Waiting
Login processing...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
Click here for the English version

Bioengineering

Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier

doi: 10.3791/55181 Published: February 8, 2017

Summary

En flytende krystall nanopartikkel (LCNP) nanocarrier utnyttes som en bærer for kontrollert levering av en hydrofob last til plasmamembranen av levende celler.

Abstract

Den kontrollerte avlevering av medikament / billeddannende midler til celler som er avgjørende for utvikling av terapeutiske midler og for studiet av cellulære signaleringsprosesser. Nylig har nanopartikler (NPS) vist betydelig løftet i utviklingen av slike leveringssystemer. Her har et flytende krystall-NP (LCNP) -basert avleveringssystem blitt benyttet for kontrollert levering av en vann-uløselig fargestoff, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO), fra innsiden av NP kjernen til den hydrofobe region av en plasma membran bilaget. Under syntesen av NPS, ble fargestoffet effektivt innlemmet i den hydrofobe LCNP kjerne, som bekreftet ved flere spektroskopiske analyser. Konjugering av et PEGylert kolesterol-derivat til den NP overflate (DIO-LCNP-PEG-Chol) aktivert bindingen av fargestoffbelastede NPS til plasmamembranen i HEK-293T / 17-celler. Time-løst laser scanning konfokalmikroskopi og Förster resonans energi overføring (FRET) avbildning bekreftet passive utstrømming av Dio fra LCNP kjernen og dens innsetting i plasmamembranen bilaget. Endelig levering av Dio som en LCNP-PEG-Chol svekket cytotoksisiteten til Dio; NP form av Dio utstilt ~ 30-40% mindre toksisitet sammenlignet med Dio gratis levert fra bulk løsning. Denne tilnærmingen viser anvendeligheten av den LCNP plattformen som en effektiv modalitet for membran-spesifikk avlevering og modulering av hydrofobe molekyl last.

Introduction

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

Siden advent av grensesnitt nanomaterialer (materialer ≤ 100 nm i minst en dimensjon) med levende celler, har en vedvarende mål vært å dra nytte av de unike størrelsesavhengige egenskaper nanopartikler (NPS) for ulike bruksområder. Disse programmene omfatter celler og vev merking / imaging (både in vitro og in vivo), real-time sensing, og kontrollert levering av legemidler og andre laster 1. Eksempler på slike relevante NP egenskaper inkluderer størrelsen avhengige utslipp av halvleder-nanokrystaller (kvanteprikker, QDS); de Photothermal egenskapene til gull nanopartikler; stor lastekapasitet av den vandige kjerne av liposomer; og ballistisk ledningsevne av karbon allotropes, slik som single-vegg karbon nanorør og graphene.

Mer nylig har betydelig interesse oppstått i bruken av NPs for kontrollert modulering av narkotika og andre laster, for eksempel kontrast / bilde enherrer. Her, er begrunnelsen for å betydelig forbedre / optimalisere den totale oppløselighet, levert dose, halveringstid i sirkulasjonen, og eventuell klaring av stoffet last ved å levere det som en NP formulering. Dette har kommet for å bli kjent som NP-mediert levering av legemidler (NMDD), og det er for tiden syv FDA-godkjente NP narkotika formuleringer for bruk i klinikken for å behandle ulike kreftformer og hundrevis mer i ulike stadier av kliniske studier. I hovedsak er målet å "oppnå mer med mindre," det vil si å bruke NP som et stillas for å levere mer stoff med færre doserings administrasjoner ved å dra nytte av det store arealet: volum (f.eks harde partikler, for eksempel QDS og metalloksider) av NPs eller deres stort innvendig volum for lasting store laste nyttelast (f.eks liposomer eller miceller). Hensikten her er å redusere behovet for flere system levert doseringsregimer, mens på samme tid å fremme vandig stabilitet og forbedret sirkulasjon, spesielt forutfordrende hydrofobe narkotika last som, mens svært effektive, er lite løselig i vandig media.

Dermed er målet for arbeidet som er beskrevet heri var å bestemme levedyktigheten ved anvendelse av en ny NP stillas for den spesifikke og regulert avgivelse av hydrofobe lastene til de lipofile plasma membran bilaget. Motivasjonen for arbeidet var den iboende begrenset løselighet og vanskeligheter i levering av hydrofobe molekyler til celler fra vandige medier. Typisk levering av slike hydrofobe molekyler krever bruk av organiske løsningsmidler (f.eks DMSO) eller amfifile overflateaktive midler (for eksempel poloksamerer), som kan være giftige og kompromiss celle og vev levedyktighet 2, eller micelle-bærere, som kan har begrenset innvendig lasting kapasiteter. NP transportøren valgt her var en roman flytende krystall NP (LCNP) formulering utviklet tidligere tre og som hadde blitt vist tidligere for å oppnå en ~ 40 ganger forbedring i effektiviteten av anticancermedikament doxorubicin i dyrkede celler 4.

