T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
Lymfocytproliferation som reaktion på antigene eller mitogene stimulering er en let kvantificerbar fænomen nyttig til afprøvning immunmodulerende (dvs. immunsuppressiv eller immunstimulerende) kemiske forbindelser og biologiske. En af de tidligste trin under mitogenese er celle forstørrelse eller blastogen transformation, hvorefter stiger celle volumen før division. Det er normalt påvises i de første mange timers T-lymfocyt-stimulering. Her beskriver vi en hurtig fremgangsmåde til at kvantificere blastogenese i T-lymfocytter isoleret fra muse milt og humane perifere mononukleære blodceller (PBMC'er) anvendelse af en automatiseret celletæller. Forskellige almindeligt anvendte proliferationsassays for det meste er besværlig og kun afspejler den samlede befolkning effekt snarere end individuelle cellulære effekter inden for en population. I modsætning hertil præsenteres automatiseret celletæller assay tilvejebringer hurtig, direkte og præcise målinger af cellediametre, der kan værebruges til at vurdere effektiviteten af forskellige mitogener og immunmodulerende lægemidler in vitro.
T-lymfocytter er de primære celler er ansvarlige for adaptiv immunitet i pattedyr. Det er kendt, at de reagerer på specifikke antigene peptider præsenteret af MHC-molekyler på overfladen af antigenpræsenterende celler. Ved aktivering af en beslægtet T-celle-receptor (TCR), cellen forstørrer i en proces betegnet blastogen omdannelse eller blastogenese. Denne proces kan påvises i den første ~ 6 timer efter at stimulus påføres 1. Under blastogenese, mængderne af individuelle T-celler øges 2- til 4-fold 2-6. Lymfocytter begynder at proliferere i en proces kaldet klonal ekspansion, hvis formål er at generere så mange kloner af antigen-specifikke TCR-bærende celler som muligt. Afkom-celler derefter udøve deres immunologiske funktion ved at differentiere til cytotoksiske (CD8 +) eller hjælper (CD4 +) T-lymfocytter. Således naive T-lymfocytter i humant eller muse blod er i G 0 (hviler) fase af cellencyklus og støtte minimal metabolisk aktivitet. Ved udsættelse for antigener eller mitogener, T-celler genindtræde cellecyklussen, med en samtidig stimulering af transkription og proteinsyntese 7-10. Mitogener, såsom phorbol-12-myristat-13-acetat (PMA) og ionomycin stimulere lymfocytterne via aktivering af protein kinase C (PKC) og Ca2 + -afhængige signalveje 1. Aktiveringen af T-celler med PMA / ionomycin omgår TCR signalering trin.
In vitro proliferation assays er almindeligt brugt til det formål at vurdere lymfocytfunktionen og respons på stimuli. Spredning aflæsninger tages typisk en til tre dage efter påbegyndelse af T-cellestimulering og afspejler den kollektive tilstand af hundreder eller tusinder af celler. Styrken af forskellige mitogener og immunmodulerende lægemidler in vitro kan bedømmes ved blot at måle proliferationshastigheder i nærvær af disse forbindelser. Nogle af disse enssays og deres begrænsninger er diskuteret nedenfor.
For direkte celletal optælling, proceduren er tidskrævende, med en høj sandsynlighed for operatørfejl.
For DNA-syntese, den 3H-thymidin inkorporering assay måler DNA-syntese, men dens største begrænsning er dens radiotoksicitet. En ikke-radioaktiv alternativ er BrdU, men rækken af lineære respons for cellevækst er begrænset og antistofbehandling er påkrævet, som forøger antallet af trin i proceduren 11,12.
Til metabolisk aktivitet, tetrazoliumsalte (MTT, MTS, XTT, og WST-1) og Resazurinfarvestof-baserede kolorimetriske assays rapporterer den generelle metaboliske tilstand dividere cellepopulationer. Men MTT ikke er opløseligt i dyrkningsmediet, kræver yderligere vasketrin, således inkorporere fejl i målingen; XTT brug yderligere komponenter for at reducere effektivt; MTS-, WST-1- og tilsætte Resazurin-baserede målinger er påvirkeed af dyrkningsmediet pH og dets komponenter serum, albumin eller phenolrødt 13-16. Disse assays måler ikke det faktiske antal af levedygtige celler, men snarere estimere de kombinerede enzymaktiviteter. Derfor proliferationshastigheden kan ikke bestemmes nøjagtigt ved metaboliske assays på grund af det ikke-lineære korrelation mellem celleantal og reduktion farvestof 12,17.
Til måling ATP-koncentration, T-celle-aktiverings-induceret stigning i ATP korrelerer med proliferation. Imidlertid elevation af intracellulær ATP er en af de indledende trin i T-celleaktivering; mange skridt bag er den faktiske spredning 17,18.
