Summary

Targeted membrana plasmática Entrega de cargo encapsulado hidrofóbico en un cristal líquido portador de nanopartículas

Published: February 08, 2017
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Summary

Una nanopartícula de cristal líquido (LCNP) nanotransportador es explotado como un vehículo para la administración controlada de una carga hidrofóbica en la membrana plasmática de las células vivas.

Abstract

La entrega controlada de agentes de fármaco / de formación de imágenes a las células es crítico para el desarrollo de agentes terapéuticos y para el estudio de los procesos de señalización celular. Recientemente, nanopartículas (NP) han mostrado una promesa significativa en el desarrollo de tales sistemas de administración. Aquí, un NP (LCNP) sistema de entrega basado en cristal líquido se ha empleado para el suministro controlado de un colorante insoluble en agua, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO), desde dentro del núcleo NP de la región hidrófoba de un plasma bicapa de la membrana. Durante la síntesis de los PN, el colorante se incorporó de manera eficiente en el núcleo hidrófobo LCNP, según lo confirmado por análisis espectroscópico múltiple. La conjugación de un derivado de colesterol PEGilado a la superficie de NP (DIO-LCNP-PEG-Chol) activar la unión de los NPs colorante cargado a la membrana plasmática en células HEK 293T / 17 células. Resuelta en el tiempo de escaneo láser confocal de microscopía y la transferencia de energía de resonancia de Förster (FRET) de imágenes confirmó el paseive flujo de salida de DiO desde el núcleo LCNP y su inserción en la bicapa de la membrana de plasma. Por último, la entrega de DiO como LCNP-PEG-Chol atenúa la citotoxicidad de DiO; la forma de Dio NP exhibió ~ 30-40% menor toxicidad en comparación con DiO libre liberado de solución a granel. Este enfoque demuestra la utilidad de la plataforma LCNP como una modalidad eficaz para la entrega de membrana específico de modulación y de cargas moleculares hidrófobas.

Introduction

Desde el advenimiento de la interfaz nanomateriales (materiales ≤100 nm en al menos una dimensión) con células vivas, un objetivo continuo ha sido tomar ventaja de las propiedades únicas dependientes del tamaño de las nanopartículas (NP) para diversas aplicaciones. Estas aplicaciones incluyen células y tejidos etiquetado / formación de imágenes (tanto in vitro como in vivo), la detección en tiempo real, y la administración controlada de fármacos y otros cargos 1. Ejemplos de tales propiedades relevantes NP incluyen la emisión dependiente del tamaño de los nanocristales semiconductores (puntos cuánticos, los puntos cuánticos); fototermales las propiedades de las nanopartículas de oro; la gran capacidad de carga del núcleo acuoso de liposomas; y la conductividad balístico de alótropos de carbono, tales como nanotubos de carbono de pared simple y grafeno.

Más recientemente, ha surgido un interés significativo en el uso de los PN para la modulación controlada de fármacos y otras cargas, como contraste / imagen de unacaballeros. Aquí, la razón es para mejorar significativamente / optimizar la solubilidad en general, la dosis administrada, el tiempo de circulación, y el aclaramiento eventual de la carga de drogas mediante la entrega como una formulación NP. Esto ha llegado a ser conocido como la administración de fármacos mediada NP (NMDD), y actualmente hay siete formulaciones de fármacos NP aprobados por la FDA para su uso en la clínica para el tratamiento de varios tipos de cáncer y cientos más en distintas fases de ensayos clínicos. En esencia, el objetivo es "lograr más con menos"; es decir, utilizar el NP como un andamio para entregar más fármaco con un menor número de administraciones de dosificación mediante el aprovechamiento de la gran área superficial: volumen (por ejemplo, partículas duras, tales como puntos cuánticos y óxidos metálicos) de PN o de su gran volumen interior para la carga grandes cargas útiles de carga (por ejemplo, liposomas o micelas). El objetivo aquí es reducir la necesidad de múltiples regímenes de dosificación sistémicamente entregadas mientras que al mismo tiempo la promoción de la estabilidad acuosa y una mayor circulación, en particular paradesafiantes cargamentos de drogas hidrofóbicas que, aunque muy eficaz, son poco solubles en medios acuosos.

Por lo tanto, el objetivo del trabajo descrito en la presente memoria fue determinar la viabilidad del uso de una novela NP andamio para la entrega específica y controlada de cargas hidrófobas a la bicapa de la membrana de plasma lipófilo. La motivación para el trabajo era la solubilidad limitada inherente y la dificultad en la entrega de moléculas hidrófobas a las células a partir de medios acuosos. Típicamente, la entrega de dichas moléculas hidrófobas requiere el uso de disolventes orgánicos (por ejemplo, DMSO) o tensioactivos anfifílicos (por ejemplo, poloxámeros), que pueden ser tóxicos y compromiso de células y tejidos viabilidad 2, o portadores de micelas, que puede tener la carga interna limitada capacidades. El soporte elegido NP NP aquí fue una formulación (LCNP) novela de cristal líquido desarrollado previamente 3 y que se había demostrado previamente para lograr un ~ 40 veces mejora en la eficacia de la doxorubicina medicamento contra el cáncer en células cultivadas 4.

En el trabajo descrito en este documento, la carga representante seleccionado fue el colorante de membrana potenciométrica, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DIO). DiO es un colorante insoluble en agua que se ha utilizado para anterógrada y rastreo retrógrado en neuronas fijos de estar y, las mediciones de potencial de membrana, y para el etiquetado general de membrana 5, 6, 7, 8, 9. Debido a su naturaleza hidrófoba, DiO típicamente se añade directamente a las monocapas de células o tejidos en una forma cristalina 10, o se incubó a concentraciones muy altas (~ 1-20 mM) después de la dilución de una solución de concentración madre 11, 12.

contenido "> Aquí, el enfoque fue el uso de la plataforma LCNP, un NP multifuncional cuyo núcleo interno es completamente hidrófoba y cuya superficie es a la vez hidrófila y susceptibles de bioconjugación, como vehículo de administración para DiO. DiO se incorpora en el núcleo LCNP durante la síntesis , y la superficie de NP es entonces funcionalizado con una fracción de colesterol PEGilado para promover la unión del conjunto dio-LCNP a la membrana plasmática de la membrana. Este enfoque dio como resultado un sistema de entrega que se repartió la diO en la membrana de plasma con mayor fidelidad y residencia membrana el tiempo y la forma libre de DiO entrega de la solución a granel (DiO libre). Además, este método mostró que la entrega LCNP mediada de DiO modula sustancialmente y acciona la tasa de partición específica del colorante en la bicapa de la membrana plasmática lipófilo. esto es alcanzado mientras que de forma concomitante reducción de la citotoxicidad del fármaco libre por ~ 40% mediante la entrega como una formulación LCNP.

<p clculo = "jove_content"> Se anticipa que la metodología descrita en este documento será una poderosa técnica que permite a los investigadores cuyo trabajo implique o requiera la entrega celular de cargas altamente hidrofóbicos que son poco solubles o completamente insoluble en solución acuosa.

Protocol

1. Preparación de Dio-LCNP y dio-LCNP-PEG-Chol Disolver diacrilato cristalino líquido agente de reticulación (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perclorato (DiO, 2 mg), y un iniciador de radical libre (azobisisobutironitrilo, 1 mg) para la polimerización en 2 ml de cloroformo. Añadir esto a una solución acuosa de tensioactivo funcionalizado con acrilato (AC10COONa, 13 mg en 7 ml). Se agita la mezcla durante 1 hr y se somete a ultrasonidos a 80% de amplitud durante 5 minutos p…

Representative Results

LCNPs se prepararon en la que el núcleo hidrofóbico de la NP se cargó con una sonda de membrana de etiquetado representante para demostrar la utilidad de la LCNP como un vehículo de suministro eficiente para cargas hidrófobas. Para este propósito, la carga elegido fue el potenciométrica colorante membrana de etiquetado altamente insoluble en agua, DiO. LCNPs cargadas con DiO (DIO-LCNPs) se sintetizaron utilizando una técnica de mini-emulsión de dos fases con los componentes químicos DACTP11, AC10COONa, y DiO, …

Discussion

Un objetivo continuo de NMDD es la orientación controlada y entrega de formulaciones de fármacos a células y tejidos, en combinación con la eficacia del fármaco mejorada simultánea. Una clase específica de moléculas de fármacos para los que esto ha supuesto un importante reto es agentes drogas / imagen hidrófobos que tienen con moderación para ninguna solubilidad en medios acuosos. Este problema ha plagado la transición de fármacos potentes de en sistemas de cultivo celular in vitro para e…

Disclosures

The authors have nothing to disclose.

Acknowledgements

Este trabajo fue apoyado por el Programa de Fondos Base NRL (Unidad de Trabajo MA041-06-41-4943). EN está soportado por un miembro asociado de investigación postdoctoral del Consejo Superior de Investigaciones Científicas.

Materials

1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous/ make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous/ make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37°C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37°C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous, dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37°C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37°C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

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Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

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