I det arbeidet som er beskrevet heri, er representativ last valgt var den potensiometriske membranen fargestoff, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO). Dio er en vann-uløselig fargestoff som har blitt brukt for anterograd og retrograd tracing i stue og faste nevroner, membranpotensialmålinger, og for generell membran merking 5, 6, 7, 8, 9. På grunn av dens hydrofobe natur, Dio typisk tilsatt direkte til cellemonolagene eller vev i en krystallinsk form 10, eller det blir inkubert ved meget høye konsentrasjoner (~ 1-20 uM) etter fortynning fra en konsentrasjon stamløsning 11, 12.

innhold "> Her tilnærmingen var bruk for LCNP plattformen, er en multifunksjonell NP hvis indre kjerne er helt hydrofobe og hvis overflate er samtidig hydrofil og mottagelig for bioconjugation, som en levering kjøretøy for Dio. Dio innlemmet i LCNP kjernen under syntese og NP overflate blir deretter funksjonalisert med et PEGylert kolesterol-del for å fremme membranen binding av DIO-LCNP ensemble til plasmamembranen. Denne fremgangsmåten resulterte i et avleveringssystem som partisjonert DIO inn i plasmamembranen med større nøyaktighet og membranen oppholds tid enn fri form av Dio levert fra bulk-løsning (DIO gratis). Videre denne metoden viste at LCNP-mediert levering av Dio vesentlig modulerer og driver frekvensen av spesifikke partisjonering av fargestoff inn i lipofile plasmamembranen bilaget. dette er oppnås mens samtidig reduksjon av cytotoksisitet av det frie medikament med ~ 40% ved å levere det som en LCNP formulering.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

1. Utarbeidelse av Dio-LCNP og DIO-LCNP-PEG-Chol

  1. Oppløs flytende krystallinske diakrylat tverrbindingsmiddel (DACTP11, 45 mg), 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO, 2 mg), og en fri radikal initiator (azobisisobutyronitril, 1 mg) for polymerisering i 2 ml kloroform. Legg til en vandig oppløsning av akrylat-funksjonaliserte overflateaktivt middel (AC10COONa og 13 mg i 7 ml).
  2. Omrør blandingen i 1 time og sonikere ved 80% amplitude i 5 minutter for å frembringe en miniemulsion som består av små dråper av det organiske materiale som er omgitt av polymeriserbart overflateaktivt middel i vann.
  3. Varm blandingen til 64 ° C i et oljebad for å initiere polymerisasjonen av både tverrbindingsmiddel og overflateaktivt middel som kloroform langsomt fordamper og etterlater en DIO-inneholdende NP suspensjon som er stabilisert med overflateaktivt middel.
  4. Filtrering av suspensjonen NP (3 ganger) gjennom et 0,2 um sprøytefilter for å fjerne eventuelle aggregering. Store den filtrerte NP-løsning ved 4 ° C inntil videre anvendelse.
  5. Bøyning av PEG-Chol til Dio-LCNP via EDC kobling.
    1. Oppløs Chol-PEG-NH2 * HCl (PEG-Chol, 0,9 mM) i 25 mM HEPES-buffer (pH 7,0).
    2. Fremstille en arbeidsoppløsning inneholdende N-hydroksy-sulfosuccinimide natriumsalt (NHSS, 40 mM) og 1-etyl-3- (3- (dimetylamino) propyl) karbodiimid-hydroklorid (EDC, 400 mM) i HEPES-buffer fra konsentrerte stamløsninger.
    3. Umiddelbart legge til 20 ul av den nyfremstilte oppløsning av arbeids NHSS / EDC til 1,0 ml av Dio-LCNP i HEPES-buffer og omrør i 5 min.
    4. Tilsett 20 ul av stamløsning av Chol-PEG-NH2 * HCl til denne blanding og omrørt i 2 timer.
    5. I korthet sentrifuger reaksjonsblandingen ved maksimal hastighet (~ 2000 xg) i 30 sekunder ved hjelp av en bordsentrifuge og mini passere supernatanten gjennom en PD-10-størrelsesutelukkende kromatografi-kolonne 13 ekvilibrert medDulbeccos fosfatbufret saltoppløsning (DPBS, 0.1x).

2. Karakterisering av Dio-LCNP og DIO-LCNP-PEG-Chol

  1. Bekreft vellykket kovalente konjugering av PEG-Chol til Dio-LCNP overflaten ved gel elektroforese.
    1. Oppløs 0,5 g agarose i 50 ml (1x) i tris-borat-elektroforese (TBE; 89 mM Tris (pH 7,6), 89 mM borsyre og 2 mM EDTA) buffer. Varm løsningen i en mikrobølgeovn for å oppløse agarose. Tillat løsningen å avkjøles litt og helle innholdet til en gel plate i elektroforese-boksen. Sett inn en gel kam for å lage prøvebrønner.
    2. Når geleen har stivnet, legger den nødvendige mengden (nok til å senke gelen i kammeret) av TBE buffer til kammeret.
    3. Legg 35 ul av DIO-LCNP prøven (endret med glycerol, 5% v / v) til brønnene i gelen og kjørt i 20 minutter ved en spenning på 110 V.
    4. Bilde gelen ved hjelp av en gel imaging system with eksitasjon og emisjonsfiltre på 488 nm og 500-550 nm, henholdsvis.
  2. Vurdere partikkelstørrelse og fordeling av dynamisk lysspredning (DLS) ved fortynning av den DIO-LCNP-løsning (~ 200-gangers fortynning) i PBS (pH ~ 8, 0,1X) og måling på en DLS instrument 14. Mål zeta-potensialet i Dio-LCNPs med en passende zeta potensialet måleinstrument.