For farvestof fortynding assay CFSE fluorescerende farvestof farver celler ved kovalent binding til intracellulære proteiner. Farvestoffet viser en spredning-afhængigt fald i fluorescensintensitet, som kan spore antallet af celledelinger. Men på grund af kovalente protein mærkning, funktioner disseproteiner kan være kompromitteret. Farvestoffet er toksisk for cellerne ved højere koncentrationer. Ved lavere koncentrationer farvestof er imidlertid den indledende fluorescensintensitet reduceret, mindske antallet af celledelinger, der kan spores. Derudover, efter mærkning med CFSE, der er en spredning-uafhængig ~ 50% tab af indledende fluorescens under den første 24 til 48 timer periode, hvilket begrænser det dynamiske område for dette assay 19,20.
De fleste af disse assays afspejler den kollektive tilstand af et stort antal celler og kræver behandling af cellerne med fluorescerende farvestoffer. Nekrotiske og apoptotiske celler kan også bidrage til disse målinger, medmindre de fjernes fra analysen ved farvning med kemikalier eller antistoffer.
Lymfocyt blastogenese kan evalueres ved en række fremgangsmåder, såsom optisk mikroskopi eller flowcytometri 4,21,22. Her beskriver vi en hurtig fremgangsmåde til måling af T-celle-størrelser under anvendelse af enn automatiseret celletæller, som indsamler realtid celle billeder, der er gemt og kan genbruges analyseret på et senere tidspunkt. Foruden størrelse målinger, denne enhed giver præcise celleantal og procentdelen af levedygtige celler, som bestemt ved trypanblåt-farvning udelukkelse. Den enhed, der bruges i denne protokol er kommercielt tilgængelige, og producenten testet præcisionen af instrumentet ved hjælp af tre forskellige instrumenter og flere koncentrations- og levedygtighed kontrol. Resultaterne af disse undersøgelser viste en koefficient af varians, der var generelt under 6%. Som nævnt i protokollen, er enheden kalibreres regelmæssigt med 6 um og 8 um polystyren diameter perler. Fordelene ved at anvende en celletæller at differentiere mellem hvilende T-celler og T-lymfoblaster baseret på cellediameter er brugervenligheden og den automatiserede arten af analysen. Softwaren er i stand til at tegne en cirkel rundt om hver celle og beregning af cellediameter. Derudover imaldre er synlige for operatøren, der kan kontrollere rigtigheden af instrumentet identificere cellerne og korrekt tegne en cirkel omkring dem. Med hensyn til begrænsninger, kan instrumentet ikke i sig selv skelne mellem snavs og celler; Derfor er det vigtigt, at operatøren ser hvert billede, da det bliver behandlet. Der er et potentiale for at inkorporere luftbobler, som vil reducere antallet af brugbare områder til analyse; dette er imidlertid sjældent, hvis en regelmæssig udskylning vedligeholdelse udføres.
I denne undersøgelse blev grupper af milt-T-lymfocytter stimuleret med ionomycin og stigende koncentrationer af PMA i 12-48 timer. PMA-koncentrationer så lave som 2 ng / ml inducerede både en robust blastogen respons og signifikant proliferation. Målinger af virkningerne af en række lægemidler, såsom immunosuppressive cyclosporin A (CsA), FK506 (tacrolimus), og rapamycin (sirolimus), samt ionkanalblokkere TRAM-34 og FTY720 (fingolimod), om blastogenese viste god overensstemmelse med rapporterede effekter på spredning. Den blastogen respons af humane PBMC'er til PMA / ionomycin og murine T-celle-stimulering med anti-CD3 og anti-CD28 antistof-coatede magnetiske perler blev også målt.
Cellen counter assay kvantificerer både blastogenese og spredning sats (celletæthed) samtidig, men hver for sig, i modsætning til de ovennævnte metoder, der ser på en kombination af disse effekter. Den præsenterede protokol giver en hurtig og robust teknik for at vurdere styrken af mitogene og immunmodulerende midler.
Her beskriver vi en teknik til hurtig påvisning og kvantificering af T-celle blastogen transformation under anvendelse af en automatiseret celletæller. Under vores betingelser (250 ng / ml PMA og 250 nM ionomycin stimulation) blev cellen overfladeareal forøges to gange, og volumenet tre gange efter 48 timers aktivering. Assayet er tilstrækkelig følsom til at påvise sprængning i de første 12 timer af aktivering, hvor cellen steg kun 1,25 gange sammenlignet med hvilende (figur 2D). En mere fysiologisk relevant mekanisme T-celle-aktivering ved anvendelse af anti-CD3 og anti-CD28 antistof-coatede magnetiske perler frembragte en signifikant blastogen respons, med en gennemsnitlig 2,3 gange stigning i volumen (72 timer efter aktivering, figur 3D). Humane mononukleære celler viste en 2,6 gange ændring i volumen på PMA / ionomycin stimulation i 48 timer (figur 4). ICR mus milt-T-celle gennemsnitlige diameter og volumen blev bestemt til at være6.9 um og 1,9 x 10 -4 nl hhv. Humane PBMC'er (fra en rask donor) havde en gennemsnitlig diameter på 7,7 um og en gennemsnitlig volumen på 2,7 x 10 -4 nl. Ved anvendelse af denne protokol, vi også testet stigende koncentrationer af PMA for deres evne til at aktivere T-celler. Disse encellede resultaterne var i overensstemmelse med proliferationsassays udføres på lignende PMA-koncentrationer.
