル）に追加します。
- インキュベーション期間の後、血清学的ピペットを使用して配信ソリューションを削除します。 DPBS（2ミリリットル各洗浄）で細胞単層を2回洗浄します。静かに皿の縁から/へのDPBSの追加や削除によって洗浄液を実行します。
- 室温で15分間（DPBS中で調製した）4％パラホルムアルデヒドを用いて、細胞単層を固定してください。
注意：パラホルムアルデヒドは、呼吸器刺激可燃性であり、疑いのある発癌物質。 - ピペットを用いて、パラホルムアルデヒド溶液を外し、静かに皿の縁から/へのピペットを用いてDPBSの追加や削除によってDPBS（2ミリリットル）で細胞を1回洗浄します。
- 固定された細胞は、共焦点レーザ走査を用いて膜状蛍光シグナルの存在を撮像する準備ができています顕微鏡（CLSM）。すぐに撮影を行うか、あるいは、NaN 3を0.05％を含有するDPBSで培地を交換し、4℃で料理を保存します。
注意：NaNの3は有毒です。 NaN 3を使用する際に細心の注意を払って。
注：この方法で保存修正されたサンプルは、最適な結果を得るために48時間以内に画像化されるべきです。
ライブ細胞におけるDIOとDIO-LCNPsとFRETイメージングの5細胞送達
注：この方法では、細胞は6μM（DIOがFRETドナーである）各DIO-LCNP-PEG-Cholの1,1'-ジオクタデシル-3,3,3 '、3'-テトラメチル過塩素酸塩（DIIとcolabeledされています、 無料のDiI）はFRETアクセプタです。形質膜へのDIO-LCNP-PEG-Cholを、その取り込みからDIOの放出は、DiIをアクセプターへのDIOドナーからのエネルギー移動の観察された増加によって確認されました。
- DIO-LCNP-PEG-CholのとDiIをFREで順次ラベル細胞Eステップ4に記載した方法を使用して。
- 染色した後、血清学的ピペットを用いて、（2ミリリットル）DPBSで細胞を1回洗浄し、ライブセルイメージングソリューション（LCIS）の2mlで洗浄緩衝液を交換してください。
- 加熱されたインキュベーションチャンバーを備えた顕微鏡のステージ上で、画像生細胞試料488 nmで励起したDIOドナーにより4時間にわたって30分間隔でFRETイメージング構成で共焦点顕微鏡（60X対物レンズ）を使用して、フル発光を集めますDIOドナーおよび32チャンネルのスペクトル検出器を備えた490から700ナノメートルからのDiIアクセプターの両方のスペクトル。
- 注：FRETイメージングの詳細については、15を参照して参照してください。
- DIOドナーとDIO-LCNP-PEG-CholをとのDiIで染色した細胞からのDiIアクセプターの両方の時間分解発光強度を決定します。画像のための時間分解アクセプタ/ドナーFRET比（DII EMI / DIO EMI）を計算し、着実に増加し、最終的には板れます膜に分割DIO供与体の量は、最大値16に達した後のau。
6. DIOの細胞毒性アッセイとDIO-LCNPs HEK 293T / 17細胞へ
注：DIO-LCNP物質の細胞毒性は、テトラゾリウム染料ベースの増殖アッセイ17を使用して評価されます。細胞は、配達/ラベリングをエミュレート条件下での材料の様々な濃度の存在下でのマルチウェルプレート中で培養します。次いで、細胞増殖を可能にするために72時間培養されます。色素（MTS（3-（4,5-ジメチルチアゾール-2-イル）-5-（3-カルボキシメトキシフェニル）-2-（4-スルホフェニル）-2H-テトラゾリウム）をウェルにその後に追加され、代謝的に活性細胞は青色ホルマザン生成物への色素を変換する。発色の量は生存細胞数に正比例します。
- 収穫HEKステップ3.2.Seedに記載された手順に従って、T-25フラスコから293 T1 / 7細胞HEK 293T / 17細胞（5,000細胞/100μl/ウェル）24時間96ウェル組織培養処理プレートと文化のウェルに。
- 完全にマイクロピペットを用いてウェルから培養培地を除去し、ウェルを複製するために濃度を増加で無料 DIO、DIO-LCNPs、またはDIO-LCNP-PEG-Cholのを含むHEPES-DMEMの50μlを添加します。 37℃で30分間細胞上でインキュベートします。
注：一般的に、三重または四重に行わレプリケート統計的に信頼できるデータを得るのに十分です。- インキュベーション後、マイクロピペットを用いて物質を含む配信媒体を除去し、100μlの増殖培地と交換してください。 72時間の培養細胞を。
- 各ウェルにテトラゾリウム基質20μl加えインキュベーターにプレートを戻し、そして発色を4時間37℃で進行させます。 570 nmでのホルマザン産物の吸光度（ABS）を読む（このSTUで使用DIO-LCNPsの吸収最小値非特異的なバックグラウンド吸光度を差し引くためのDY）および650nmの（）マイクロタイタープレートリーダーを用いて。
- 物質濃度対および制御細胞増殖（唯一の細胞培養培地中の細胞の増殖の度合い）のパーセントとして結果を報告-微分吸光度（ABS 650、ABS 570）をプロットします。
7.データ解析
- 統計的分散の単変量解析（ANOVA）を用いてデータを分析します。多重比較のために、ボンフェローニの事後検定を適用します。特に断りのない限り平均値の±標準誤差（SEM）など、すべての平均値を提供します。
注：重要性のために許容できる確率は、p <0.05でした。
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Representative Results
LCNPsは、NPの疎水性コアは、疎水性の貨物のための効率的な送達媒体としてLCNPの有用性を実証するための代表的な膜標識プローブを用いてロードされた中で調製しました。この目的のために、選択された貨物は、高度に水不溶性の電位差膜標識色素、DIOました。 図 1~18に示すように、DIO-ロードLCNPs（DIO-LCNPs）は、化学成分DACTP11、AC10COONa、およびDIOを有する二相ミニエマルジョン法を用いて合成しました。このNPシステムでは、結晶性の架橋剤DACTP11の共有結合した高分子ネットワークは、DIOが架橋ネットワーク内の隙間空間内に存在する安定した疎水性コアを提供します。また、細胞標的リガンドの結合のための官能基として、「ハンドル」を提供している間、NP表面上のカルボキシレート基は、水性媒体中の粒子のコロイド安定性を提供します（および他の生物製剤）。原形質膜へのDIO-LCNPsをテザーに、アミン末端PEG化コレステロール部分（PEG-Cholでは）共有EDCカップリング（ 図 1）を介してLCNP表面に付着しました。 NP合成に成功バイオコンジュゲーションを確認した後、DIO-LCNPsの能力は、生きた細胞の細胞膜を標識するため、自由に比較して改善された特異性や反応速度のプラズマ膜二重層の親油性部分に埋め込まれたDIOの貨物を提供するためにバルク溶液から配信形式（DIO 無料）が評価されました。
図 2（A）に示すように、DIO フリー （6.0μM）が確実に高効率で細胞膜を染色したHEK 293T / 17細胞とのインキュベーションの15分後（細胞のほぼ100％が標識されました）。しかし、DIO 自由の重要な細胞内在化は内のみ適度な増加時に観察されました30分（ 図 2 AとC）にインキュベーション時間。 DIO フリー内在化の程度は、細胞が最初に6.0μMディオフリー （30分）でインキュベートした時間分解共局在実験によって決定しました。 DIO 無料 -含有培養培地を除去し、細胞を4時間までのため、その後培養しました。細胞の原形質膜は色素標識膜リン脂質（; PE-ローダローダミンBにコンジュゲートホスホエタノールアミン）で対比染色しました。 図 2 のCに示されるように、インキュベーションの15分後、DIO フリーのほぼ100％がPE-ローダマーカー（; PCC = 0.99±0.01ピアソンの共局在化係数）と共局在しました。しかし、インキュベーションの30分後〜DIO 自由の80％は、膜（〜20％が内在化）に結合したままでした。 DIO 無料の内在化の程度は、目として着実に増加しました電子のインキュベーション時間は限り4などの時間に延長し、これはDIOとローダ-PE（ 図 2 C）との間にPCCで同時減少に反映されました。一相指数関数的減衰式へのデータのフィットは、DIO 無料の内在が内在化率（kは= 0.045分-1）および半減期（15分）で、1時間で約50％の最大に達したことを明らかにしましたそれは自由な DIOの迅速かつ効率的な細胞取り込みを反映しています。これらのデータは、それが主に検討し4時間の期間にわたって核から排除されたまま細胞質ゾルへの原形質膜から遊離 DIOの迅速な時間依存性の転移を示します。
無料 DIOの制御されない細胞取り込みを考えると、目標はLCNP-PEG-CholのNP製剤としてDIOの配信を通じて、この動作を調節するようになりました。 LCNP-PEG-Cholのバイオコンジュゲートとして提供、より持続的膜残油DIO 無料に比べDIOのレンス時間は、（ 図 2 B）が認められました。細胞とDIO-LCNP-PEG-Cholでのインキュベーションの15分後、DIO信号のほぼ100％は、それがPE-ローダの膜マーカーと共局在した形質膜、に匹敵していた結果に位置していましたそれは無料で DIOを観察しました。これは、膜のDIO 自由標識は非常に均一で連続した一方で、インキュベーションの15分後にDIO-LCNP-PEG-Cholでの染色パターンは、より多くの点状だったではなく、ほぼ自然の中で均一として（ 図ことが指摘されました2 B）。この結果は、DIO-LCNP-PEG-CholでのNPは、原形質膜内の別個の領域中に収集されたことを示しました。インキュベーション時間は、30分に増加させたとき、〜DIO信号の94％は、（この同じ時点での無料 DIOのための〜80％と比較して）膜のままであった（ 図 2 Bおよび2C）。細胞は、最初の30分間のインキュベーションの後、ますます長い時間のためにDIO-LCNP-PEG-CholでのNPと共に培養したように、この傾向はさらに顕著になりました。たとえば、最初のインキュベーション後1時間培養後、DIO-LCNP-PEG-CholのNP信号のほぼ80％が膜状のままであり（ 無料 DIOのための〜55％と比較して）PE-ローダマーカーと共局在します。特に、DIO-LCNP-PEG-CholのNPの細胞内在化は、2時間（70％の膜保持率）で30％の最大に達しました。 無料 DIOの内在化について観察されるの正確半分であり、これは、細胞取り込み速度（半減期= 29分のk = 0.024分-1）に相当します。
次に、NP-埋め込みDIO貨物の能力を効率的LCNPコアから流出し、決定した制御および時間依存的に細胞膜二重層の親油性環境を入力します。にこれを評価DIOは、アクセプター色素、DiIでのエネルギー移動に従事しFRETドナーとして機能する、FRETベースの戦略が考案されました。予想されたように、初期の標識（トン= 0分）の際に、発光信号は、膜繋留のNP（ 図 3 B）内に含まれるDIOドナーによって支配されていました。この同じフィールド4時間後（T = 240分）の撮影をFRETが、原形質膜二重層にLCNPコアからDIO供与体の遷移の強力な証拠を提供したDiIアクセプターの発光シグナルの有意な増加を明らかにしました（ 図 3 C）。この移行の時間分解の性質の試験は、4時間の実験ウィンドウの上のDiIアクセプター発光の増加に対応（ 図 3 D）と結合されたDIOのドナー発光の着実な減少を示しました。注目すべきことに、この遷移の間のFRET効率は、マキシに達しDIOドナーの流出および膜パーティショニングは、この時点（ 図 3 のE）で最大に達したことを示唆している〜180分後に最初のラベリングでお母さん、。これらのデータは、DIO-LCNP-PEG-CholでのNPとの最大〜3時間後に初期の標識に到達した原形質膜二重層にNPからDIOの時間分解分割の強力な証拠を提供しました。
最後に、比較細胞毒性分析は、DIO-LCNP-PEG-Cholの対フリー DIO行きました。 （どちらの場合も6μMのDIO濃度で）HEK 293T / 17細胞とインキュベートした場合、LCNPコア内DIOのカプセル化は、その細胞毒性を弱毒化していることが明らかとなりました。 DIOは無料 〜の細胞生存率を誘発しながら、50％は、DIO-LCNP-PEG-Cholとともにインキュベートした細胞は、細胞の生存率〜90％を示しました。 （ 図 4）。累積的に、携帯toxiに結合された細胞標識データ都市データはDIOベース膜ラベリングの効率とDIOの細胞毒性の変調の両方で機能拡張を示しています。
図 1： 膜結合DIO-LCNP-PEG-Cholでの模式図。 DIO-LCNPはアクリレート液晶架橋剤（DACTP11）で構成されています。カルボキシル末端重合性界面活性剤（AC10COONa）。そして、親油性色素、DIO。コレステロール末端ポリ（エチレングリコール）（PEG-Cholで）は、EDCカップリングを介して、DIO-LCNPに結合させました。 DIO-LCNP表面へのCholの添加は、細胞膜にNPの優先的な結合を媒介します。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 2：HEK 293 T / 17 細胞 中の 遊離 DIOの時間分解細胞への取り込み 。パネル（A）またはDIO-LCNP-PEG-Cholで（[DIO] = 6.0μM、6.0μM（ 無料 DIO、パネル（B）を除去し 、15分間細胞単層上で培養し、増殖培地と交換した。細胞がありました培養された（4時間まで）指示された時間のために。細胞はその後、PE-ローダ（2.0μM）で染色し、固定した。サンプルはCLSMを使用してDIO（緑）、膜結合PE-ローダ（赤）のために画像化しました。（増加インキュベーション時間の関数としての自由やDIO-LCNP-PEG-Cholの信号膜結合DIOのパーセントのC）時間分解プロット。データはピアソンの共局在化係数（PCC、N = 3＆＃から入手しました177;標準緑の偏差）（DIO）と赤（PE-ローダ）チャネル、およびインキュベーションの15分に対応するPCCに正規化した後に百分率（±SEM）として表されます。 =20μmのスケールバー。参照18からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 3：時間分解FRETは、原形質膜にDIO-LCNP-PEG-CholでからDIOの流出を確認しました。 HEK293T / 17細胞は、DIO-LCNP-PEG-CholのとのDiI、DIO（緑色発光）とのDiI（赤発光）染料がそれぞれFRETドナーとアクセプターとして作用で共染色しました。 （A）DIO-LCNP-PEG-Cholで（[DIO] = 6.0μM）とのDiI（6.0μM）で共染色生細胞のDIC画像。の十分な4時間の期間にわたってFRETシグナルの変化をモニターするために画像化しました。 （B）及び（C）は、それぞれ、T = 0分およびt = 240分で、同一の焦点面上に生細胞のFRET画像です。 （D）DIO-LCNP-PEG-CholをとのDiIで染色し、FRETの励磁モードで撮像された細胞からのDIOドナーとのDiIアクセプターの正規化、時間分解発光強度。 DIO-LCNP-PEG-CholをとのDiIで標識し、FRET構成で撮像された細胞について（E）時間分解FRET比（DII EMI / DIO EMI）。 =20μmのスケールバー。参照18からの許可を得て転載。 この図の拡大版をご覧になるにはこちらをクリックしてください。
図 4
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Discussion
NMDDの継続的な目標は、同時改善された薬物の有効性と合わせ、細胞や組織への制御さターゲティングおよび薬物製剤の送達です。これは重要な課題を提起しているために、薬物分子の一つの特定のクラスは、水性媒体中でなし溶解性に難持つ疎水性薬物/造影剤です。この問題は、臨床設定にインビトロ細胞培養系からの強力な薬物の移行を悩ませてきたし、「棚上げ」である有望な薬剤分子の数をもたらしたか、放棄されたと臨床の場でさらに追求していません。ワートマニン（Wtmn）は、例えば、ホスファチジルイノシトール3 'キナーゼおよびホスファチジルイノシトール3'キナーゼ関連キナーゼの強力な阻害剤であり、抗癌剤として大きな可能性を秘めているが、水溶性の欠如は、臨床試験でその進行を妨げています。
最近、Karve ら。改善された水ゾルを示し脂質-ポリマーNPアセンブリ19として処方さWtmnのubility。大幅NP製剤として改善された、制御された送達のこのタイプから利益を得ることができる一方、アリーナは、原形質膜に疎水性薬物及び造影剤の送達です。したがって、ここでの目標は、この技術的なハードルに対処し、この技術的ハードルを克服するための方法論を開発することでした。
この方法論を開発するには、モデル膜を標的とする染料、DIOは、歴史的に水性媒体に乏しい溶解性に悩まされていることを選択しました。これは、原形質膜への色素の特異的送達において重要な課題を与えます。これらの課題のうち、直接細胞または組織10に染料の結晶形を追加したり、そのようなDMSO 11、12のような溶媒を含む原液から希釈した後、DIOの非常に高い濃度で細胞をインキュベートする必要があります。ここでのアプローチは2倍であった：1）NP合成中LCNPsの疎水性コアにDIOを組み込み、2）共有結合を促進するためにPEG化されたコレステロールコンジュゲート（DIO-LCNP-PEG-Cholの）で合成されたDIO-LCNPsを変更します原形質膜とDIO-ロードNPの直接的な相互作用。実際、このアプローチは効果的に細胞膜にDIOの送達の側面の数を向上させます。
DIOは、バルク溶液から無料で配信された場合に比べLCNP製剤として送達された場合まず、DIOの膜滞留時間が効果的に2倍になりました。この拡張膜の滞留時間は、共染色実験によって確認されるようにDIO-LCNP-PEG-Cholでは、原形質膜の脂質ラフトマイクロドメインに結合体の局在化に起因するものでした。第二に、脂質二重層へのDIO貨物の分割は、DIOが膜常駐のDiIアクセプターへのドナーを務めたFRET実験により確認しました。最後に、膜二重層にDIO貨物の遅い、徐放は、効果的に40％〜によってDIOの細胞毒性を弱めました。
成功のために重要であるプロトコルでいくつかの点を強調することが重要です。まず、LCNPコアへのDIOの％の負荷が経験的に裁判合成に最適化されなければならないが、高品質DIO-LCNP-PEG-CholのNPの生成と細胞送達実験における蛍光信号の所望のレベルのバランスを得るために実行されます。同様に、DIO-LCNP表面へのChol-PEG-NH2部分のバイオコンジュゲーションは、細胞の標識の所望のレベルを得るために最適化されなければなりません。最後に、フィブロネクチンでコーティングした培養皿に適用される細胞の数は、成功のために重要であり、ケア〜8×10 4細胞/ mlの密度で細胞を播種するために注意しなければならない（〜皿当たり2.4×10 5細胞） 。細胞があまりにもまばらに播種されている場合、CEを播種しながら、それは、非効率的な膜標識になります明らかに膜状の標識を示さない貧しい画像の取得にあまりに密な結果をLLS。
説明したプロトコルの一つの潜在的な制限は、他の様々な膜標的染料および薬物の取り込みの効率は、染料/薬物貨物の疎水性に依存して変化することがあります。これらの例では、LCNP合成プロトコルは、理想的な染料/薬物カーゴの取り込みのための最適な合成条件を決定するために実験的に試験されなければなりません。
要約すると、この方法は、水不溶性のカーゴの細胞送達に関連した技術的課題の多くを克服する生細胞の原形質膜に疎水性染料貨物のLCNPベースの制御された送達のために開発されてきました。この方法の全体的な重要性を同時に連想である付随する細胞毒性を減衰させることが明らかに細胞膜に貨物の特異的送達を改善することですバルク溶液から高濃度で疎水性の貨物の配達とiated。このアプローチは、同様に困難な疎水性色素/造影剤の貨物の配達に広い有用性を見つける必要があり、おそらく効果的なの移行を促進するのに役立ちます、まだ難水溶性、臨床設定に実験的政権から貨物。
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Disclosures
著者は、彼らが競合する金融利害関係を持たないことを宣言します。
Acknowledgments
この作品は、NRLベース支援プログラム（ワークユニットMA041-06-41-4943）によってサポートされていました。 ONは、国家研究評議会ポスドク研究Associateshipでサポートされています。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous; make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37 °C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous; dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37 °C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37 °C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
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