3. Utarbeidelse av cellekultur Retter for levering Eksperimenter og Imaging

MERK: Dio-LCNP merking er utført på HEK 293T / 17 humane embryonale nyreceller (mellom passasjer 5 og 15) som er dyrket som beskrevet tidligere fire. Utføre levering eksperimenter og den påfølgende celle bildebehandling som beskrevet nedenfor.

  1. Fremstille 35 mm diameter vevskulturskåler (utstyrt med 14 mm No. en dekkglass innsettinger) ved å belegge dem med bovin fibronektin (~ 100 mikroliter ved en konsentrasjon på 20 ug/ ML) i DPBS i 2 timer ved 37 ° C.
  2. Fjern det fibronektin beleggsløsningen fra dyrkningsskålen. Avling HEK 293-T1 / 7 celler fra T-25-kolbe ved først å vaske den cellemonolaget med 3 ml DPBS og deretter ved tilsetning av 2 ml trypsin-EDTA (0,5% trypsin-0,25% EDTA).
  3. Inkuber kolben ved 37 ° C i ~ 3 minutter. Fjerne trypsin-EDTA og tilbake i kolben til inkubatoren. Når cellene er løsrevet fra kolben, nøytralisere trypsin ved å tilsette 4 ml komplett medium (Dulbeccos modifiserte Eagles medium, DMEM, endres til å inneholde 10% føtalt bovint serum, 5% natrium-pyruvat, og 5% antibiotisk / antimykotisk) til kolben . Bestemme cellekonsentrasjonen i suspensjonen ved å telle dem i en celleteller.
  4. Juster cellekonsentrasjonen til ~ 8 x 10 4 celler / ml med vekstmedium. Tilsett 3 ml av cellesuspensjonen til fatet og kulturen i inkubatoren natten over; den neste dag, bør cellene være på ~ 70% konfluens og bør være klar for bruk. Tilstrekkeligcelletetthet er kritisk for robust og effektiv merking av en høy prosentandel av celler.

4. Cellular Levering av Dio og Dio-LCNPs og Imaging av fikserte celler

  1. Forbered 1 ml løsninger av Dio, Dio-LCNP, og Dio-LCNP-PEG-Chol i levering medium (HEPES-DMEM; DMEM inneholder 25 mM HEPES) ved å fortynne stamløsninger av Dio gratis og Dio-LCNPs; egnede DIO konsentrasjoner for inkubering på celler vil være ~ 1-10 pM (uttrykt som enten konsentrasjonen av Dio fri eller Dio i form av DIO-LCNP).
  2. Fjern det vekstmedium fra kulturskåler ved anvendelse av en serologisk pipette og vask av cellemonolagene (se trinn 3) to ganger med HEPES-DMEM (2 ml hver vask). Utfør vasker ved å forsiktig legge til og fjerne HEPES-DMEM ved hjelp av en pipette til / fra kanten av rettene.
  3. Legg 0,2 ml av den tilberedte Dio gratis eller DIO-LCNP levering løsninger til sentrum av kultur retter og returnere retter til jeginkubator for en passende tidsperiode (vanligvis 15 eller 30 minutter, avhengig av behovene i eksperimentet). Lengre inkubasjonstider legge til mer spesifikk cellulær merking av ikke-membran områder (f.eks, cytosol).
  4. Etter inkubasjonstiden, fjerne levering løsninger ved hjelp av en serologisk pipette. Vask cellemonolagene to ganger med DPBS (2 ml hver vask). Utfør vasker ved å forsiktig legge til og fjerne DPBS til / fra kanten av fatet.
  5. Feste av cellemonolagene ved bruk av 4% paraformaldehyd (fremstilt i DPBS) i 15 min ved romtemperatur.
    FORSIKTIG: Paraformaldehyde er brannfarlig, en luftveis irriterende, og en mistenkt kreftfremkallende.
  6. Fjern paraformaldehyde løsning ved hjelp av en pipette og forsiktig vaske cellene en gang med DPBS (2 ml) ved å legge til og fjerne DPBS bruker pipette til / fra kanten av rettene.
  7. De fikserte celler er klare til å bli avbildet med hensyn til nærvær av en membran fluorescens-signal ved hjelp av konfokal laser-skanningmikroskopi (CLSM). Utfør bildebehandling umiddelbart eller alternativt erstatte mediet med DPBS inneholder 0,05% NaN 3 og lagre rettene ved 4 ° C.
    FORSIKTIG: NaN 3 er giftig; utvise ekstrem forsiktighet ved bruk av NaN 3.
    MERK: Fast prøver lagret på denne måten skal avbildes innen 48 timer for å oppnå optimale resultater.

5. Cellular Levering av Dio og Dio-LCNPs og FRET Imaging i levende celler

MERK: I denne metoden, er celler colabeled med 6 mikrometer hver DIO-LCNP-PEG-Chol (hvor Dio er en FRET donor) og 1,1'-dioktadekyl-3,3,3 ', 3'-tetramethylindocarbocyanine perklorat (Dii fri, hvor DII er en FRET akseptor). Utgivelsen av Dio fra Dio-LCNP-PEG-Chol og dens inkorporering i plasmamembranen blir bekreftet av en observert økning i energioverføring fra Dio donor til DII akseptor.

  1. Merk celler sekvensielt med Dio-LCNP-PEG-Chol og DII free ved hjelp av fremgangsmåten beskrevet i trinn 4.
  2. Etter farging, vaske cellene en gang med DPBS (2 ml) med en serologisk pipette og erstatte vaskebuffer med 2 ml av levende celle tenkelig løsning (LCIS).
  3. På et mikroskop scenen utstyrt med et oppvarmet inkubasjon kammer, bilde levende celleprøve ved hjelp av et konfokal mikroskop (60x objektiv) med en FRET bilde konfigurasjon med 30 minutters intervaller over en 4 timers periode med spennende Dio donor ved 488 nm og samle fullt utslipp spektra av både Dio donor og Dil akseptor 490-700 nm med en 32-kanals spektral detektor.
  4. MERK: For mer informasjon om FRET bildebehandling, se referanse 15.
  5. Bestem tids løst utslippsintensiteten av både Dio donor og Dil akseptor fra celler farget med Dio-LCNP-PEG-Chol og DII. Beregn tids løst akseptor / donor FRET ratio (Dil EMI / Dio EMI) for bildene, som vil stadig øke og til slutt plateau en gang mengden av Dio donor delt inn i membranen har nådd et maksimum 16.

6. Cvtotoksisitetsmålinq av Dio og Dio-LCNPs til HEK 293T / 17 Cells

MERK: cytotoksisitet av Dio-LCNP materialer vurderes ved hjelp av en tetrazolium dye-basert spredning analysen 17. Celler dyrkes i et flerbrønn plate i nærvær av varierende konsentrasjoner av materialene under betingelser som etterligner levering / merking. Cellene blir deretter dyrket i 72 timer for å tillate spredning. Et fargestoff (MTS (3- (4,5-dimetyltiazol-2-yl) -5- (3-carboxymethoxyphenyl) -2- (4-sulfofenyl) -2H-tetrazolium) blir deretter tilsatt til brønnene, og metabolsk aktive cellene konvertere fargestoffet til et blått formazanprodukt. mengden av fargedannelse er direkte proporsjonal med antall levedyktige celler.

  1. Avling HEK 293-T1 / 7 celler fra T-25-kolbe ved å følge fremgangsmåten beskrevet i trinn 3.2.SeedHEK 293T / 17-celler (5000 celler / 100 ul / brønn) til brønnene i en 96-brønners vevskultur-behandlede plate og kultur i 24 timer.
  2. Fjerne kulturen media fra brønnene ved hjelp av en mikropipette og tilsett 50 mL av HEPES-DMEM inneholder Dio gratis, Dio-LCNPs, eller Dio-LCNP-PEG-Chol ved økende konsentrasjoner å gjenskape brønner. Inkuber på cellene ved 37 ° C i 30 minutter.
    MERK: Vanligvis replikater gjort i tre eksemplarer eller fire eksemplarer er tilstrekkelig til å gi statistisk pålitelige data.
    1. Etter inkubering, fjernes levering medium inneholdende materialer ved hjelp av en mikropipette og erstatte den med 100 ul vekstmedium. Kultur av cellene i 72 timer.
  3. Tilsett 20 pl av den tetrazolium substrat til hver brønn, returnere platen til inkubatoren, og tillate fargedannelse forløpe ved 37 ° C i 4 timer. Les absorbansen (abs) av formazanprodukt ved 570 nm (absorpsjon minima for Dio-LCNPs brukes i denne study) og 650 nm (for subtraksjon av ikke-spesifikk bakgrunn absorbans) under anvendelse av en mikrotiter plateleser.
  4. Plott differensial absorbansverdien (abs 570 - 650 abs) som funksjon av materialkonsentrasjon og rapportere resultatene som prosent av kontroll celleproliferasjon (grad av proliferasjon av celler i cellekulturmedium bare).

7. Data Analysis

  1. Statistisk analysere dataene med en univariat analyse av varians (ANOVA). For flere sammenligninger, påfør Bonferroni innlegg hoc test. Gi alle gjennomsnittsverdier som ± standardfeil (SEM) med mindre annet er nevnt.
    MERK: akseptabel sannsynlighet for betydningen var p <0,05.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

LCNPs ble fremstilt hvori den hydrofobe kjerne av NP ble lastet med en representant membranmerking sonde for å demonstrere anvendeligheten av LCNP som en effektiv levering bærer for hydrofobe last. For dette formål er den last som ble valgt var den meget vannuløselige potensiometrisk membranmerking fargestoff, Dio. DIO-lastet LCNPs (DIO-LCNPs) ble syntetisert ved hjelp av en to-fase mini-emulsjon teknikk med kjemiske komponenter DACTP11, AC10COONa, og Dio, som vist i Figur 1 18. I dette NP system tilveiebringer kovalent bundet polymernettverk av den krystallinske tverrbindingsmiddel DACTP11 en stabil hydrofob kjerne hvor den DIO ligger innenfor de interstitielle rom i det tverrbundet nettverk. De karboksylatgrupper på overflaten NP gi kolloidal stabilitet til partikkel i vandige media samtidig tjener som en funksjonell gruppe "håndtak" for feste av celle-målsøkende ligander(Og andre biologiske). For å tjore Dio-LCNPs til plasmamembranen, er en amin-terminert PEGylert kolesterol-del (PEG-Chol) kovalent bundet til den LCNP overflaten via EDC koplingen (figur 1). Etter NP syntese og bekreftelse på vellykket bioconjugation, til evnen til Dio-LCNPs merke plasmamembranen til levende celler, og for å levere den innebygde DIO lasten til den lipofile delen av plasmamembranen bilaget med forbedret spesifisitet og kinetikk i forhold til den frie form (DIO gratis) levert fra bulkløsningen ble vurdert.

Som vist i figur 2 A, DIO fri (6,0 uM) robust farget plasmamembranen med høy effektivitet (nesten 100% av cellene merket) etter 15 min inkubering med HEK-293T / 17-celler. Imidlertid ble betydelig cellulær internalisering av Dio gratis observert på bare en beskjeden økning iinkubasjonstid på 30 minutter (figur 2 A og C). Omfanget av Dio fri intern ble bestemt av tids løst colocalization eksperimenter der cellene først ble inkubert med 6,0 mikrometer Dio gratis (30 min). Den frie DIO-holdige inkubasjonsmediet ble deretter fjernet, og cellene ble deretter dyrket i opptil 4 timer. Plasmamembranen til cellene ble motfarget med en farvestoff-merket fosfolipid-membran (phosphoethanolamine konjugert til Rhodamine B; PE-Rode). Som vist i figur 2 C, etter 15 min inkubering, ble nesten 100% av Dio fri colocalized med PE-Rode markør (Pearsons colocalization koeffisient; PCC = 0,99 ± 0,01). Men etter 30 min inkubasjon ~ 80% av Dio gratis forble bundet til membranen (~ 20% internalisert). Graden av Dio fri intern økt jevnt som the inkubasjonstid ble utvidet til så lenge som fire timer, og dette ble reflektert i samtidig reduksjon i PCC mellom Dio og Rhoda-PE (figur 2 C). En tilpasning av dataene til en en-fase eksponensiell desintegrasjon ligning avslørte at DIO frie internalise nådde et maksimum på ~ 50% på 1 time, med en internalisehastighet (k = 0,045 min-1) og halveringstiden (15 min) som reflekterte den raske og effektive cellulært opptak av Dio gratis. Disse data viser den hurtige tidsavhengige overgang av Dio fri fra plasmamembranen til cytosol, hvor det forble stort sett utelukket fra kjernen i løpet av den fire timers periode undersøkt.

Gitt den ukontrollerte cellulært opptak av Dio fri, ble målet å modulere denne atferden gjennom levering av Dio som en LCNP-PEG-Chol NP formulering. Når levert som en LCNP-PEG-Chol biokonjugatet, en mer vedvarende membran residhet tiden av Dio forhold til Dio gratis ble notert (figur 2 B). Etter 15 min inkubering av den DIO-LCNP-PEG-Chol med cellene, ble nesten 100% av den Dio-signalet ligger på plasmamembranen, hvor det ble colocalized med PE-Rode membran markør, et resultat som var sammenlignbar som ble observert for Dio gratis. Det ble imidlertid bemerkes at mens DIO fri merking av membranen var helt ensartet og sammenhengende, det fargemønster av DIO-LCNP-PEG-Chol etter 15 min inkubering ble mer punktformet, og ikke på langt nær så ensartet i natur (figur 2 B). Dette resultatet viste at Dio-LCNP-PEG-Chol NPs skulle samle inn i adskilte områder innen plasmamembranen. Når inkubasjonstiden ble øket til 30 minutter, ~ 94% av den Dio signal holdt seg på membranen (i forhold til ~ 80% for Dio fri på denne samme tidspunkt) (figur 2 B og 2C). Denne trenden ble enda mer uttalt som cellene ble dyrket med Dio-LCNP-PEG-Chol NPs for stadig lengre tid etter den første 30 min inkubasjon. For eksempel etter kultur for en time etter den første inkubasjon, nesten 80% av Dio-LCNP-PEG-Chol NP signal forble membran og colocalized med PE-Rhoda markør (sammenlignet med ~ 55% for Dio gratis). Spesielt den cellulære internalisering av Dio-LCNP-PEG-Chol NPs nådde et maksimum på 30% ved 2 timer (70% membran oppbevaring). Dette tilsvarer et cellulært opptak hastighet (k = 0,024 min-1; halveringstid = 29 min) som er nøyaktig halvparten av det som ble observert for internalisering av Dio fri.

Deretter evne til NP-innleiret Dio last til effektivt utstrømning ut av LCNP kjerne og angi den lipofile miljø av plasmamembranen bilaget i en kontrollert og tidsavhengig måte, ble bestemt. Tilvurdere dette ble et FRET-basert strategi utviklet, karakterisert ved at DIO tjener som et FRET donor engasjert i energioverføringen til akseptor-fargestoff, DII. Som forventet, ved første merking (t = 0 min), ble utslipps signal dominert av den Dio donor inneholdt i membran tjoret NPS (figur 3 B). FRET avbildning av dette samme felt 4 timer senere (t = 240 min), men viste en signifikant økning i utslipp signalet for DII akseptor, noe som gir et sterkt bevis på overgang av Dio donor fra LCNP kjernen inn i plasmamembranen bilaget (figur 3C). Undersøkelse av tids-oppløst natur av denne overgang viste en jevn nedgang i Dio donor utslipp kombinert med en tilsvarende økning i DII akseptor utslipp over 4 timers forsøks vindu (figur 3 D). Spesielt, gnage effektivitet i løpet av denne overgangen nådde sitt maximamma på ~ 180 min etter første merking, noe som tyder på at utstrømningen og membran oppdeling av Dio donor hadde nådd sitt maksimum på dette tidspunkt (figur 3 E). Disse dataene gitt sterke bevis på tids løst oppdeling av Dio fra NP til plasmamembranen bilaget som nådde sin maksimale ~ 3 timer etter første merking med Dio-LCNP-PEG-Chol NPs.

Til slutt ble utført sammenlignende cytotoksisitet analyser for Dio gratis versus DIO-LCNP-PEG-Chol. Når inkubert med HEK 293T / 17 celler (ved en dio konsentrasjon på 6 pM i begge tilfeller), var det klart at innkapsling av DIO innenfor LCNP kjernen svekkes dens cytotoksisitet. Mens Dio gratis fremkalte cellulære viabilities av ~ 50%, celler inkubert med Dio-LCNP-PEG-Chol utstilt cellulære viabilities ~ 90%. (Figur 4). Kumulativt, celle merking data kombinert med celle toxicity ​​data viser forbedringer i både effektiviteten av DIO-basert membran merking og moduleringen av cytotoksisiteten til Dio.

Figur 1
Figur 1: Skjematisk fremstilling av membran-bindende DIO-LCNP-PEG-Chol. DIO-LCNP er sammensatt av et akrylat flytende krystall tverrbindingsmiddel (DACTP11); en karboksyl-terminerte polymeriserbare overflateaktivt middel (AC10COONa); og et lipofilt fargestoff, Dio. Kolesterol-terminerte poly (etylenglykol) (PEG-Chol) ble konjugert til DIO-LCNP via EDC kopling. Tilsetting av Chol til Dio-LCNP overflaten formidler fortrinnsrett binding av NP til plasmamembranen. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.


Figur 2: Time-løst cellulært opptak av Dio gratis i HEK 293 T / 17 celler. DIO fri (6,0 uM, panel (A) eller DIO-LCNP-PEG-Chol ([dio] = 6,0 uM, panel (B) ble inkubert på cellemonolag i 15 minutter, fjernet og erstattet med vekstmedium, ble cellene dyrket i tidspunktene angitt (opptil 4 timer). Cellene ble deretter farget med PE-Rode (2,0 uM) og fikseres. prøvene ble fotografert for DIO (grønn) og membranbundet PE-Rode (rød) ved hjelp av CLSM. ( C) tid-løst diagram av prosent av membranbundne DIO fri eller DIO-LCNP-PEG-Chol signal som en funksjon av økende inkubasjonstid. dataene ble oppnådd fra Pearsons colocalization koeffisient (PCC, n = 3 & #177; standardavvik) av den grønne (DIO) og røde (PE-Rhodas) kanaler, og er uttrykt som en prosentandel (± SEM) etter normalisering til PCC tilsvarer 15 min med inkubasjon. Scale bar = 20 mikrometer. Gjengitt med tillatelse fra referanse 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 3
Figur 3: Time-løst FRET bekrefter utstrømming av Dio fra Dio-LCNP-PEG-Chol til plasmamembranen. HEK293T / 17 celler ble costained med Dio-LCNP-PEG-Chol og Dil, hvor DIO (grønn utslipp) og Dil (røde emitting) fargestoffer fungere som FRET donor og akseptor, henholdsvis. (A) DIC bilde av levende celler costained med Dio-LCNP-PEG-Chol ([Dio] = 6,0 mm) og Dil (6,0 mm). de srikelig ble fotografert for å overvåke endringen i FRET signal over en periode på 4 timer. (B) og (C) er de FRET bilder av den levende celle på samme fokalplanet ved t = 0 min og t = 240 min, respektivt. (D) Normalisert, tids løst utslippsintensiteten av Dio donor og Dil akseptor fra celler farget med Dio-LCNP-PEG-Chol og Dil og fotografert i FRET eksitasjon modus. (E) Time-løst FRET ratio (Dil EMI / Dio EMI) for celler merket med Dio-LCNP-PEG-Chol og Dil og fotografert i FRET konfigurasjon. Scale bar = 20 mikrometer. Gjengitt med tillatelse fra referanse 18. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Figur 4
Figur 4 Kvantifisering av cytotoksisitet. Dio gratis, LCNP, Dio-LCNPs, eller Dio-LCNP-PEG-Chol ble inkubert på HEK 293T / 17 cellemonolagene i 15 minutter og deretter fjernet. Cellene ble vasket og dyrket i vekstmedium i 72 timer før analysen MTS. Baren diagrammet representerer en sammenligning av cellen levedyktighet (n = 5 ± SEM) av Dio gratis, LCNP, Dio-LCNP, og Dio-LCNP-PEG-Chol på [Dio] = 6,0 mikrometer. Forskjellen mellom Dio gratis og LCNP, Dio-LCNP, eller Dio-LCNP-PEG-Chol er signifikant (p <0,001) på 72 timer med inkubasjon. Gjengitt med tillatelse fra referanse 18. Dataene ble analysert ved anvendelse av univariate analyse av varians (ANOVA); den Bonferroni innlegg hoc test ble brukt for multiple sammenligninger. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

or Start trial to access full content. Learn more about your institution’s access to JoVE content here

En fortsatt målet for NMDD er kontrollert målretting og levering av narkotika formuleringer til celler og vev, kombinert med samtidig forbedret legemidlets effekt. En spesiell klasse av narkotika molekyler som dette har utgjort en betydelig utfordring er hydrofobe stoffer / bilde agenter som har sparsomt til ingen oppløselighet i vandige media. Dette problemet har plaget overgangen av potente legemidler fra in vitro-cellekultursystemer for å klinisk setting, og har resultert i en rekke lovende medikamentmolekyler å være "henlagt" eller forlatt og ikke fulgt videre i et klinisk miljø. Wortmannin (Wtmn), for eksempel, er en potent inhibitor av fosfatidylinositol-3'-kinaser og fosfatidylinositol-3'-kinase-relaterte kinaser og har et stort potensiale som et anticancermiddel, men dens mangel på vannoppløselighet har hemmet sin progresjon i kliniske forsøk.

Nylig, Karve et al. viste forbedret vann solubility av Wtmn når formulert som en lipid-polymer NP montering 19. En arena som kan ha stor nytte av denne typen forbedret, kontrollert levering som en NP formulering er levering av hydrofobe legemidler og kontrastmidler til plasmamembranen. Dermed målet her var å løse dette tekniske hinder og å utvikle en metode for å overvinne denne teknologiske hinder.

I utviklingen av denne metodikken, en modell membran-targeting fargestoff, Dio, ble valgt som historisk har vært plaget av dårlig oppløselighet i vandige media. Dette bevirker betydelige utfordringer i spesifikk levering av fargestoff til plasmamembranen. Blant disse utfordringene er behov for å legge til den krystallinske form av farvestoffet direkte til celler eller vev 10 eller for å inkubere celler med meget høye konsentrasjoner av Dio etter fortynning fra stamløsninger inneholdende løsningsmidler slik som DMSO 11, 12.Tilnærmingen her var todelt: 1) innlemme DIO i den hydrofobe kjernen av LCNPs under NP syntese og 2) kovalent endre-syntetiserte Dio-LCNPs med et pegylert og kolesterol konjugat (DIO-LCNP-PEG-Chol) for å lette direkte interaksjon av Dio-lastet NPs med plasmamembranen. Faktisk, denne tilnærmingen effektivt forbedret en rekke aspekter ved levering av Dio til plasmamembranen.

Først membranen oppholdstid på Dio ble effektivt doblet når den leveres som en LCNP formulering i forhold til når Dio ble levert uten bulk løsning. Denne utvidede membran oppholdstid ble tilskrevet lokalisering av Dio-LCNP-PEG-Chol konjugater til lipid flåten mikroområder av plasmamembranen, noe som bekreftes av co-flekker eksperimenter. For det andre ble oppdeling av DIO lasten inn i det ytterste lipid bilaget bekreftet ved FRET eksperimenter hvor det DIO tjente som donor til en membran-resident DII akseptor. Endeliglangsom, vedvarende frigjøring av DIO lasten inn i membranen bilaget effektivt svekkes cytotoksisiteten til Dio med ~ 40%.

Det er viktig å markere flere punkter i protokollen som er kritiske for å lykkes. For det første må den prosentvise belastning av DIO inn i LCNP kjerne empirisk optimaliseres i prøve syntese løper for å oppnå en balanse mellom genereringen av høy kvalitet DIO-LCNP-PEG-Chol NPS og det ønskede nivå av fluorescens-signal i cellulære leverings eksperimenter . Likeledes må bioconjugation av Chol-PEG-NH2-delen til den DIO-LCNP overflate optimaliseres for å oppnå det ønskede nivå av cellulær merking. Endelig, er det antall celler som anvendes til fibronektin-belagte kulturskåler kritisk for suksess, og forsiktighet må utvises for å frø cellene ved en tetthet på ~ 8 x 10 4 celler / ml (~ 2,4 x 10 5 celler pr tallerken) . Når cellene blir sådd altfor tynt, resulterer det i ineffektiv membran merking, mens såing ceLLS også tettest resultater i oppkjøpet av dårlige bilder som ikke klart viser membran merking.

En mulig begrensning av den som-er beskrevet protokoll er at effektiviteten av inkorporering av forskjellige andre membran rettet mot fargestoffer og legemidler vil variere avhengig av hydrofobisiteten til fargestoff / medikament last. I slike tilfeller vil LCNP syntese protokollen må testes empirisk å bestemme de optimale syntesebetingelsene for ideelle dye / narkotika last innlemmelse.

Oppsummert har en metode utviklet for LCNP baserte kontrollert levering av en hydrofob fargestoff last til plasmamembranen av levende celler som overvinner mange av de tekniske utfordringene knyttet til mobilnettet levering av vann-uløselig last. Den generelle betydningen av fremgangsmåten er at den tydelig forbedrer spesifikk levering av last til plasmamembranen og samtidig dempning av den ledsagende cytotoksisitet som er Associated med levering av hydrofobe last ved høye konsentrasjoner fra bulkløsning. Denne tilnærmingen bør finne bred anvendelse ved levering av tilsvarende utfordrende hydrofobe dye / bildebyråets last og vil trolig bidra til å lette overgangen for effektiv, men dårlig vannløselig, last fra den eksperimentelle regimet til klinisk setting.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne hevder at de ikke har noen konkurrerende økonomiske interesser.

Acknowledgments

Dette arbeidet ble støttet av NRL grunnfinansiering Program (Work Unit MA041-06-41-4943). PÅ er støttet av en National Research Council postdoc Associateship.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) ThermoFisher E2247
3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) Sigma Aldrich D4292-20MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride Nanocs, Inc. PG2-AMCS-2k
Countess automated cell counter ThermoFisher C10227
Dioctadecyl-3,3,3′⁠,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) Sigma Aldrich 468495-100MG Hazardous; make stock solution in DMSO
Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) ThermoFisher 14040182 Warm in 37 °C before use
Dynamic light scattering instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Fibronectin Bovine Protein, Plasma ThermoFisher 33010018 Make stock solution 1 mg/ml using DPBS. Use 20-30 µg/ml for coating MetTek dish, 2 hr at 37 °C
Formaldehyde (16%, W/V) ThermoFisher 28906 Hazardous; dilute to 4% using DPBS
Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) American Type Culture Collection ATCC® CRL-11268™
Live cell imaging solution (LCIS) ThermoFisher A14291DJ Warm in 37 °C before use
MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish MatTek corporation P35G-1.0-14-C
Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES ThermoFisher 21063045 Warm in 37 °C before use
N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) ThermoFisher 24510
Nikon A1si spectral confocal microscope Nikon Instruments
Trypan Blue Stain (0.4%)  ThermoFisher T10282 mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells
Zeta potential instrument ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK)
Ultrasonic Processor Sonics and Materials Inc GEX 600-5
Mini Cetntrifuge Benchmark Mini-fuge-04477
PD-10 Sephadex™ G-25 Medium GE Healthcare 17-0851-01
Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System Bio-RAD 76S/07434
Trypsin-EDTA (0.25%), phenol red ThermoFisher 25200056

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7, (5), 335-352 (2016).
  2. Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28, (3), 1317-1330 (2014).
  3. Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3, (10), 3214-3220 (2009).
  4. Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8, (7), 6986-6997 (2014).
  5. Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208, (Pt 1), 65-74 (2002).
  6. Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11, (6), 649-653 (1990).
  7. Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62, (4), 327-351 (2000).
  8. Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12, (9), 333-341 (1989).
  9. Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93, (1), 13-20 (1999).
  10. Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101, (4), 697-713 (1987).
  11. Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97, (4), 329-333 (1992).
  12. Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274, (31), 21673-21678 (1999).
  13. Garrett, R. H., Grisham, C. M. Biochemistry. 5th, Brooks/Cole Cengage Learning. Belmont, CA. (2013).
  14. Berne, B. J., Pecora, R. Dynamic Light Scattering. Courier Dover Publications. 41155-41159 (2000).
  15. Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. Basics of FRET Microscopy. http://www.microscopyu.com/articles/fluorescence/fret/fretintro.html (2016).
  16. Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
  17. Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
  18. Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27, (4), 982-993 (2016).
  19. Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109, (21), 8230-8235 (2012).
Målrettet plasmamembran Levering av en hydrofob Cargo innkapslet i en Liquid Crystal partikler Carrier
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).More

Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Targeted Plasma Membrane Delivery of a Hydrophobic Cargo Encapsulated in a Liquid Crystal Nanoparticle Carrier. J. Vis. Exp. (120), e55181, doi:10.3791/55181 (2017).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter