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Bioengineering

액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

액정 나노 입자 (LCNP) nanocarrier는 살아있는 세포의 세포막에 소수성화물의 제어 전달을위한 수단으로 이용된다.

Abstract

세포에 약물 / 조영제의 제어 전달은 치료제의 개발 및 세포 신호 전달 과정의 연구에 중요하다. 최근에는 나노 입자 (NPS는) 이러한 전달 시스템의 개발에 상당한 가능성을 보여 주었다. 여기서, 액정 NP (LCNP) 기반 전달 시스템은 플라즈마의 소수성 영역으로 NP 코어 내에서 수 불용성 염료, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO)의 제어 전달을 위해 사용되어왔다 막 이중층. 국민 연금의 합성 중에 색소를 효율적으로 다중 분광 분석에 의해 확인 된 바와 같이, 소수성 LCNP 코어에 통합 하였다. 만약 NP 표면 (DIO-LCNP-PEG-Chol을)에 PEG 화 콜레스테롤 유도체의 활용은 HEK 293T / 17 세포의 세포막에 염료 로딩 NP에 결합 할 수 있었다. 시분 레이저 스캐닝 공 초점 현미경 및 포스터 공명 에너지 전달 (FRET) 이미징 통과를 확인LCNP 코어와 세포막 이중층에의 삽입에서 DIO의 유출을 필자. 마지막으로, LCNP-PEG-Chol을 같은 DIO의 전달은 DIO의 세포 독성을 약화; DIO의 NP 양식 디오 무료 벌크 용액으로부터 전달에 비해 ~ 30~40% 적은 독성을 나타냈다. 이 접근법은 소수성 분자화물의 막 - 특정 전송 및 변조를위한 효율적인 양상으로서 LCNP 플랫폼의 유용성을 보여준다.

Introduction

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살아있는 세포를 (적어도 하나의 차원에서 재료 ≤100 ㎚) 나노 인터페이싱의 출현 이후 지속적인 목표는 다양한 애플리케이션을위한 나노 입자 NPS ()의 고유 사이즈 - 의존 특성을 활용할 수있다. 이러한 응용 프로그램은 세포와 조직 라벨 / 영상 (생체 외 및 생체 내에서 모두), 실시간 감지, 약물 및 기타화물 1의 제어 전달을 포함한다. 이러한 관련 NP 속성의 예는 반도체 나노 결정의 크기에 의존 방출 (양자점, 양자점)를 포함; 금 나노 입자의 광열 특성; 리포좀의 수성 코어의 큰 적재량; 이러한 단층 카본 나노 튜브와 그래 핀 등의 탄소 동소체의 전도도 및 탄도.

최근에 상당한 관심 콘트라스트 / 영상 A와 약물 및 다른화물의 제어 NP에 대한 변조의 사용이 생겨났다남자용 화장실. 여기서의 이론적 근거는 크게 / 강화에서 NP 제형으로 제공함으로써 약물화물의 전체 용해도 전달 용량 순환 시간 및 최종 허가를 최적화하는 것이다. 이 NP-매개 약물 전달 (NMDD)로 알려지게하고 있으며, 다양한 암 임상 시험의 다양한 단계에서 더 많은 수백을 치료하는 병원에서 사용하기위한 일곱 FDA 승인 NP 약물 제형은 현재이 있습니다. "적은 비용으로 더 많은 달성;"본질적으로, 목표는 것입니다 즉, 넓은 표면적을 이용하여 적은 투여 투여보다 약을 전달하기위한 골격으로 NP를 사용하려면 부피 (예를 들어, 이러한 양자점 및 금속 산화물 등의 경질 입자) NP에 또는 로딩 그들의 큰 내부 체적 대형화물 페이로드 (예를 들어, 리포좀 또는 미셀). 여기서의 목적은 수성 안정성 및 향상된 순환을 촉진하는 동시에, 특히 대한 여러 전신적 전달 투여 요법에 대한 필요성을 감소시키는매우 효과적인 반면, 수성 매질에 난용이며, 도전 소수성 약물화물.

따라서, 본원에 기술 된 작업의 목적은 친 지성 세포막 이중층 소수성화물의 특정 제어 및 전달을위한 신규 NP 지지체의 사용 가능성을 확인 하였다. 일에 대한 의욕은 수성 미디어에서 세포에 소수성 분자의 전달에 고유 제한 용해도 어려움이었다. 전형적으로, 이러한 소수성 분자의 전달은 내부 부하를 제한 할 수 독성 손상 세포 및 조직 생존 2 또는 미셀 담체 수있는 유기 용매 (예를 들어, DMSO) 또는 양쪽 성 계면 활성제 (예, 폴록 사머)의 사용을 필요 용량. 여기에 선택된 NP 캐리어는 이전에 3를 개발 한 새로운 액정 NP (LCNP) 배합이었고, 그건 ~ 40 배를 달성하기 위해 이전에 표시했다 배양 된 세포를 4 항암제 독소루비신의 효능 향상.