Adskillige forbindelser er rapporteret at påvirke celleproliferation blev testet: FTY720 31,32; den immunosuppressive cyclosporin A, FK506, rapamycin og 27,28; og TRAM-34, en blokker af calcium-aktiverede KCa3.1 kanaler 33,35. Vi fandt, at ved de testede koncentrationer, de mest potente hæmmere af blastogenese var CsA og FK506. Rapamycin havde en mindre, men statistisk signifikant undertrykkende virkning på blastogenese. TRAM-34, på den anden side, påvirkede ikke blastogenesereaktion.
CsA undertrykt både blastogenese og proliferation, men ikke fuldstændigt (figur 2B og 2C), hvilket viser, at automatiseret celletæller måling er en god korrelat af lægemiddel effektivitet i T-celle-proliferation. I nærvær af rapamycin sammen med CsA, blastogenese var fuldstændigt inhiberet, hvilket antyder, at NFAT- og mTOR-medierede veje i kombination fuldt ud kan redegøre for T-celle-udvidelsen ved mitogenisk stimulering med PMA / ionomycin (figur 3C).
Dynamikområde nogle proliferationsassays er begrænset (se figur 2). Proliferationsassays, såsom den, vi har brugt (figur 2C), rapporterer et signal, der indeholder bidrag fra apoptotiske og nekrotiske celler. Automatiserede ændre diameter målinger ikke har denne begrænsning, da målingerne vedrører kun levedygtige celler. Cellelevedygtighed vurderes ved udelukkelse af trypanblåt-plet fra sunde og levedygtige celler. I størrelse målinger, anvendelse af fremadrettetlysspredning i flowcytometri diskrimination dublet celle kan være problematisk 22. I de automatiserede celle counter målinger blev der ikke dublet population fundet (Figur 1). , Målingen var også tilstrækkelig præcis til at skelne mellem virkningerne af 100 og 200 nM cyclosporin (tabel 1) og at opdage blastogenese inden 12 timer af mitogen stimulation (figur 2D).
Denne nye assay er særlig nyttigt for små antal prøver. Op til 15 prøver kan måles i 1 time. Men analysen har sine begrænsninger, hvoraf de fleste kan mindskes. Selvom den effektivt kan løse små (<1 um) forskel i cellediameter, maskinmodellen vi bruges har en lavere detektionsgrænsen på 5 um. Denne grænse kan medføre overvurdering af meget små cellestørrelser, da det effektivt udelukker alle celler med mindre diametre. Men nyere modeller af cellen tælleren har påvisning tærskeårige på ~ 2 um, som bør afhjælpe dette problem. Hvis der er for meget snavs i prøven, instrumentet behandler dem som levedygtige celler. Derudover kan luftbobler lejlighedsvis komme ind i flow-celle og fremkalde cellen billeder taget af maskinen. Den forvrængning synes ikke at påvirke levedygtigheden beslutsomhed, men det kan påvirke de målte diametre. Derfor anbefales det, at alle billeder kontrolleres af forsøgslederen for luftbobler, før data fra hvert forsøg accepteres til analyse. Da softwaren kun trækker cirkler omkring cellerne, kan diametrene af ikke-sfæriske celler være skæv hen imod den lange akse, hvilket gør assayet mindre egnet til ikke-sfæriske celler.
Dette assay er hurtig, idet ca. 4 min per prøve, sammenlignet med proliferationsassays, som kræver et par timer. Dataindsamlingen er også ret simpelt ved hjælp af softwaren, der følger med enheden. Softwaren kan eksportere måledata til en spreadsheet til analyse. Endelig er det en enkelt celle, i modsætning til en population, måling; både blastogenese og proliferation måles; og det skelner mellem levedygtige og døde celler samtidigt. Det kan bruges til at evaluere forskellige musestammer for deres evne til at opbygge et immunrespons. Assayet kan også anvendes med succes til måling af blastogenese i T-celler fra humane donorer (figur 4), og det kan også anvendes i andre celletyper.
Cell volumen stiger er kendt for at bidrage til reguleringen af stofskiftet: celle hævelse stimulerer glutamin-induceret glykogen syntese og lipogenese i hepatocytter 36,37. Neutrofiler vise migration-associerede volumen stigninger på 35-60%, mens kemotaktiske midler fremkalde 10-15% hævelse 38-40. Den nuværende assay kan potentielt anvendes til at studere disse processer.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |