Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Targeted Plasma Membrane Livraison d'un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

Un cristal liquide nanoparticule (LCNP) nanocarrier est exploitée en tant que véhicule pour la libération contrôlée d'une cargaison hydrophobe à la membrane plasmique de cellules vivantes.

Abstract

La libération contrôlée d'agents de médicament / d'imagerie vers les cellules est critique pour le développement de thérapies et pour l'étude des processus de signalisation cellulaire. Récemment, des nanoparticules (NP) ont montré prometteur dans le développement de ces systèmes de livraison. Ici, un NP (LCNP), système de délivrance à base de cristaux liquides a été utilisé pour la distribution contrôlée d'un colorant insoluble dans l'eau, le 3,3'-perchlorate dioctadecyloxacarbocyanine (DIO), à l'intérieur du noyau NP dans la région hydrophobe d'un plasma bicouche membranaire. Lors de la synthèse des PN, le colorant est efficacement incorporé dans le coeur de LCNP hydrophobe, tel que confirmé par analyse spectroscopique multiples. Conjugaison d'un dérivé du cholestérol pégylé à la surface NP (DiO LCNP-PEG-Chol) a permis la liaison du PN chargées de colorant sur la membrane plasmatique dans des cellules HEK 293T / 17 cellules. Résolue en temps laser microscopie confocale et Förster transfert d'énergie par résonance (FRET) imagerie a confirmé le passageive efflux de DiO du noyau LCNP et son insertion dans la bicouche de la membrane plasmique. Enfin, la livraison de DiO comme LCNP-PEG-Chol atténué la cytotoxicité de DiO; la forme NP de DiO présentait ~ 30-40% moins de toxicité par rapport à DiO libre délivré de solution en vrac. Cette approche démontre l'utilité de la plate-forme LCNP comme modalité efficace pour la prestation spécifique à membrane et la modulation des cargaisons moléculaires hydrophobes.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Depuis l'avènement de l'interfaçage nanomatériaux (matériaux ≤100 nm dans au moins une dimension) avec des cellules vivantes, un objectif constant a été de tirer parti des propriétés de taille dépendant uniques des nanoparticules (NPs) pour diverses applications. Ces applications comprennent l' étiquetage cellulaire et tissulaire / imagerie (in vitro et in vivo), la détection en temps réel, et la livraison contrôlée de médicaments et d' autres cargaisons 1. Des exemples de ces propriétés NP pertinents comprennent l'émission dépendant de la taille des nanocristaux semi-conducteurs (quantum dots, QD); les propriétés photothermiques de nanoparticules d'or; la grande capacité de chargement du coeur aqueux des liposomes; et la conductivité balistique des allotropes de carbone, tels que les nanotubes de carbone à paroi unique et graphène.

Plus récemment, un intérêt significatif a été soulevée dans l'utilisation des IP pour la modulation contrôlée de médicaments et d'autres cargaisons, tels que le contraste / imagerie d'ungents. Ici, la raison d'être est d'améliorer de manière significative / optimiser la solubilité dans l'ensemble, la dose administrée, le temps de circulation, et la clairance éventuelle de la cargaison de drogue en le remettant en formulation NP. Ceci est venu à être connu comme la délivrance de médicaments NP-médiée (NMDD), et il y a actuellement sept formulations de médicaments NP approuvés par la FDA pour une utilisation dans la clinique pour traiter divers cancers et des centaines d'autres à divers stades d'essais cliniques. En substance, l'objectif est de «faire plus avec moins;" qui est, d'utiliser le NP comme un échafaudage pour offrir plus de médicament avec moins administrations de dosage en tirant parti de la grande surface: volume (par exemple, des particules dures, telles que QDs et oxydes métalliques) de NPs ou de leur grand volume intérieur pour le chargement grandes charges utiles de marchandises (par exemple, des liposomes ou micelles). Le but ici est de réduire la nécessité de multiples schémas posologiques systématiquement livrés en même temps la promotion de la stabilité aqueuse et la circulation améliorée, en particulier pourcargaisons de médicaments hydrophobes difficiles qui, bien que très efficace, peu solubles dans les milieux aqueux.

Ainsi, l'objectif du travail décrit ici était de déterminer la viabilité de l'utilisation d'un roman NP échafaudage pour la livraison spécifique et contrôlée de cargaisons hydrophobes à la lipophile bicouche de la membrane plasmique. La motivation pour le travail était la solubilité limitée inhérente et de la difficulté dans la fourniture de molécules hydrophobes à des cellules de milieux aqueux. Typiquement, la livraison de ces molécules hydrophobes nécessite l'utilisation de solvants organiques (par exemple, DMSO) ou des tensioactifs amphiphiles (par exemple, poloxamères), qui peuvent être toxiques et de compromis cellulaire et tissulaire viabilité 2, ou des supports de micelles, ce qui peut avoir limité le chargement interne capacités. Le transporteur NP choisi ici est un cristal liquide NP (LCNP) formulation nouvelle développée précédemment 3 et qui avait été montré précédemment pour atteindre un facteur 40 ~ l' amélioration de l'efficacité du médicament anticancéreux doxorubicine dans des cellules cultivées 4.

