Riktade Plasma Membrane Leverans av en hydrofob Cargo inkapslad i en Liquid Crystal nanopartiklar Carrier
Summary
En vätskekristallnanopartikel (LCNP) nanocarrier utnyttjas som ett medel för styrd tillförsel av ett hydrofobt last till plasmamembranet hos levande celler.
Abstract
Den kontrollerade leveransen av läkemedel / avbildande ämnen till celler är kritisk för utvecklingen av terapeutiska medel och för studier av cellulära signalprocesser. Nyligen har nanopartiklar (NPS) visat betydande löfte i utvecklingen av sådana avgivningssystem. Här har en flytande kristall NP (LCNP) -baserad avgivningssystem använts för reglerad avgivning av ett vattenolösligt färgämne, 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO), inifrån NP kärnan till den hydrofoba regionen av ett plasma membranbiskiktet. Under syntesen av de nationella parlamenten, var färgämnet effektivt införlivas i hydrofoba LCNP kärna, vilket bekräftas av flera spektroskopiska analyser. Konjugering av en PEGylerad kolesterolderivat till NP yta (DiO-LCNP-PEG-Chol) aktiverat bindningen av de färgämnesladdade NP till plasmamembranet i HEK 293T / 17-celler. Tidsupplöst laserskanning konfokalmikroskopi och Förster resonansenergiöverföring (FRET) avbildning bekräftade passetIve utflöde av DiO från LCNP kärnan och dess införande i plasmamembranet tvåskiktsmembran. Slutligen försvagat leverans av DiO som LCNP-PEG-Chol cytotoxiciteten av DiO; NP form av DiO uppvisade ~ 30-40% mindre toxicitet jämfört med DiO gratis levereras från bulklösningen. Detta tillvägagångssätt visar användbarheten av LCNP plattformen som en effektiv modalitet för membranet specifik avgivning och modulering av hydrofoba molekyl last.
Introduction
Sedan tillkomsten av gränssnittsnanomaterial (material ≤100 nm i åtminstone en dimension) med levande celler, har ett fortsatt mål varit att dra fördel av de unika storleksberoende egenskaper hos nanopartiklar (NPS) för olika tillämpningar. Dessa applikationer inkluderar cell- och vävnads märkning / avbildning (både in vitro och in vivo), realtidsanalys och kontrollerad leverans av läkemedel och andra laster 1. Exempel på sådana relevanta NP egenskaper innefattar emission storleksberoende av halvledarnanokristaller (kvantprickar, QDs); de fototermiska egenskaper guld nanopartiklar; den stora lastförmåga av den vattenhaltiga kärnan i liposomer; och ballistiska ledningsförmågan hos kol allotropes, såsom enda vägg kolnanorör och grafen.
På senare tid har stort intresse uppstått i användningen av NPS för kontrollerad modulering av läkemedel och andra laster, såsom kontrast / imaging enherrar. Här är syftet att väsentligt öka / optimera den totala lösligheten, levererade dosen, cirkulationstiden, och eventuell clearance av läkemedlet lasten genom att leverera det som ett NP formulering. Detta har kommit att kallas NP-medierad läkemedelstillförsel (NMDD), och det finns för närvarande sju FDA-godkända NP läkemedelsformuleringar för användning i kliniken för behandling av olika cancerformer och hundratals fler i olika stadier av kliniska prövningar. I huvudsak är målet att "uppnå mer med mindre," det vill säga att använda NP som en byggnadsställning för att leverera mer läkemedel med färre doserings administrationer genom att dra nytta av den stora ytarea: volym (t.ex., hårda partiklar, såsom QDs och metalloxider) av NPS eller deras stora inre volym för lastning stora lastVikt (t.ex. liposomer eller miceller). Syftet här är att minska behovet av flera systemiskt levererade dosregimer medan samtidigt främja vattenstabilitet och förbättrad cirkulation, i synnerhet förutmanande hydrofoba läkemedels last att även mycket effektiv, är svårlösliga i vattenhaltiga medier.
Således var målet för det arbete som beskrivs häri för att bestämma möjligheten att använda en ny NP byggnadsställning för den specifika och kontrollerad leverans av hydrofoba laster till den lipofila plasmamembranet tvåskiktsmembran. Motiveringen för arbetet var den inneboende begränsad löslighet och svårigheter i leveransen av hydrofoba molekyler till celler från vattenbaserade medier. Normalt kräver leverans av sådana hydrofoba molekyler användningen av organiska lösningsmedel (t.ex. DMSO) eller amfifila ytaktiva ämnen (t.ex. poloxamerer), som kan vara giftiga och kompromisser cell- och vävnadslivsduglighet två eller micell bärare, som kan ha begränsad intern belastning kapacitet. NP bäraren valts här var en ny flytande kristall NP (LCNP) formulering utvecklades tidigare 3 och som hade visats tidigare för att uppnå en ~ 40-faldig förbättring av effektiviteten av anticancerläkemedlet doxorubicin i odlade celler 4.
I det arbete som beskrivs häri, den representativa last väljs var den potentiometriska membran färgämnet 3,3'-dioctadecyloxacarbocyanine perklorat (DIO). DiO är en vattenolöslig färgämne som har använts i antero och retrograd spårning i levande och fixerade neuroner, membranpotentialmätningar, samt för allmänna membranmärkning 5, 6, 7, 8, 9. På grund av dess hydrofoba natur, är DiO typiskt tillsättas direkt till cellmonoskikt eller vävnader i en kristallin form 10, eller det inkuberas vid mycket höga koncentrationer (~ 1-20 M) efter utspädning från en koncentration stamlösning 11, 12.
innehåll "> Här var den metod nytta för LCNP plattform, är en multifunktionell NP vars inre kärna är helt hydrofoba och vars yta är samtidigt hydrofila och mottagliga för biokonjugering, för att forsla för DiO. DiO införlivas med LCNP kärnan under syntes och NP ytan därefter funktionaliseras med en PEGylerad kolesterol molekyldel att främja membranbindning av DiO-LCNP ensemble till plasmamembranet. Detta tillvägagångssätt resulterade i ett avgivningssystem som fördelades den DiO in i plasmamembranet med större trohet och membranuppehålls tid än den fria formen av DiO levereras från bulklösningen (DIO gratis). Vidare visade denna metod att LCNP-medierad leverans av DiO avsevärt modulerar och driver graden av specifik uppdelning av färgämnet i den lipofila plasmamembranet tvåskiktsmembran. detta är uppnås samtidigt samtidigt minskar cytotoxiciteten hos det fria läkemedlet vid ~ 40% genom att leverera det som en LCNP formulering. <p class = "jove_content"> Det förväntas att den metod som beskrivs häri kommer att vara en kraftfull möjliggör teknik för forskare vars arbete innebär eller kräver cellulär leverans av starkt hydrofoba last som är svårlösliga eller helt olösliga i vattenlösning.Protocol
Representative Results
Discussion
En fortsatt mål att NMDD är den kontrollerade målinriktning och avgivning av läkemedelsformuleringar till celler och vävnader, i kombination med samtidig förbättrad läkemedelseffektivitet. En specifik klass av läkemedelsmolekyler för vilka detta har utgjort en betydande utmaning är hydrofoba läkemedel / avbildande medel som har sparsamt till ingen löslighet i vattenhaltiga medier. Detta problem har plågat övergången av potenta läkemedel från i cellodlings vitro-system till den klinisk…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes av NRL Base finansieringsprogrammet (arbetsenhet MA041-06-41-4943). ON stöds av en National Research Council forskar Associateship.
Materials
| 1-ethyl-3-(3-(dimethylamino)-propyl)carbodiimide hydrochloride (EDCA) | ThermoFisher | E2247 | |
| 3,3′-dioctadecyloxacarbocyanine perchlorate (DiO) | Sigma Aldrich | D4292-20MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Cholesterol poly(ethylene glycol) amine hydrochloride | Nanocs, Inc. | PG2-AMCS-2k | |
| Countess automated cell counter | ThermoFisher | C10227 | |
| Dioctadecyl-3,3,3′,3′-tetramethylindocarbocyanine perchlorate (DiI) | Sigma Aldrich | 468495-100MG | Hazardous/ make stock solution in DMSO |
| Dulbecco's Modified Eagle's Medium (DMEM) | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (DPBS) | ThermoFisher | 14040182 | Warm in 37°C before use |
| Dynamic light scattering instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Fibronectin Bovine Protein, Plasma | ThermoFisher | 33010018 | Make stock solution 1mg/mL using DPBS. Use 20-30 µg/mL for coating MetTek dish, 2 h@ 37°C |
| Formaldehyde (16%, W/V) | ThermoFisher | 28906 | Hazardous, dilute to 4% using DPBS |
| Human embryonic kidney cells (HEK 293T/17) | American Type Culture Collection | ATCC® CRL-11268™ | |
| Live cell imaging solution (LCIS) | ThermoFisher | A14291DJ | Warm in 37°C before use |
| MatTek 14 mm # 1.0 coverglass insert cell culture dish | MatTek corporation | P35G-1.0-14-C | |
| Modified Eagle Medium (DMEM) containing 25 mM HEPES | ThermoFisher | 21063045 | Warm in 37°C before use |
| N-hydroxysulfosuccinimide sodium salt (NHSS) | ThermoFisher | 24510 | |
| Nikon A1si spectral confocal microscope | Nikon Instruments | ||
| Trypan Blue Stain (0.4%) | ThermoFisher | T10282 | mix as a 50% to the cell suspension before counting the cells |
| Zeta potential instrument | ZetaSizer NanoSeries (Malvern Instruments Ltd., Worcestershire, UK) | ||
| Ultrasonic Processor | Sonics and Materials Inc | GEX 600-5 | |
| Mini Cetntrifuge | Benchmark | Mini-fuge-04477 | |
| PD-10 Sephadex™ G-25 Medium | GE Healthcare | 17-0851-01 | |
| Bio-Rad ChemiDoc XRS Imaging System | Bio-RAD | 76S/07434 | |
| Trypsin-EDTA(0.25%), phenol red | ThermoFisher | 25200056 |
References
- Nag, O. K., Field, L. D., Chen, Y., Sangtani, A., Breger, J. C., Delehanty, J. B. Controlled actuation of therapeutic nanoparticles: an update on recent progress. Ther. Deliv. 7 (5), 335-352 (2016).
- Galvao, J., Davis, B., Tilley, M., Normando, E., Duchen, M. R., Cordeiro, M. F. Unexpected low-dose toxicity of the universal solvent DMSO. FASEB J. 28 (3), 1317-1330 (2014).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Anderson, G. P., Chen, M. S., Ratna, B. R. Spectral tuning of organic nanocolloids by controlled molecular interactions. ACS Nano. 3 (10), 3214-3220 (2009).
- Spillmann, C. M., Naciri, J., Algar, W. R., Medintz, I. L., Delehanty, J. B. Multifunctional Liquid Crystal Nanoparticles for Intracellular Fluorescent Imaging and Drug Delivery. ACS Nano. 8 (7), 6986-6997 (2014).
- Timmers, M., Vermijlen, D., Vekemans, K., De Zanger, R., Wisse, E., Braet, F. Tracing DiO-labelled tumour cells in liver sections by confocal laser scanning microscopy. J. Microsc. 208 (Pt 1), 65-74 (2002).
- Mufson, E. J., Brady, D. R., Kordower, J. H. Tracing neuronal connections in postmortem human hippocampal complex with the carbocyanine dye DiI. Neurobiol Aging. 11 (6), 649-653 (1990).
- Köbbert, C., Apps, R., Bechmann, I., Lanciego, J. L., Mey, J., Thanos, S. Current concepts in neuroanatomical tracing. Prog. Neurobiol. 62 (4), 327-351 (2000).
- Honig, M. G., Hume, R. I. Dil and DiO: versatile fluorescent dyes for neuronal labelling and pathway tracing. Trends Neurosci. 12 (9), 333-341 (1989).
- Gan, W. B., Bishop, D. L., Turney, S. G., Lichtman, J. W. Vital imaging and ultrastructural analysis of individual axon terminals labeled by iontophoretic application of lipophilic dye. J. Neurosci. Methods. 93 (1), 13-20 (1999).
- Godement, P., Vanselow, J., Thanos, S., Bonhoeffer, F. A study in developing visual systems with a new method of staining neurones and their processes in fixed tissue. Development. 101 (4), 697-713 (1987).
- Ragnarson, B., Bengtsson, L., Haegerstrand, A. Labeling with fluorescent carbocyanine dyes of cultured endothelial and smooth muscle cells by growth in dye-containing medium. Histochemistry. 97 (4), 329-333 (1992).
- Korkotian, E., Schwarz, A., Pelled, D., Schwarzmann, G., Segal, M., Futerman, A. H. Elevation of intracellular glucosylceramide levels results in an increase in endoplasmic reticulum density and in functional calcium stores in cultured neurons. J. Biol. Chem. 274 (31), 21673-21678 (1999).
- Garrett, R. H., Grisham, C. M. . Biochemistry. , (2013).
- Berne, B. J., Pecora, R. . Dynamic Light Scattering. , 41155-41159 (2000).
- Kremers, G. J., Piston, D. W., Davidson, M. W. . Basics of FRET Microscopy. , (2016).
- Chen, H., Kim, S., Li, L., Wang, S., Park, K., Cheng, J. X. Release of hydrophobic molecules from polymer micelles into cell membranes revealed by Förster resonance energy transfer imaging. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 6596-6601 (2008).
- Campling, B. G., Pym, J., Galbraith, P. R., Cole, S. P. C. Use of the MTT assay for rapid determination of chemosensitivity of human leukemic blast cells. Leukemia Res. 12, 823-831 (1988).
- Nag, O. K., Naciri, J., Oh, E., Spillmann, C. M., Delehanty, J. B. Lipid raft-mediated membrane tethering and delivery of hydrophobic cargos from liquid crystal-based nanocarriers. Bioconjug. Chem. 27 (4), 982-993 (2016).
- Karve, S., et al. Revival of the abandoned therapeutic wortmannin by nanoparticle drug delivery. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (21), 8230-8235 (2012).