여기에 기술 된 연구에서, 선택된 대표화물은 전위차 막 염료, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 과염소산 (DIO)을했다. DIO 거실 고정 신경 세포막 전위 측정에 선행 성 역행 추적을 위해 사용 된 수 불용성 염료 및 일반 멤브레인 라벨링 5, 6, 7, 8, 9. 인해 소수성 특성, DIO는 일반적으로 결정질 형태 (10)에 단층 세포 나 조직에 직접 첨가하거나, 매우 높은 농도로 인큐베이션 농도 원액 (11), (12)에서 희석 후 (~ 1-20 μM).

내용의 "LCNP 플랫폼> 여기서, 접근 방식이었다 사용은 DIO. DIO에 대한 배달 차량으로 그 내부 코어를 완전히 소수성 및 표면이 동시에 친수성 및 바이오 콘쥬 게이션 의무가있는 다기능 NP는, 합성시 LCNP 코어에 통합 및 NP 표면이어서 세포막에 DIO-LCNP 앙상블 결합 멤브레인을 촉진하는 PEG 화 콜레스테롤 잔기로 기능화된다.이 접근법은 큰 충실도 멤브레인 레지던스 원형질막으로 DIO 분할 전달 시스템 초래 DIO의 유리 형태는 벌크 용액으로부터 전달보다 시간 (DIO 무료). 또한,이 방법은 DIO의 LCNP 매개 전달이 실질적으로 변조하고 친 유성 세포막 이중층으로 염료의 특정 파티션의 속도를 구동하는 것을 보여 주었다.입니다 부수적 LCNP 제제로 제공하여 40 % ~하여 유리 약물의 독성을 감소시키는 동안 달성했다.

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Protocol

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DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1. 준비

  1. 액정 성 디 아크릴 레이트 가교제 (DACTP11 45 mg)을 용해시키고, 3,3'- dioctadecyloxacarbocyanine 퍼클로레이트 (DIO, 2 mg)을 클로로포름 2ml의 중합을위한 자유 라디칼 개시제 (아조 비스 이소 부티로 니트릴, 1 ㎎)을 얻었다. 아크릴 레이트 작용 계면 활성제의 수용액 (AC10COONa, 7 용액에 13 mg)을이를 추가합니다.
  2. 물에 중합 성 계면 활성제에 의해 둘러싸 이는 유기 재료의 작은 방울로 구성된 미니 에멀젼을 제조하기 위해 5 분 동안 80 % 진폭에서 1 시간 동안 초음파 처리하고, 혼합물을 교반한다.
  3. 오일 욕에서 64 ℃까지 혼합물을 가열 클로로포름 서서히 계면 활성제에 의해 안정화 된 DIO 함유 NP 현탁액을두고 증발 가교제 및 계면 활성제 양쪽의 중합을 개시한다.
  4. 전혀 응집을 제거하기 위해 0.2 ㎛의 주사기 필터를 통해 NP 서스펜션 (3 회) 필터. 스토추가 사용까지 4 ° C에서 필터링 된 NP 솔루션 다시.
  5. EDC의 결합을 통해 DIO-LCNP에 PEG-Chol을의 활용.
    1. Chol을-PEG-NH 2를 용해 · 25 mM의 HEPES 완충액 (pH 7.0)에 염산 (PEG-Chol을, 0.9 mm)이다.
    2. N - 히드 록시 sulfosuccinimide 나트륨 염 (NHSS 40 mM)을 농축 모액으로부터 HEPES 완충액에 1- 에틸 -3- (3- (디메틸 아미노) 프로필) 카르 보디이 미드 히드로 클로라이드 (EDC, 400 mm)를 함유하는 작업 용액을 제조 하였다.
    3. 즉시 HEPES 완충액 DIO-LCNP 1.0 ml의 NHSS / EDC의 새로 제조 된 작업 용액 20 μL를 추가로 5 분 동안 교반한다.
    4. 이 혼합물에 Chol을-PEG-NH 2 · 염산의 원액 20 μl를 추가하고 2 시간 동안 교반한다.
    5. 간단히 테이블 탑 미니 원심 분리기를 사용하여 평형화 PD-10 크기 배제 크로마토 그래피 컬럼 (13)를 통해 뜨는을 전달하는 30 초 동안 최대 속도 (~ 2000 XG)에서 반응 혼합물을 원심 분리둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS, 0.1X).

DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 2. 특성

  1. 겔 전기 영동에 의해 DIO-LCNP 표면에 PEG-Chol을 성공적으로 공유 결합을 확인합니다.
    1. (89 mM 트리스 (산도 7.6), 89 mM의 붕산, 2 mM의 EDTA TBE) 버퍼 (50) 트리스 - 붕산 전기의 ㎖ (1 배)에서 아가로 오스 0.5 g을 녹여. 아가로 오스를 분해하는 전자 레인지의 용액을 가열한다. 이 솔루션은 약간 냉각 및 전기 상자에 젤 판에 내용을 부어 할 수 있습니다. 샘플 우물을 만들 겔 빗를 삽입합니다.
    2. 겔이 고체화되면, 버퍼 챔버의 실행 TBE (챔버 내의 겔 잠길 정도로) 요구량을 추가한다.
    3. DIO-LCNP 시료 35 μL를 추가 겔의 웰에 110 V.의 전압으로 20 분 동안 실행 (5 %가 V / V, 글리세롤 개정)
    4. 이미지 겔 촬상 시스템 (WI)를 사용하여 젤일 여기 및 방출 필터는 각각 488 nm의 500-550 nm의,에.
  2. PBS에서 DIO-LCNP 용액 (~ 200 배 희석) (PH ~ 8 0.1X)을 희석하고, DLS 장비 (14) 상에 측정하여 동적 광산란 (DLS)에 의해 입도 분포를 평가한다. 적절한 제타 전위 측정 장치를 이용하여 DIO-LCNPs의 제타 전위를 측정한다.

배달 실험 및 이미징을위한 세포 배양 접시 3. 준비

주 : DIO-LCNP 라벨링 나란히 바와 같이 배양 된 HEK 293T (통로 5 ~ 15) / (17), 인간 배아 신장 세포에서 수행된다. 전달 실험과 후술하는 바와 같이 후속 세포 이미징을 수행한다.

  1. 20 μg의 농도로 ~ 소 피브로넥틴 (로 코팅하여 100 μl를 (14mm 1 위의 coverglass 삽입 장착) 35mm 직경의 조직 문화 요리를 준비37 ° C에서 2 시간 동안의 DPBS / ㎖).
  2. 배양 접시에서 피브로넥틴 코팅 용액을 제거한다. 수확 HEK 먼저 세정하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포 DPBS 3 ㎖로 한 후 트립신 EDTA (0.5 % 트립신, 0.25 % EDTA) 2 ㎖를 첨가하여 세포 단층.
  3. ~ 3 분 동안 37 ° C에서 플라스크를 품어. 트립신 - EDTA를 제거하고 인큐베이터에 플라스크를 반환합니다. 세포를 플라스크에서 분리되면, 완전 배지 4㎖를 첨가함으로써 트립신을 중성화 플라스크에 (; DMEM 둘 베코 변형 이글 중간 10 % 소 태아 혈청, 5 % 소듐 피루 베이트, 5 % 항생제 / 항진균제를 포함하도록 수정) . 셀 카운터들을 계산하여 상기 현탁액의 세포 농도를 결정한다.
  4. 성장 배지 ~ 8 × 104 세포 / ml의 세포 농도를 조정한다. 하룻밤 인큐베이터에있는 접시와 문화에 세포 현탁액 3 ML을 추가 다음 날, 세포 ~ 70 % 포화 상태에 있어야하고 사용할 준비해야한다. 알맞은세포 밀도는 세포의 높은 비율의 강력하고 효과적인 라벨 중요하다.

4. 휴대 DIO 및 DIO-LCNPs 납품 및 고정 세포의 이미징

  1. 전달 매체에 DIO, DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을 1 ml의 솔루션을 준비합니다 (HEPES-DMEM, DMEM 25 mM의 HEPES를 포함) DIO 무료 DIO-LCNPs의 원액을 희석하여; 세포 배양에 적합한 DIO 농도는 (DIO DIO-LCNP의 형태로 무료 또는 DIO의 농도 중 하나로 표시) ~ 1-10 μM 될 것입니다.
  2. 혈청 학적 피펫을 사용하여 배양 접시에서 배양 배지를 제거하고 세포 단층을 세척 HEPES-DMEM (2 ㎖ 각각 세척)로 2 회 (단계 3). 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 HEPES-DMEM를 제거하여 세척을 수행합니다.
  3. 배양 접시의 중심에 준비된 DIO 무료 또는 DIO-LCNP 전달 솔루션의 0.2 ML을 추가하고 난에 요리를 반환ncubator 적절한 기간 (실험의 필요에 따라 일반적으로 15 ~ 30 분)합니다. 긴 배양 시간이 아닌 멤브레인 영역의 더 특이 세포 라벨 (예를 들어, 세포질)에 추가 할 수 있습니다.
  4. 잠복기 후, 혈청 학적 피펫을 사용하여 전송 솔루션을 제거합니다. DPBS (2 씩으로 세척)과 세포 단층을 두 번 씻으십시오. 부드럽게 접시의 가장자리로부터 /로 DPBS를 추가하고 제거하여 세척을 수행한다.
  5. 실온에서 15 분 동안 (DPBS 제조) 4 % 파라 포름 알데히드를 사용하여 세포 단층을 고정한다.
    주의 : 파라 포름 알데히드는 가연성, 호흡기 자극 및 발암 물질로 의심.
  6. 피펫을 사용하여 파라 포름 알데히드 용액을 제거하고 부드럽게 추가하고 요리의 가장자리로 / 피펫을 사용하여 DPBS를 제거하여 세포를 DPBS 1 시간 (2 ml)에 씻는다.
  7. 고정 세포를 공 초점 레이저 주사를 사용하여 멤브레인 형광 신호의 존재 여부, 촬영 준비현미경 (CLSM). 즉시 이미징을 수행하거나, 또는 NaN이 3 0.05 %를 포함 DPBS와 매체를 교체하고 4 ℃에서 요리를 저장합니다.
    주의 : NaN의 3 독성; NaN의 3 사용할 때 극도의주의를 기울여야.
    참고 :이 방식으로 저장 수정 된 샘플은 최적의 결과를 위해 48 시간 내에 몇 군데해야합니다.

라이브 세포 DIO 및 DIO-LCNPs과 FRET 이미징 5. 세포 배달

참고 :이 방법에서는, 세포를 6 μM (DIO는 FRET 기증자입니다) 각 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 1,1'- 디 옥타 데실 3,3,3- ', 3'-tetramethylindocarbocyanine 과염소산 염 (DII와 colabeled된다 무료 DII)는 FRET 수용체이다. 세포막에 DIO-LCNP-PEG-Chol을 그 법인에서 DIO의 자료는 DII 수용체에 DIO 기증자에서 에너지 전달에서 관찰 된 증가에 의해 확인된다.

  1. DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII FRE 순차적 라벨 세포E 단계 4에 기재된 방법을 사용.
  2. 염색 후, 세포를 DPBS 1 시간 (2 ㎖) 혈청 학적 피펫을 사용하여 세척 및 생균 촬상 용액 2 ㎖ (LCIS)로 세척 버퍼를 교체한다.
  3. 가열 배양 챔버, 화상 전체 방출 488 nm에서 흥미로운 DIO 공여체에 의해 4 시간 동안 30 분 간격으로 FRET 이미징 구성의 공 초점 레이저 주사 현미경 (60X 대물 렌즈)를 사용하여 수집 생균 샘플 장착 된 현미경 스테이지 Remote 페이지 공여체 및 32 채널 스펙트럼 검출기 490-700 나노 미터에서 DII 수용체 모두 스펙트럼.
  4. 참고 : FRET 영상에 대한 자세한 내용은 15를 참조 참조하시기 바랍니다.
  5. DIO 기증자 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII으로 염색 된 세포에서 DII 수용체 모두의 시간 해결 발광 강도를 결정합니다. 시간 해결 수용체 / 기증자가 꾸준히 증가 비율 이미지 (DII EMI / DIO EMI), 결국 판을 FRET 계산AU 막에 분배 DIO 공여체의 양 일단 최대 16 도달했다.

6. DIO의 세포 독성 분석 및 DIO-LCNPs HEK 293T / 17 셀에

주 : DIO-LCNP 물질의 세포 독성은 테트라 졸륨 염료 계 증식 분석 17 사용하여 평가된다. 세포 전달 / 라벨링을 에뮬레이트 조건 하에서 물질의 다양한 농도의 존재 하에서 멀티 웰 플레이트에서 배양 하였다. 세포는 증식을 허용하도록 72 시간 동안 배양한다. 염료 (MTS는, (3- (4,5- 디메틸이 -2- 일) -5- (3- carboxymethoxyphenyl) -2- (4- 술포 페닐) -2H- 테트라 졸륨)을 웰에 첨가하고, 대사 적으로 활성되고 세포 청색 포르 마잔 생성물로 전환 염료. 색 형성 량은 생세포 수에 정비례한다.

  1. 수확 HEK 단계 3.2.Seed에 설명 된 절차를 수행하여 T-25 플라스크에서 293 T1 / 7 세포24 시간 동안 96 웰 조직 문화 처리 플레이트와 문화의 우물에 HEK 293T / 17 세포 (/ 100 μL / 잘 5,000 세포).
  2. 완전 무료 DIO를 포함하는 HEPES-DMEM 50 μl를 마이크로 피펫을 사용하여 우물에서 배양 배지를 제거하고 추가, 우물을 복제하기 위해 농도를 증가에서 DIO-LCNPs, 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을. 30 분 동안 37 ℃에서 세포를 인큐베이션.
    참고 : 일반적으로, 세중 또는 4 번씩 수행 복제합니다 통계적으로 신뢰할 수있는 데이터를 산출하기에 충분하다.
    1. 배양 후, 마이크로 피펫을 사용하여 물질을 함유하는 공급 배지를 제거하고 배양 배지 100 ㎕로 교체. 문화 72 시간 동안 세포.
  3. 물론 각각에 테트라 졸륨 기판의 20 μl를 추가 인큐베이터에 접시를 반환하고 색상 형성이 4 시간 동안 37 ° C에서 진행 할 수 있습니다. 570 nm의 (이 스투에 사용되는 DIO-LCNPs에 대한 흡수 극소의 포르 마잔 제품의 흡광도 (ABS)를 읽고DY) 및 비특이적 백그라운드 흡광도 650 nm의 감산 () 미세 적정 플레이트 판독기를 사용.
  4. 차동 흡광도 값 (ABS 570 - ABS 650) 플롯 물질 농도 대를 제어 세포 증식 (세포 배양 배지에서만 세포의 증식 정도)의 비율로 결과를보고한다.

7. 데이터 분석

  1. 통계적 분산의 변량 분석 (ANOVA)를 사용하여 데이터를 분석한다. 다중 비교를 들어, 페로 니의 사후 테스트를 적용합니다. 평균의 ± 표준 오차 달리 언급하지 않는 한 (SEM) 모든 평균 값을 제공합니다.
    참고 : 중요성에 대한 허용 확률은 P <0.05이었다.

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Representative Results

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LCNPs이되는 NP의 소수성 코어가 소수성화물에 대한 효율적인 배달 차량으로 LCNP의 유용성을 입증하는 대표적인 막 표지 프로브로드 제조 하였다. 이를 위해, 선택된화물은 매우 불용성 전위차 막 - 표지 염료 DIO이었다. 1 내지 18에 도시 된 바와 같이, DIO로드 LCNPs (DIO-LCNPs)는 화학 성분 DACTP11, AC10COONa 및 DIO와 2 상 미니 에멀젼 기법을 이용하여 합성 하였다. 이러한 NP 시스템에있어서, 상기 결정 성 가교제 DACTP11의 공유 결합 중합체 네트워크는 디오 가교 결합 네트워크 내의 틈새 공간 내에 존재하는 안정한 소수성 코어를 제공한다. 또한 세포 표적 리간드의 결합을위한 관능기로서 "핸들"을 제공하면서 NP 표면상의 카복실 그룹은 수성 매질에서 입자 콜로이드 안정성을 제공한다(및 기타 생물학적 제제). 원형질막에 DIO-LCNPs 밧줄하기 위해, 아민 종결 된 PEG 화 콜레스테롤 잔기 (PEG-Chol을)를 EDC 공유 결합을 통해 LCNP 표면 (도 1)에 장착 하였다. NP의 합성 및 성공적인 바이오 콘쥬 게이션의 확인 후, DIO-LCNPs의 능력은 살아있는 세포의 세포막에 라벨을하고 자유에 비해 개선 된 특이성 및 역학과 세포막 이중층 친 유성 부분에 내장 DIO화물을 제공하는 대량 솔루션에서 제공 형태 (DIO 무료) 평가 하였다.

2에 도시 된 바와 같이, DIO 무료 (6.0 μM)을 견고하게 고효율로 세포막 염색 HEK 293T / 17 세포 배양 15 분 후 (세포의 거의 100 %로 표시). 그러나, DIO 자유의 중요한 세포 국제화는 단지 겸손한 증가에 관찰되었다30 분 (그림 2 A와 C)에 배양 시간. DIO 자유 내재화의 정도는 세포가 제 6.0 μM DIO 무료 (30 분)으로 배양되는 시분 colocalization을 실험에 의해 결정되었다. Remote 페이지 자유 함유 배양 배지는 제거하고, 세포를 4 시간에 처리를 위해 계속해서 배양 하였다. 세포의 세포막은 (, PE-로다 로다 민 B 접합 phosphoethanolamine) 염료 표지 된 인지질 막으로 대조 하였다. 2 C에 도시 된 바와 같이, 항온 배양 15 분 후, DIO 자유 거의 100 %가 PE-로다 마커 (; PCC = 0.99 ± 0.01 피어슨 colocalization을 계수)와 colocalized 하였다. 그러나, 배양 한 후 30 분 ~ DIO없는 80 % 멤브레인 (내재화 ~ 20 %)에 결합 남았다. DIO 무료 국제화의 정도는 번째로 꾸준히 증가예를 배양 시간만큼 AS 4 시간으로 연장되고, 이는 DIO 및 로다-PE (도 2 C) 사이의 PCC의 동반 감소를 반영 하였다. 한 위상 지수 감쇠 식에 데이터 피트가 DIO 자유 내재화가 최대에 도달하는 것이 밝혀 ~ 내재화 율 (K = 0.045 분 -1) 및 반감기 (15 분)을 1 시간에 50 %, 그 무료 디오의 신속하고 효율적인 세포 흡수를 반영합니다. 이러한 데이터는 크게 조사 4 시간 기간에 걸쳐 핵 제외 남아 세포질로 세포막없는 DIO의 빠른 시간에 따른 추이를 보여준다.

무료 DIO의 제어되지 않은 세포 흡수를 감안할 때, 목표는 LCNP-PEG-Chol을 NP 제제로 DIO의 전달을 통해이 문제를 변조되었다. LCNP-PEG-Chol을의 bioconjugate로 제공,보다 지속적인 막 잔유DIO 무료에 비해 DIO의 줬어 시간은 (그림 2 B)를 기록했다. 세포와 DIO-LCNP-PEG-Chol을 배양 15 분 후, DIO 신호의 거의 100 %가 그것이 PE-로다 막 마커 colocalized 된 세포막, 비교했다 결과에 위치한 그 무료 DIO 관찰. 이는 멤브레인의 DIO 자유 표지 매우 균일하고 연속 동안, 항온 배양 15 분 후 DIO-LCNP-PEG-Chol을의 염색 패턴은 더 점상이었다 아니라 거의 자연 균일 같이 (도 있음이 관찰되었다 B). 이 결과는 DIO-LCNP-PEG-Chol을 NPS에서 세포막 내의 불연속 영역에 수집 된 것으로 나타났다. 배양 시간은 30 분으로 증가하면, ~ 다 DIO 신호의 94 % (도 (DIO이 동일 시각에 무료 ~ 80 %에 비해) 상기 멤브레인에 남아 2 B2C). 세포가 초기 30 분 배양 후 더욱 긴 시간은 DIO-LCNP-PEG-Chol을 된 NP와 배양으로 이러한 경향은 더욱 현저했다. 예를 들어, 초기 배양 후 1 시간 동안 배양 한 후, DIO-LCNP-PEG-Chol을 NP 신호의 약 80 %는 멤브레인 및 (DIO 무료 55 % ~ 비교)을 PE-로다 마커와 colocalized 남았다. 특히, DIO-LCNP-PEG-Chol을 된 NP의 세포 내재화 2 시간 (70 % 막 유지율) 30 %의 최대에 도달했다. 이것은 세포 흡수 속도에 해당한다 (K = 0.024 분 -1, 반감기 = 29 분) 정확히 절반 무료 DIO의 국제화에 대한 관찰이다.

다음으로, NP 매립 DIO화물의 기능을 효율적으로 LCNP 코어 밖으로 유출 및 판정 된 제어 및 시간 의존적 방식으로 세포막 이중층 친 유성 환경 들어간다. 에디오가 수용체 염료, DII에 에너지 전달에 종사하는 FRET 기증자의 역할을 특징이 평가하는 FRET 기반의 전략을 고안했다. 예상 한 바와 같이, 초기 표시 (t = 0 분)에 따라, 발광 신호는 상기 막 - 속박 된 NP (도 3 B) 내에 포함 된 DIO 공여체 지배 하였다. 이 같은 분야 4 시간 후 (t = 240 분)의 화상을 FRET 그러나, 세포막 이중층으로 LCNP 코어로부터 DIO 공여체의 천이 강력한 증거를 제공 DII 셉터의 발광 신호에있어서 상당한 증가를 보여 (그림 3 C). 이러한 전환의 시간 - 분해 성질 시험은 실험 4 시간 윈도우 위에 DII 셉터 발광에 상응하는 증가 (도 3 D)와 결합 DIO 공여자 발광 꾸준히 감소 하였다. 특히, 이러한 천이 동안 FRET 효율성은 맥시 도달DIO 기증자의 유출 및 막 파티션이 시점에서 최대 (그림 3 E)에 도달했다고 시사 ~ 180 분 후 초기 라벨에서 엄마. 이러한 데이터는 DIO-LCNP-PEG-Chol을 된 NP와 최대 ~ 3 시간의 후 초기 표시 도달 세포막 이중층에 NP에서 DIO의 시분 분할 강력한 증거를 제공 하였다.

마지막으로, 비교 독성 분석 DIO-LCNP-PEG-Chol을 대 자유 DIO 행 하였다. (두 경우 모두 6 μM의 농도에서 DIO) HEK 293T / 17 세포를 배양 할 때, LCNP 코어 내의 DIO 캡슐화가 세포 독성을 감쇠하는 것이 분명했다. 디오 무료 ~의 세포 생존율을 이끌어 동안 50 %, DIO-LCNP-PEG-Chol을 배양 세포는 세포 생존율 ~ 90 %를 나타냈다. (그림 4). 누적 셀 라벨 데이터는 셀룰러 toxi 결합도시 데이터 DIO 계 막 표지 효율 및 DIO의 세포 독성의 조절 모두 향상 보여준다.

그림 1
그림 1 : 막 결합 DIO-LCNP-PEG-Chol을의 도식 표현. DIO-LCNP는 아크릴 액정 가교제 (DACTP11)로 구성되고; 카복실 종료 합성 계면 활성제 (AC10COONa); 및 친 유성 염료, DIO. 콜레스테롤 - 말단 폴리 (에틸렌 글리콜) (PEG-Chol을)는 EDC 커플 통해 DIO-LCNP에 접합시켰다. DIO-LCNP 표면 Chol을 첨가 세포막에 NP의 결합을 매개 우선적. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.


그림 2 : HEK 293 T / 17 세포에서 DIO의 시간 해결 세포 흡수 무료. DIO 무료 (6.0 μM, 패널 (A) 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을 ([DIO] = 6.0 μM, 패널 (B)을, 15 분 동안 세포 단층 상에 인큐베이션 제거하고, 배양 배지로 교체 하였다, 세포를했다 (최대 4 시간까지). 세포 표시된 시간 동안 배양 이후 PE-로다 (2.0 μM)로 염색하고 해결했습니다. 샘플은 CLSM을 사용하여 DIO (녹색) 및 대한 군데 PE-로다 (적색) 막 결합되었다. ( C) 배양 시간 증가의 함수로서 막 결합 DIO 무료 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을 신호의 퍼센트 시분 플롯. 데이터는 피어슨 colocalization을 계수 (PCC에서 얻어진 N 3 # =시켰다177; 배양 15 분에 해당하는 PCC에 정상화 후 표준 녹색 (DIO)과 빨간색 (PE-로다) 채널의 편차) 및 SEM ± 비율 (로 표시). 스케일 바는 20 μm의 =. 참조 (18)의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 3
3 : 시분 FRET는 세포막에 DIO-LCNP-PEG-Chol을 행 DIO의 유출을 확인한다. HEK293T / 17 세포는 DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII의 DIO (녹색 발광)와 DII (적색 발광) 염료가 각각 FRET 공여체와 수용체의 역할과 costained했다. DIO-LCNP-PEG-Chol을 ([DIO] = 6.0 μM)와 DII (6.0 μM)로 costained 라이브 세포의 (A) DIC 이미지입니다. 의 S충분한 4 시간의 기간 동안 FRET 신호의 변화를 모니터링하기 위해 이미지화 하였다. (B)(C)는 각각 t = 0 분, t = 240 분으로 동일한 초점 평면의 생균의 FRET 이미지이다. (D) DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII 염색과 FRET 여기 모드에서 몇 군데 세포에서 DIO 기증자와 DII 수용체의 표준화, 시간 해결 발광 강도. DIO-LCNP-PEG-Chol을하고 DII으로 표시하고 FRET 구성에서 몇 군데 세포 (E) 시간 해결 FRET 비율 (DII EMI / DIO EMI). 스케일 바는 20 μm의 =. 참조 (18)의 허가 재판. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

그림 4
그림 4 세포 독성의 정량화. 디오 무료, LCNP, DIO-LCNPs, 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을 15 분 동안 HEK 293T / 17 셀 단층에 배양 한 다음 제거 하였다. 세포를 세척하고, MTS 분석에 앞서 72 시간 동안 성장 배지에서 배양 하였다. 막대 그래프는 [DIO] = 6.0 μM의 세포 생존 무료 DIO, LCNP, DIO-LCNP 및 DIO-LCNP-PEG-Chol을의 (N = 5 ± SEM)의 비교를 나타낸다. DIO 무료 LCNP, DIO-LCNP, 또는 DIO-LCNP-PEG-Chol을의 차이는 배양 72 시간에 유의 한 (P <0.001)입니다. 참조 (18)의 허가 재판. 데이터는 분산의 변량 분석 (ANOVA)을 이용하여 분석 하였다; 의 본 페로 니 포스트 혹 시험은 다중 비교를 위해 사용 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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Discussion

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NMDD의 지속적인 목표는 동시 개선 된 약효와 결합 된 제어 및 표적 세포 및 조직에 약물 전달 제제이다. 이 중요한 문제를 제기했다있는 약물 분자의 하나의 특정 클래스는 수성 매질에 더 용해도에 드물게이 소수성 약물 / 이미징 에이전트입니다. 이 문제는 임상에 체외 세포 배양 시스템에서 강력한 약물의 전환을 괴롭혀하고 "보류"되는 유망한 약물 분자의 수 결과 또는 포기하고 임상 환경에서 더 추구하지 않았습니다. 워트 마닌 (Wtmn)는, 예를 들면, 포스파티딜 -3 '키나제 및 포스파티딜 -3'키나제 - 관련 키나제의 강력한 억제제이며, 항암제로서 큰 잠재력을 가지고 있지만, 수용성이 부족은 임상 시험의 진행을 방해하고있다.

최근 Karve 등. 보여 주었다 개선 물 졸Wtmn의 ubility 때 지질 중합체 NP 조립체 (19)로서 제형. 크게 NP 제형 개선 된 제어 전달이 유형으로부터 이익을 얻을 수 한 분야는 세포막 소수성 약물 및 조영제의 전달이다. 따라서, 여기서의 목표는 이러한 기술적 장애물을 해결하기 위해 본 기술의 장애물을 극복 할 수있는 방법을 개발 하였다.

이 방법론을 개발, 모델 막 타겟팅 염료, DIO는, 역사적으로 수성 미디어에서 가난한 용해도에 시달리고있다가 선정되었다. 이 플라즈마 막에 염료의 특정 전송에 상당한 도전을 부여한다. 이들 과제 중에는 예컨대 DMSO 11, 12 등의 용제를 함유하는 모액으로부터 희석 후 DIO 매우 높은 농도로 세포를 세포 또는 조직 (10)에 직접 염료의 결정을 추가하거나 배양이 필요하다.접근 방식은 여기에 두 가지 : 1) NP 합성 동안 LCNPs의 소수성 코어에 DIO를 통합하고 2) 공유 결합 PEG 화 콜레스테롤 접합체 (DIO-LCNP-PEG-Chol을 함께 합성 된 DIO-LCNPs 수정) 촉진하기 위하여 세포막과 DIO 장착 된 NP의 직접적인 상호 작용. 사실,이 접근법은 효과적으로 세포막에 DIO의 전달의 양태들을 향상시켰다.

DIO 대량 솔루션에서 무료로 배달 된 경우에 비해 LCNP 제제로 제공 첫째, DIO의 막 체류 시간을 효과적으로 배가되었다. 공동 염색 실험에 의해 확인 된이 확장 막 체류 시간이 DIO-LCNP-PEG-Chol을의 현지화에 기인 하였다는 세포막의 지질 뗏목 마이크로 도메인에 공액. 둘째, 지질 이중층으로 DIO화물의 분할은 디오 막 상주 DII 셉터 도너로서 제공되는 FRET 실험에 의해 확인 하였다. 최종적으로,막 이중층에 DIO화물의 느린, 서방 효과적으로 40 % ~하여 DIO의 세포 독성을 약화.

성공을위한 중요한 프로토콜에 몇 가지 점을 강조하는 것이 중요하다. 우선, LCNP 코어에 DIO의 백분율 로딩 경험적 시험 합성 최적화되어야 고품질 DIO-LCNP-PEG-Chol을 된 NP의 생성 및 세포 전달 실험에서 형광 신호의 원하는 레벨의 균형을 얻기 위해 실행 . 마찬가지로, DIO-LCNP 표면에 Chol을-PEG-NH2 잔기의 바이오 콘쥬 게이션 셀룰러 라벨의 원하는 레벨을 얻기 위해 최적화되어야한다. 마지막으로, 피브로넥틴 피복 된 배양 접시에 적용되는 세포의 수는 성공에 매우 중요하고, 치료는 ~ 8 × 104 세포 / ml의 농도로 세포를 씨앗에주의해야한다 (~ 접시 당 2.4 × 105 세포) . 세포가 너무 희박한 시드 때 CE 시드 있지만, 그것은 비효율적 막 라벨링 결과명확하지 않는 가난한 이미지의 취득에 재편 너무 조밀 결과는 멤브레인 라벨을 보여줍니다.

대로의 설명 프로토콜의 하나의 잠재적 인 제한은 다양한 막 타겟팅 염료 및 의약품의 통합의 효율이 염료 / 의약품화물의 소수성에 따라 달라질 것입니다. 이러한 경우에, LCNP 합성 프로토콜 이상적인 염료 / 약물화물 결합에 대한 최적의 합성 조건을 결정하기 위해 경험적 테스트 할 것이다.

요약하면, 방법은 불용성화물의 세포 전달과 관련된 기술적 인 문제 중 많은 극복 살아있는 세포의 세포막에 소수성 염료화물 LCNP 기반 제어 전달을 위해 개발되어왔다. 방법의 전체적인 의미를 동시에 ASSOC은 부수적 독성 감쇠하면서 명확 원형질막화물의 특정 전달을 개선한다는 것이다벌크 용액에서 높은 농도에서 소수성화물의 배달 iated. 이 방법은 유사하게 도전 소수성 염료 / 영상 화제의화물의 전달 넓은 유틸리티를 찾아야 가능성 효과의 전이를 용이하게하는 데 도움이되며, 또 난 용성 임상 설정으로 실험 정권화물.

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Disclosures

저자는 더 경쟁 재정적 이해 관계가 없음을 선언합니다.

Acknowledgments

이 작품은 NRL 자료 기금 프로그램 (작업 단위 MA041-06-41-4943)에 의해 지원되었다. ON은 국가 연구위원회 박사후 연구 Associateship에 의해 지원됩니다.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

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References

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액정 나노 입자 캐리어의 소수성화물 캡슐화의 대상 플라즈마 멤브레인 배달
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Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

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