Dans le travail décrit ici, la cargaison représentant choisi était le potentiométrique colorant membranaire, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DIO). DiO est un colorant insoluble dans l'eau qui a été utilisée pour antérograde et rétrograde traçage dans les neurones vivants et fixes, les mesures du potentiel de membrane, et la membrane générale étiquetage 5, 6, 7, 8, 9. En raison de sa nature hydrophobe, DiO est typiquement ajouté directement aux monocouches cellulaires ou des tissus sous une forme cristalline 10, ou elle est incubée à des concentrations très élevées (~ 1-20 uM) après dilution à partir d' une solution de concentration d'actions 11, 12.

content "> Ici, l'approche est l'utilisation de la plate-forme LCNP, un NP multifonctionnel dont le noyau intérieur est totalement hydrophobe et dont la surface est simultanément hydrophile et prête à bioconjugaison, comme un véhicule de livraison pour DiO. DiO est incorporé dans le noyau LCNP lors de la synthèse , et la surface NP est alors fonctionnalisé avec une fraction de cholestérol pégylé pour promouvoir la liaison de la DiO-LCNP ensemble à la membrane plasmique membrane. Cette approche a abouti à un système de distribution qui partage la DiO dans la membrane du plasma avec une plus grande fidélité et la résidence de la membrane temps que la forme libre de DiO délivré de solution en vrac (DIO libre). en outre, ce procédé a montré que la fourniture de LCNP à médiation par la DIO module et entraîne le taux de séparation spécifique du colorant dans la lipophile bicouche de la membrane plasmique de manière substantielle. Ceci est réalisé tout en réduisant en même temps que la cytotoxicité du médicament libre par ~ 40% en délivrant comme une formulation LCNP.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Préparation de DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol

  1. Dissoudre le diacrylate de cristaux liquides agent de réticulation (DACTP11, 45 mg), de 3,3'-perchlorate dioctadecyloxacarbocyanine (DIO, 2 mg), et d'un initiateur de radicaux libres (azobisisobutyronitrile, 1 mg) pendant la polymérisation dans 2 ml de chloroforme. Ajouter à une solution aqueuse d'agent tensio-actif à fonctions acrylate (AC10COONa, 13 mg dans 7 ml).
  2. On agite le mélange pendant 1 heure et soniquer à 80% d'amplitude pendant 5 minutes pour produire une mini-émulsion comprenant des gouttelettes de la matière organique, entourée d'agent tensio-actif polymérisable dans l'eau.
  3. Chauffer le mélange à 64 ° C dans un bain d'huile pour initier la polymérisation à la fois de l'agent tensio-actif et de reticulation comme le chloroforme, évapore lentement, en laissant une suspension contenant DiO NP qui est stabilisé par l'agent tensio-actif.
  4. Filtrer la suspension NP (3 fois) à travers un filtre à seringue de 0,2 um pour éliminer toute agrégation. Store la solution NP filtrée à 4 ° C jusqu'à utilisation ultérieure.
  5. Conjugaison du PEG-Chol à DiO-LCNP par couplage EDC.
    1. Dissoudre Chol-PEG-NH 2 .HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) dans du tampon HEPES 25 mM (pH 7,0).
    2. Préparer une solution de travail contenant un sel de N - hydroxy-sulfosuccinimide sodium (SHN, 40 mM) et de 1-éthyl-3- (3- (diméthylamino) propyl) carbodiimide (EDC, 400 mM) dans un tampon HEPES à partir de solutions mères concentrées.
    3. Immédiatement ajouter 20 pi de la solution de travail fraîchement préparée de NHSS / EDC à 1,0 ml de DiO-LCNP dans un tampon HEPES et remuer pendant 5 min.
    4. Ajouter 20 pi de solution mère de Chol-PEG-NH 2 · HCl à ce mélange et remuer pendant 2 heures.
    5. Centrifuger brièvement le mélange réactionnel à la vitesse maximale (~ 2 000 x g) pendant 30 secondes en utilisant une mini - centrifugeuse de paillasse et passer le surnageant à travers une colonne de chromatographie d'exclusion PD-10 équilibrée avec la taille 13un tampon phosphate salin de Dulbecco (DPBS, 0,1x).

2. Caractérisation des DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol

  1. Confirmer la conjugaison covalente réussie de PEG-Chol à la surface DiO LCNP par électrophorèse sur gel.
    1. Dissoudre 0,5 g d'agarose dans 50 ml (1x) de tris-borate électrophorèse (TBE; Tris 89 (pH 7,6), l'acide borique 89 mM et EDTA 2 mM) tampon. Chauffer la solution dans un four à micro-ondes pour dissoudre l'agarose. Laisser la solution refroidir légèrement et verser le contenu dans une plaque de gel dans la zone d'électrophorèse. Insérez un peigne de gel pour créer des puits d'échantillon.
    2. Une fois que le gel est solidifié, ajouter la quantité requise (assez pour immerger le gel dans la chambre) de TBE courir tampon à la chambre.
    3. Ajouter 35 pi d'échantillon DiO LCNP (modifié avec du glycérol, 5% v / v) dans les puits du gel et de tourner pendant 20 min sous une tension de 110 V.
    4. L'image du gel en utilisant une connexion du système d'imagerie de geld'excitation et de filtres d'émission e à 488 nm et 500-550 nm, respectivement.
  2. Évaluer la taille des particules et la distribution par diffusion dynamique de la lumière (DLS) en diluant la solution DiO-LCNP (dilution ~ 200 fois) dans du PBS (pH ~ 8, 0,1x) et de mesure sur un instrument de DLS 14. Mesurer le potentiel zêta de la DIO-LCNPs en utilisant un instrument potentiel zeta approprié de mesure.

3. Préparation de cellules Vaisselle Culture pour les expériences de livraison et d'imagerie

REMARQUE: l' étiquetage DiO LCNP est effectuée sur des cellules HEK 293T / 17 cellules rénales embryonnaires humaines (entre les passages 5 et 15) qui sont mises en culture comme décrit précédemment 4. Effectuer les expériences de livraison et l'imagerie cellulaire ultérieure, comme décrit ci-dessous.

  1. Préparer des plats de culture de tissus de diamètre 35 mm (équipés de 14 mm inserts n ° 1 lamelle) en les enduisant de fibronectine bovine (~ 100 ul à une concentration de 20 pg/ Ml) dans du DPBS pendant 2 heures à 37 ° C.
  2. Retirer la solution de revêtement de fibronectine à partir de la boîte de culture. Récolte HEK 293 T1 / 7 cellules provenant du flacon T-25 de premier lavage de la monocouche cellulaire avec 3 ml de DPBS, puis en ajoutant 2 ml de trypsine-EDTA (0,5% de trypsine-0,25% d'EDTA).
  3. Incuber le ballon à 37 ° C pendant ~ 3 min. Retirez la trypsine-EDTA et retourner le ballon à l'incubateur. Une fois que les cellules sont détachées du flacon, neutraliser la trypsine en ajoutant 4 ml de milieu complet (milieu de Eagle modifié par Dulbecco, DMEM, modifié de manière à contenir 10% de sérum bovin foetal, du pyruvate de sodium à 5% et 5% d'antibiotique / antimycosique) dans la fiole . Déterminer la concentration des cellules dans la suspension par leur comptage dans un compteur de cellules.
  4. Ajuster la concentration cellulaire à 8 x 10 ~ 4 cellules / ml avec du milieu de croissance. Ajouter 3 ml de la suspension cellulaire à l'antenne et de la culture dans l'incubateur pendant une nuit; le lendemain, les cellules doivent être à ~ 70% de confluence et devraient être prêts à l'emploi. Adéquatla densité cellulaire est essentielle pour le marquage robuste et efficace d'un pourcentage élevé de cellules.

4. Livraison cellulaire de DiO et DiO-LCNPs et imagerie des cellules fixes

  1. Préparer 1 ml de solutions DiO, DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol en milieu de livraison (HEPES-DMEM; DMEM contenant 25 mM HEPES) en diluant des solutions mères de DiO gratuit et DIO-LCNPs; concentrations DiO appropriés pour l' incubation sur les cellules seront ~ 1-10 uM (exprimé en soit la concentration de DiO libre ou DiO sous forme de DiO-LCNP).
  2. Retirez le milieu des boîtes de culture de croissance à l'aide d'une pipette sérologique et laver les monocouches de cellules (voir l'étape 3) deux fois avec HEPES-DMEM (2 ml à chaque lavage). Effectuer les lavages en ajoutant doucement et retirer HEPES-DMEM à l'aide d'une pipette vers / depuis le bord de la vaisselle.
  3. Ajouter 0,2 ml de la DIO solutions de livraison gratuits ou DiO-LCNP préparés au centre des boîtes de culture et de retourner les plats à l'incubator pendant une période de temps appropriée (typiquement 15 ou 30 minutes, en fonction des besoins de l'expérience). Des durées d'incubation ajouter à l' étiquetage cellulaire plus non spécifique des zones non-membraneux (par exemple, cytosol).
  4. Après la période d'incubation, retirer les solutions de livraison à l'aide d'une pipette sérologique. On lave les monocouches de cellules deux fois avec du DPBS (2 ml à chaque lavage). Effectuer les lavages en ajoutant doucement et retirer DPBS vers / depuis le bord du plat.
  5. Fixer les monocouches de cellules à l'aide de paraformaldehyde à 4% (préparée dans du DPBS) pendant 15 min à température ambiante.
    ATTENTION: paraformaldéhyde est inflammable, un irritant respiratoire et un cancérogène suspecté.
  6. Retirer la solution de paraformaldehyde à l'aide d'une pipette et laver délicatement les cellules 1 fois avec DPBS (2 ml) en ajoutant et supprimant DPBS en utilisant la pipette vers / depuis le bord de la vaisselle.
  7. Les cellules fixées sont prêtes à être imagée par la présence d'un signal de fluorescence à l'aide membraneuse à balayage laser confocalmicroscopie (CLSM). Effectuer l'imagerie immédiatement ou, en variante, remplacer le milieu avec du DPBS contenant 0,05% de NaN3 et stocker les plats à 4 ° C.
    ATTENTION: NaN 3 est toxique; preuve d'une extrême prudence lorsque vous utilisez NaN3.
    NOTE: Correction des échantillons stockés de cette manière devraient être imagés dans les 48 heures pour des résultats optimaux.

5. Livraison cellulaire de DiO et DiO-LCNPs et FRET Imaging dans des cellules vivantes

NOTE: Dans cette méthode, les cellules sont colabeled avec 6 pM chacun DiO LCNP-PEG-Chol (où DiO est un donneur FRET) et de 1,1'-dioctadécyl-3,3,3 ', 3' perchlorate tetramethylindocarbocyanine (DII libre, où Dil est un accepteur de FRET). La libération de DiO de DiO-LCNP-PEG-Chol et son incorporation dans la membrane plasmique est confirmée par une augmentation observée dans le transfert d'énergie du donneur DiO à l'accepteur Dil.

  1. Cellules d'étiquettes séquentiellement avec DiO-LCNP-PEG-Chol et Dil free selon la méthode décrite à l' étape 4.
  2. Après coloration, laver les cellules 1 fois avec DPBS (2 ml) à l'aide d'une pipette sérologique et remplacer le tampon de lavage avec 2 ml de solution d'imagerie des cellules vivantes (SICT).
  3. Sur une platine de microscope équipé d'une chambre d'incubation chauffé, l'image de l'échantillon de cellules vivantes à l'aide d'un microscope confocal (objectif 60X) avec une configuration d'imagerie FRET à intervalles de 30 minutes sur une période de 4 heures en excitant le donneur DiO à 488 nm et une collecte complète des émissions les spectres du donneur et l'accepteur DiO Dil 490-700 nm avec un détecteur spectral 32 canaux.
  4. NOTE: Pour plus d' informations sur l' imagerie FRET, s'il vous plaît voir la référence 15.
  5. Déterminer l'intensité résolue dans le temps d'émission du donneur et l'accepteur DiO Dil à partir de cellules colorées avec DiO-LCNP-PEG-Chol et DII. Calculer le temps résolu accepteur / donneur FRET rapport (Dil emi / DiO emi) pour les images, ce qui augmentera de façon constante et , éventuellement , plaqueau une fois que la quantité de DiO donneur partitionné dans la membrane a atteint un maximum de 16.

6. Essai de cytotoxicité de DiO et DiO-LCNPs aux HEK 293T / 17 cellules

REMARQUE: La cytotoxicité des matériaux DiO LCNP est évaluée en utilisant un essai de prolifération à base de colorant tétrazolium 17. Les cellules sont cultivées dans une plaque à puits multiples en présence de concentrations variables des matériaux dans des conditions qui simulent la livraison / l'étiquetage. Les cellules sont ensuite mises en culture pendant 72 heures pour permettre la prolifération. Un colorant (MTS (3- (4,5-diméthylthiazol-2-yl) -5- (3-carboxyméthoxyphényl) -2- (4-sulfophényl) -2H-tétrazolium) est alors ajouté aux puits et métaboliquement actifs les cellules convertissent le colorant en bleu de formazan. la quantité de formation de la couleur est directement proportionnelle au nombre de cellules viables.

  1. Récolte HEK 293 T1 / 7 cellules provenant du flacon T-25 en suivant le mode opératoire décrit à l'étape 3.2.SeedHEK 293T / 17 cellules (5.000 cellules / 100 ul / puits) aux puits d'une plaque de 96 puits de culture de tissu traité et de la culture pendant 24 heures.
  2. Supprimer complètement les milieux de culture des puits à l' aide d' une micropipette et ajouter 50 ul de HEPES-DMEM contenant DiO libre, DiO-LCNPs ou DiO-LCNP-PEG-Chol à des concentrations croissantes de reproduire des puits. Incuber sur les cellules à 37 ° C pendant 30 min.
    NOTE: En règle générale, de répétitions fait en triple ou quadruple sont suffisantes pour produire des données statistiquement fiables.
    1. Après incubation, retirer le support de diffusion contenant les matériaux à l'aide d'une micropipette et le remplacer par 100 ul de milieu de croissance. Culture des cellules pendant 72 heures.
  3. Ajouter 20 ul de substrat de tétrazolium à chaque puits, le retour de la plaque dans l'incubateur, et permettre la formation de couleur se dérouler à 37 ° C pendant 4 heures. Lire l'absorbance (abs) du produit formazan à 570 nm (minima d'absorption pour les DIO-LCNPs utilisés dans ce study) et 650 nm (pour la soustraction de l'absorbance de fond non spécifique) en utilisant un lecteur de microplaque.
  4. Tracer la valeur d'absorption différentielle (abs 570 - abs 650) par rapport à la concentration matériau et présenter les résultats sous forme de pour cent de la prolifération des cellules de contrôle (degré de prolifération des cellules dans un milieu de culture cellulaire seulement).

Analyse 7. Données

  1. analyser statistiquement les données à une analyse univariée de la variance (ANOVA). Pour les comparaisons multiples, appliquer test hoc poste de Bonferroni. Fournir toutes les valeurs moyennes de ± erreur type de la moyenne (SEM), sauf mention contraire.
    NOTE: La probabilité acceptable de signification était p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LCNPs ont été préparées dans lequel le noyau hydrophobe du NP a été chargé avec une sonde membrane-étiquetage représentatif pour démontrer l'utilité du LCNP comme véhicule de livraison efficace pour les cargaisons hydrophobes. A cet effet, la cargaison choisie était le colorant potentiométrique membrane marquage hautement insoluble dans l'eau, DiO. LCNPs chargés DiO (DIO-LCNPs) ont été synthétisés en utilisant une technique de mini-émulsion à deux phases avec les composants chimiques DACTP11, AC10COONa et DiO, comme représenté sur la figure 1 18. Dans ce système NP, le réseau polymère lié de façon covalente de l'agent de réticulation cristalline DACTP11 fournit un noyau hydrophobe stable, où l'OID se trouve dans les espaces interstitiels dans le réseau réticulé. Les groupes carboxylate sur la surface NP assurent la stabilité colloïdale de la particule dans un milieu aqueux tout en servant en tant que groupe fonctionnel "poignée" pour la fixation des ligands de ciblage cellulaire(Et d'autres produits biologiques). Pour attacher les DIO-LCNPs à la membrane plasmique, un groupement cholestérol pégylé à terminaison amine (PEG-Chol) a été fixé de manière covalente à la surface de LCNP par couplage EDC (figure 1). Après la synthèse NP et la confirmation de bioconjugaison réussie, la capacité des DIO-LCNPs d'étiqueter la membrane plasmique des cellules vivantes et de livrer la cargaison de DiO incorporé à la partie lipophile de la bicouche de la membrane plasmique avec une meilleure spécificité et la cinétique par rapport à la libre forme (DiO libre) délivré de solution en vrac a été évaluée.

Comme on le voit sur la figure 2 A, libre DiO (6,0 uM) solidement coloré la membrane plasmique avec un rendement élevé (près de 100% de cellules marquées) après 15 min d'incubation avec HEK 293T / 17 cellules. Toutefois, l' internalisation cellulaire significative de DiO libre a été observé sur seulement une augmentation modeste dule temps d'incubation de 30 minutes (Figure 2 A et C). L'étendue de l' intériorisation DiO libre a été déterminée par des expériences de colocalisation résolues dans le temps dans lequel les cellules ont d' abord été incubées avec 6,0 uM DiO libre (30 min). -contenant Le milieu d'incubation libre DiO a ensuite été éliminé et les cellules ont ensuite été mises en culture pendant jusqu'à 4 heures. Les membranes plasmatiques des cellules ont été colorées avec un phospholipide marqué par un colorant membranaire (phosphoéthanolamine conjugué à de la rhodamine B, PE-Rhoda). Comme on le voit sur la figure 2 en C, après 15 min d'incubation, presque 100% des DiO libre est colocalisé avec le marqueur PE-Rhoda (coefficient de colocalisation de Pearson; PCC = 0,99 ± 0,01). Cependant, après 30 min d'incubation à 80% de la DIO libre est restée liée à la membrane (~ 20% internalisé). Le degré de DiO intériorisation libre a augmenté régulièrement comme ele temps e d'incubation a été étendu à aussi longtemps que 4 heures, et cela se reflète dans la diminution concomitante du PCC entre le DiO et Rhoda-PE (Figure 2 C). Un ajustement des données à une équation de décroissance exponentielle en une seule phase a révélé que l'intériorisation libre DiO atteint un maximum de ~ 50% à 1 h, avec un taux d'intériorisation (k = 0,045 min -1) et la demi-vie (15 min) qui reflète l'absorption cellulaire rapide et efficace de DiO libre. Ces données démontrent la transition dépendante du temps rapide de DiO libre de la membrane plasmique vers le cytosol où il est resté largement exclu du noyau au cours de la période de temps de 4 heures examinée.

