Målrettet plasmamembran Levering af en hydrofob Cargo indkapslet i en Liquid Crystal Nanopartikel Carrier
Summary
En flydende krystal nanopartikler (LCNP) Nanobærer udnyttes som et køretøj til kontrolleret afgivelse af en hydrofob last til plasmamembranen af levende celler.
Abstract
Den kontrollerede afgivelse af lægemiddel / billeddannende midler til celler er kritisk for udviklingen af terapeutiske midler og til undersøgelse af cellulære signalprocesser. For nylig er nanopartikler (NPS) vist signifikant løfte i udviklingen af sådanne administrationssystemer. Her, har et flydende krystal NP (LCNP) -baseret afgivelsessystem blevet anvendt til kontrolleret afgivelse af et vanduopløseligt farvestof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat (DIO), inde fra NP kernen til det hydrofobe område af et plasma membrandobbeltlag. Under syntesen af NPS, blev farvestoffet effektivt inkorporeres i den hydrofobe LCNP kerne, hvilket bekræftes af flere spektroskopiske analyser. Konjugation af en PEGyleret kolesterolderivatet til NP overflade (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktiveret bindingen af farvestoffet-loaded NP'er til plasmamembranen i HEK 293T / 17 celler. Tidsopløst laserscanning konfokal mikroskopi og Forster-resonansenergioverførsel (FRET) billeddannelse bekræftede passive efflux af DIO fra LCNP kerne og dets insertion i plasmamembranen dobbeltlaget. Endelig levering af DIO som LCNP-PEG-Chol svækket cytotoksicitet af DIO; NP formen af DIO udviste ~ 30-40% mindre toksicitet sammenlignet med DiO fri leveret fra bulkopløsning. Denne fremgangsmåde viser anvendeligheden af LCNP platform som en effektiv modalitet for membranen-specifikke levering og modulering af hydrofobe molekylære ladninger.
Introduction
Siden indførelsen af interfacing nanomaterialer (materialer ≤100 nm i mindst én dimension) med levende celler, har en fortsat mål været at drage fordel af de unikke størrelse-afhængige egenskaber af nanopartikler (NPS) til forskellige applikationer. Disse anvendelser omfatter celler og væv mærkning / imaging (både in vitro og in vivo), real-time sensorteknik og kontrolleret levering af medikamenter og andre laster 1. Eksempler på sådanne relevante NP egenskaber omfatter størrelsen-afhængige udledning af halvledernanokrystaller (quantum dots, QDs); de fototermisk egenskaber af guld nanopartikler; den store lastkapacitet af den vandige kerne af liposomer; og den ballistiske ledningsevne af kulstof allotropes, såsom single-væg kulstof nanorør og graphene.
For nylig er betydelig interesse opstået i anvendelsen af NP'er til reguleret modulering af medikamenter og andre ladninger, såsom kontrast / imaging aherretoilettet. Her rationalet er markant at forbedre / optimere den samlede opløselighed, udsendte dosis samt cirkulation tid, og eventuel clearance af lægemidlet last ved at levere det som et NP-formulering. Det er kommet til at blive kendt som NP-medieret drug delivery (NMDD), og der er i øjeblikket syv FDA-godkendte NP narkotika formuleringer til brug i klinikken til behandling af forskellige kræftformer og hundredvis flere i forskellige stadier af kliniske forsøg. I det væsentlige, målet er at "opnå mere med mindre" det vil sige at bruge NP som et stillads til at levere mere lægemiddel med færre dosering administrationer ved at udnytte det store overfladeareal: volumen (fx hårde partikler, såsom QDs og metaloxider) NPS eller deres store indre volumen til lastning store cargo nyttelast (f.eks liposomer eller miceller). Formålet her er at reducere behovet for flere systemisk leveret doseringsregimer, mens på samme tid at fremme vandig stabilitet og øget omsætning, især forudfordrende hydrofobt lægemiddel ladninger, at selv meget effektiv, er tungtopløselige i vandige medier.
Derfor er målet af arbejdet beskrevet heri var at bestemme levedygtigheden af anvendelse af en hidtil ukendt NP stillads for det specifikke og styret afgivelse af hydrofobe ladninger til den lipofile plasmamembran dobbeltlaget. Motivationen for arbejdet var den iboende begrænset opløselighed og vanskeligheder i leveringen af hydrofobe molekyler til celler fra vandige medier. Typisk levering af sådanne hydrofobe molekyler kræver anvendelse af organiske opløsningsmidler (f.eks DMSO) eller amfifile overfladeaktive midler (f.eks poloxamerer), som kan være giftige og kompromis celler og væv levedygtighed 2, eller micelle-bærere, som kan have begrænset intern loading kapaciteter. NP bærer valgt her var en hidtil ukendt flydende krystal NP (LCNP) formulering tidligere udviklet 3 og at der var blevet vist tidligere for at opnå en ~ 40-fold forbedring af effektiviteten af anticancer drug doxorubicin i dyrkede celler 4.
I arbejdet beskrevet heri, den repræsentative last valgte var den potentiometrisk membran farvestof, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorat (DIO). DiO er et vanduopløseligt farvestof, der er blevet anvendt til anterograd og retrograd sporing i levende og fikserede neuroner, membranpotentialet målinger, og til generel membran mærkning 5, 6, 7, 8, 9. På grund af dets hydrofobe natur er DiO typisk tilsættes direkte til cellemonolag eller væv i en krystallinsk form 10, eller det inkuberes ved meget høje koncentrationer (~ 1-20 uM) efter fortynding fra en koncentration stamopløsning 11, 12.
indhold "> Her fremgangsmåde var brug for LCNP platform, er en multifunktionel NP hvis indre kerne er helt hydrofob og hvis overflade er samtidig hydrofil og modtagelig for bioconjugation, som et køretøj levering til DiO. DiO inkorporeret i LCNP kerne under syntesen og NP overflade derpå funktionaliseret med en PEGyleret cholesterol-del for at fremme membranbinding af DIO-LCNP ensemble til plasmamembranen. Denne fremgangsmåde resulterede i et afgivelsessystem, der fordeltes DIO ind plasmamembranen med større nøjagtighed og membran opholdssted tid end den frie form af DIO leveres fra bulkopløsning (DIO fri). Endvidere viste denne fremgangsmåde, at LCNP-medieret levering af DIO væsentlige modulerer og driver hastigheden for specifik opdeling af farvestoffet i den lipofile plasmamembran dobbeltlaget. det er opnås, mens samtidig reducere cytotoksiciteten af det frie lægemiddel ved ~ 40% ved at levere den som en LCNP formulering. <p class = "jove_content"> Det forventes, at den her beskrevne metode vil være en stærk muliggør teknik til forskere, hvis arbejde indebærer eller kræver den cellulære levering af meget hydrofobe laster, der er tungt opløselige eller helt uopløselig i vandig opløsning.Protocol
Representative Results
Discussion
En fortsat modstanderen NMDD er det kontrollerede målretning og afgivelse af lægemiddelformuleringer til celler og væv, kombineret med samtidig forbedret lægemiddeleffektivitet. En specifik klasse af lægemiddelmolekyler, hvor dette har udgjort en betydelig udfordring er hydrofobe lægemidler / billeddannende midler, der har sparsomt til ingen opløselighed i vandige medier. Dette problem har plaget overgang potente lægemidler fra in vitro cellekultursystemer til det kliniske miljø og har resulteret i en …
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af NRL Base Funding Program (Work Unit MA041-06-41-4943). ON understøttes af en National Research Council Postdoc Research Associateship.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