Compte tenu de l'absorption cellulaire incontrôlée de DiO libre, l'objectif est devenu de moduler ce comportement par la prestation de DiO comme une formulation LCNP-PEG-Chol NP. A la livraison, comme un bioconjugué LCNP-PEG-Chol, un résidu de membrane plus persistantetemps de rence du DiO par rapport à DiO libre a été noté (figure 2 B). Après 15 minutes d'incubation du DiO LCNP-PEG-Chol avec les cellules, à près de 100% du signal DiO a été localisé à la membrane plasmique où elle était colocalisé avec le marqueur membranaire PE-Rhoda, un résultat qui était comparable à celle observée pour DiO libre. Il a été noté, cependant, que si la libre étiquetage DiO de la membrane était assez uniforme et contiguë, le motif de coloration de la DiO-LCNP-PEG-Chol après 15 min d'incubation était plus punctate et pas presque aussi uniforme dans la nature (Figure 2 B). Ce résultat indique que les DIO-LCNP-PEG-Chol NPs recueillaient dans des régions discrètes au sein de la membrane plasmique. Lorsque le temps d'incubation a été augmentée à 30 min, ~ 94% du signal DiO est resté à la membrane (contre environ 80% pour DiO gratuitement sur ce même point de temps) (Figure 2 B et 2C). Cette tendance est devenue encore plus marquée que les cellules ont été cultivées avec les NPs DiO-LCNP-PEG-Chol pour de plus longues heures après la 30 min initiale incubation. Par exemple, après la culture pendant 1 h après l'incubation initiale, près de 80% du signal DiO-LCNP-PEG-Chol NP est resté membraneuse et colocalisés avec le marqueur PE-Rhoda ( par rapport à ~ 55% pour DiO gratuit). Notamment, l'internalisation cellulaire de la DiO-LCNP-PEG-Chol NPs atteint un maximum de 30% à 2 heures (70% de rétention de la membrane). Cela correspond à un taux d'absorption cellulaire (k = 0,024 min - 1, la demi-vie = 29 min) qui est exactement la moitié de celle observée pour l'internalisation de DiO libre.

Ensuite, la capacité de la cargaison DIO NP-embarqué à efflux efficace sur le noyau de LCNP et pénétrer dans l'environnement lipophile de la bicouche de la membrane plasmique d'une manière contrôlée et dépendante du temps a été déterminé. Àévaluer, sur la base d'une stratégie FRET a été mis au point dans lequel l'OID sert de donneur FRET engagée dans le transfert d'énergie au colorant accepteur DiI. Comme prévu, sur l' étiquetage initial (t = 0 min), le signal d'émission a été dominée par le donateur DiO contenu dans les NPs membranaires-tethered (figure 3 B). FRET imagerie de ce même champ 4 heures plus tard (t = 240 min), cependant, a révélé une augmentation significative du signal d'émission de l'accepteur DiI, fournissant des preuves solides de la transition du donneur DiO du noyau de LCNP dans la bicouche de la membrane plasmique (figure 3 C). Examen de la nature résolue dans le temps de cette transition a montré une diminution constante de la DiO émission du donneur couplé avec une augmentation correspondante de la DII émission accepteur sur la fenêtre expérimentale de 4 heures (Figure 3 D). En particulier, l'efficacité de FRET au cours de cette transition a atteint son maximaman à ~ 180 min étiquetage post-initiale, ce qui suggère que l'efflux et de la membrane de partitionnement du donneur DiO avait atteint son maximum à ce point de temps (Figure 3 E). Ces données fournies des preuves solides de la répartition du temps résolu de la DiO du NP à la bicouche de la membrane plasmique qui a atteint son post-initiale étiquetage maximale ~ 3 h avec les DIO-LCNP-PEG-Chol NPs.

Enfin, l' analyse comparative de la cytotoxicité a été réalisée pour DiO libre par rapport DiO-LCNP-PEG-Chol. Lorsque incubé avec HEK 293T / 17 cellules (à une concentration de 6 DiO uM dans les deux cas), il était clair que l'encapsulation du DiO dans le noyau LCNP atténué sa cytotoxicité. Bien que DiO libre a suscité viabilités cellulaires de ~ 50%, les cellules incubées avec DiO-LCNP-PEG-Chol présentait viabilités cellulaires ~ 90%. (Figure 4). Cumulativement, les données d'étiquetage des cellules couplées avec le toxi cellulaireles données de la ville montrent des améliorations à la fois l'efficacité de l'étiquetage de la membrane à base de DiO et la modulation de la cytotoxicité de DiO.

Figure 1
Figure 1: Représentation schématique de la liaison à la membrane DiO-LCNP-PEG-Chol. DiO LCNP est composé d'un cristal liquide un agent d'acrylate de réticulation (DACTP11); un tensioactif polymérisable à terminaison carboxyle (AC10COONa); et un colorant lipophile, DiO. Cholestérol à terminaison de poly (éthylène glycol) (PEG-Chol) a été conjugué à DiO LCNP par couplage EDC. Addition d'Chol à la surface DiO LCNP médie la liaison préférentielle du NP à la membrane plasmique. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.


Figure 2: résolue en temps l' absorption cellulaire de DiO libre dans HEK 293 T / 17 cellules. DiO libre (6,0 uM, panneau (A) ou DiO-LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 uM, panneau (B) a été incubé sur des monocouches de cellules pendant 15 minutes, enlevé et remplacé par le milieu de croissance, les cellules ont été mis en culture pendant les durées indiquées (jusqu'à 4 heures). les cellules ont ensuite été colorées avec du PE-Rhoda (2,0 M) et fixes. les échantillons ont été imagées pour DiO (vert) et liée à la membrane de PE-Rhoda (rouge) à l'aide CLSM. ( C) terrain à résolution temporelle du pour cent de DiO liée à la membrane de signal libre ou DiO-LCNP-PEG-Chol en fonction de l' augmentation du temps d'incubation. les données ont été obtenues à partir du coefficient de colocalisation de Pearson (PCC, n = 3 & #177; écart-type) du vert (DIO) et rouge PE-Rhoda) canaux (et est exprimé en pourcentage (± SEM) après la normalisation du PCC correspondant à 15 min d'incubation. Barre d'échelle = 20 pm. Reproduit avec la permission de la référence 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

figure 3
Figure 3: résolution temporelle FRET confirme l'efflux de DiO de DiO-LCNP-PEG-Chol à la membrane plasmique. HEK293T / 17 cellules ont été costained avec DiO-LCNP-PEG-Chol et Dil, où (émettant dans le vert) l'OID et Dil (rouge) émettant des colorants agissent comme donneur FRET et l'accepteur, respectivement. Image (A) DIC des cellules vivantes avec costained DiO LCNP-PEG-Chol ([DIO] = 6,0 M) et de Dil (6,0 uM). Les sa été amplement imagé pour surveiller la modification du signal FRET au cours de la période de 4 heures. (B) et (C) sont les images FRET de la cellule en direct sur le même plan focal à t = 0 min, t = 240 min, respectivement. (D) normalisé, résolue dans le temps l' intensité d'émission du donneur et de l' accepteur DiI DiO de cellules colorées avec DiO LCNP-PEG-Chol et DII et imagés en mode d'excitation FRET. (E) résolue en temps rapport FRET (Dil emi / DiO emi) pour les cellules marquées par DiO-LCNP-PEG-Chol et Dil et imagées dans la configuration FRET. Barre d'échelle = 20 pm. Reproduit avec la permission de la référence 18. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Figure 4
Figure 4 Quantification de la cytotoxicité. DiO libre, LCNP, DiO LCNPs ou DiO LCNP-PEG-Chol ont été mises en incubation sur HEK 293T / 17 monocouches de cellules pendant 15 min, puis retirés. Les cellules ont été lavées et cultivées dans un milieu de croissance pendant 72 heures avant le dosage MTS. Le graphique à barres représente une comparaison de la viabilité des cellules (n = 5 ± SEM) de DiO libre, LCNP, DiO-LCNP et DiO-LCNP-PEG-Chol à [DIO] = 6,0 uM. La différence entre DiO libre et LCNP, DiO-LCNP ou DiO-LCNP-PEG-Chol sont significatives (p <0,001) à 72 heures d'incubation. Reproduit avec la permission de la référence 18. Les données ont été analysées en utilisant l'analyse univariée de la variance (ANOVA); Le test post-hoc de Bonferroni a été utilisé pour les comparaisons multiples. S'il vous plaît cliquer ici pour voir une version plus grande de cette figure.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Un souci constant de NMDD est le ciblage contrôlé et la fourniture de formulations de médicaments à des cellules et des tissus, associée à une amélioration simultanée efficacité du médicament. Une classe spécifique de molécules de médicaments pour lesquels cela a posé un défi important est hydrophobes agents médicaments / d'imagerie qui ont peu ou pas de solubilité dans les milieux aqueux. Ce problème a tourmenté la transition des médicaments puissants à partir des systèmes de culture cellulaire in vitro à la clinique et a donné lieu à un certain nombre de molécules de médicaments prometteurs étant «mis de côté» ou abandonnés et non poursuivi plus loin dans le cadre clinique. Wortmannine (Wtmn), par exemple, est un puissant inhibiteur de la phosphatidylinositol 3 'kinases et phosphatidylinositol 3' kinases liées à la kinase et a un grand potentiel en tant qu'agent anticancéreux, mais son manque de solubilité dans l'eau a entravé sa progression dans les essais cliniques.

Récemment, Karve et al. a montré l'amélioration de sol de l'eauubility de Wtmn lorsqu'il est formulé comme un ensemble de NP lipide et de polymère 19. Une arène qui pourrait grandement bénéficier de ce type d'amélioration, la livraison contrôlée comme une formulation NP est la délivrance de médicaments hydrophobes et des agents d'imagerie à la membrane plasmique. Ainsi, le but ici était d'aborder cet obstacle technique et de développer une méthodologie pour surmonter cet obstacle technologique.

Dans l'élaboration de cette méthodologie, un colorant modèle membrane-ciblage, DiO, a été sélectionné qui a toujours été en proie à une faible solubilité dans les milieux aqueux. Ceci confère des défis significatifs dans la délivrance spécifique du colorant sur la membrane plasmique. Parmi ces défis sont la nécessité d'ajouter la forme cristalline du colorant directement aux cellules ou tissus 10 ou à incuber les cellules avec des concentrations très élevées de DiO après dilution de solutions mères contenant des solvants tels que le DMSO 11, 12.L'approche ici est double: 1) intégrer le DiO dans le noyau hydrophobe de LCNPs pendant la synthèse NP et 2) modifier de manière covalente les DIO-LCNPs telles que synthétisées avec un pégylé cholestérol conjugué (DiO-LCNP-PEG-Chol) pour faciliter l'interaction directe des NPs DiO-chargés avec la membrane plasmique. En effet, cette approche a effectivement amélioré un certain nombre d'aspects de la livraison de DiO à la membrane plasmique.

Tout d'abord, le temps de séjour de la membrane de DiO a effectivement doublé lors de la livraison sous forme de formulation de LCNP par rapport à quand DiO a été livré sans solution en vrac. Ce temps de séjour prolongé de la membrane a été attribuée à la localisation de la DiO LCNP-PEG-Chol conjugue aux microdomaines radeaux lipidiques de la membrane plasmatique, comme confirmé par des expériences de co-coloration. En second lieu, la répartition de la cargaison DiO dans la bicouche lipidique a été confirmée par des expériences de FRET dans laquelle l'OID a servi en tant que donneur à un accepteur DiI membrane résidente. Enfin, lelente, libération prolongée de la cargaison DiO dans la bicouche membranaire efficacement atténué la cytotoxicité du DiO par ~ 40%.

Il est important de mettre en évidence plusieurs points dans le protocole qui sont essentiels pour le succès. Premièrement, le pour cent chargement du DiO dans le noyau de LCNP doit être empiriquement optimisée dans la synthèse d'essai exécute pour obtenir un équilibre entre la génération de haute qualité DiO-LCNP-PEG-Chol NPs et le niveau désiré de signal de fluorescence dans des expériences de livraison cellulaires . De même, la bioconjugaison du fragment Chol-PEG-NH2 à la surface DiO LCNP doit être optimisé afin d'obtenir le degré de marquage cellulaire souhaité. Enfin, le nombre de cellules appliquées aux boîtes de culture fibronectine enduit est essentiel pour le succès, et il faut prendre soin d'ensemencer les cellules à une densité de ~ 8 x 10 4 cellules / ml (~ 2,4 x 10 5 cellules par boîte) . Quand les cellules sont ensemencées trop peu, il en résulte inefficace marquage de la membrane, tandis que l'ensemencement du CELLS résultats trop densément dans l'acquisition d'images pauvres qui ne sont pas montrent clairement l'étiquetage membraneuse.

Une limitation potentielle du protocole décrit est que l'efficacité de l'incorporation de divers autres colorants de membrane de ciblage et de médicaments varie en fonction de l'hydrophobie de la cargaison colorant / médicament. Dans ces cas, le protocole de synthèse de LCNP devra être testée de façon empirique pour déterminer les conditions de synthèse optimales pour l'incorporation idéale cargaison colorant / médicament.

En résumé, une méthode a été développée pour la distribution contrôlée à base d'un colorant LCNP cargaison hydrophobe à la membrane plasmique des cellules vivantes qui surmonte un grand nombre des défis techniques associés à la prestation cellulaire des cargaisons insolubles dans l'eau. L'importance globale de la méthode est qu'elle améliore nettement la délivrance spécifique de la cargaison à la membrane plasmique tout en atténuant simultanément la cytotoxicité qui est concomitante associated avec la livraison de cargaisons hydrophobes à des concentrations élevées de solution en vrac. Cette approche devrait trouver une utilité large dans la livraison de la même manière difficiles hydrophobes cargaisons d'agent colorant / d'imagerie et sera probablement aider à faciliter la transition de l'efficace, mais peu soluble dans l'eau, les cargaisons du régime expérimental à la clinique.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Les auteurs déclarent qu'ils ont aucun intérêt financier concurrents.

Acknowledgments

Ce travail a été soutenu par le Programme de financement de base de la LNR (Work Unit MA041-06-41-4943). ON est soutenu par une recherche postdoctorale Associateship Conseil national de recherches.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7, (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3, (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8, (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208, (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11, (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93, (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101, (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97, (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274, (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27, (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (21), 8230-8235 (2012).
Targeted Plasma Membrane Livraison d&#39;un Hydrophobe Cargo encapsulé dans un cristal liquide Nanoparticules Transporteur
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter