Abstract
응답 림프구 증식 항원하거나 분열 촉진 자극 테스트 면역 (즉, 면역 억제 또는 면역) 화학 화합물 및 생물학적 제제에 유용한 쉽게 정량화 할 수있는 현상이다. 세포 분열시의 초기 단계 중 하나는 분할 전의 세포 부피 증가 가는데 셀 확대 또는 blastogenic 변환된다. 그것은 T 림프구 자극의 첫 번째 몇 시간에서 일반적으로 감지합니다. 여기서는 자동 세포 계수기를 사용하여 마우스 비장 및 인간 말초 혈액 단핵 세포 (PBMC)로부터 단리 된 T 림프구 블라스 정량화 신속한 방법을 설명한다. 대부분의 경우 다양한 일반적으로 사용되는 증식 분석은 힘든 있습니다 만 인구 내에 전체 인구 효과보다는 개인 휴대 효과를 반영합니다. 대조적으로, 제시된 자동 세포 계수기 분석은 할 수 기포 직경의 급격한 다이렉트하고 정확한 측정을 제공한다다양한 분열 촉진 물질과 시험 관내에서 면역 조절 약물의 효과를 평가하기 위해 사용된다.
Introduction
T 림프구는 포유 동물에서 후천성 면역을 담당 일차 세포이다. 그들이 항원 제시 세포의 표면에서 MHC 분자 제시 펩티드 특정 항원에 반응하는 것으로 알려져있다. 동족의 T 세포 수용체 (TCR) 활성화되면, 셀은 프로세스 blastogenic 변환 또는 블라스 지칭로 확대한다. 자극 1 적용된 후이 프로세스는 제 ~ 6 시간의 검출이다. 블라스 동안 개별 T 세포의 부피가 증가 2- 2-6 4 배. 림프구 클론 확장이라 불리는 공정에서 증식하기 시작 목적은 가능한 한 항원 특이 TCR 담 세포의 많은 복제본을 생성하는 것이다. 자손 세포는 세포 독성 (CD8 +) 또는 헬퍼 (CD4 +) 이펙터 T 림프구로 분화하여 면역 기능을 발휘한다. 따라서, 인간 또는 마우스 혈액 나이브 T 림프구 세포의 G 0 (쉬고) 상에주기 및 지원 최소한의 신진 대사 활동. 항원 또는 분열 촉진 물질에 노출되면, T 세포는 전사 및 단백질 합성 7-10의 병용 자극으로 세포주기를 다시 입력. 예컨대 포르 볼 12- 미리 스테이트 13- 아세테이트 (PMA), 단백질 키나제 C (PKC) 및 칼슘 - 의존성 신호 전달 경로 (1)의 활성화를 통하여 림프구를 자극 이오 노마 이신과 같은 분열 촉진 물질. PMA / 이오 노마 이신으로 T 세포의 활성화에는 TCR 신호 전달 단계를 무시.
시험 관내 증식 분석 널리 림프구 기능, 자극에 반응을 평가하기 위해 사용된다. 대량 살상 무기 확산 수치는 일반적으로 1 ~ 3 일 T 세포 자극의 시작 후 촬영 세포의 수백 또는 수천의 집단 상태를 반영합니다. 다양한 분열 촉진 물질과 시험 관내에서 면역 조절 약물의 효능은 단순히 이들 화합물의 존재 하에서 증식 속도를 측정함으로써 평가 될 수있다. 이 (A)의 일부ssays과 제한은 아래에 설명되어 있습니다.
직접 세포 수를 카운트하는 절차 운영자 에러들의 높은 확률로, 시간 소모적이다.
DNA 합성의 3H 티미 딘 혼입 분석은 DNA 합성을 측정하지만, 주요 제약은 그것의 방사성이다. 비 방사성 대안 BrdU의이지만, 세포 성장을위한 선형 응답의 범위가 제한되고, 항체 처리 절차 (11, 12)에서의 단계의 수를 증가하는 요구된다.
신진 대사 활동, 테트라 졸륨 염 (MTT, MTS, XTT 및 WST-1) 레사 주린 염료 기반의 비색 분석은 세포 집단을 나누어의 일반적인 대사 상태를보고합니다. 그러나, MTT 따라서 측정에 오차를 통합 추가적인 세척 단계를 필요로 배양 배지에서 용해되지; XTT 효율적으로 줄일 수있는 추가 구성 요소를 필요로; MTS-, WST-1 및 레사 주린 기반의 측정에 영향을 줄 수 있습니다배양액의 pH와 그 구성 요소 혈청 알부민 또는 13 ~ 16 페놀 레드에 의해 에드. 이러한 분석은 생세포의 실제 수를 측정하는 것이 아니라 합성 효소 활성을 측정하지 않는다. 따라서, 확산 속도 때문에 정확하게 셀 수와 염료 환원 12,17 사이의 비 - 선형 관계의 대사 분석에 의해 결정될 수 없다.
ATP 농도를 측정하기 위하여, ATP에서 T 세포 활성화 유도 증가 증식과 상관 관계. 그러나 세포 내 ATP 상승은 T 세포 활성화의 초기 단계 중 하나이고; 여러 단계 뒤에 실제 확산 (17, 18)이다.
염료 희석 역가, CFSE 형광 염료가 공유 결합, 세포 내 단백질에 결합하여 세포 얼룩. 염료는 세포 분열 횟수를 추적 할 수있는 형광 강도의 증식 의존적 감소를 나타낸다. 이러한 그러나, 공유 결합 단백질 표지의 기능단백질은 손상 될 수있다. 염료는 높은 농도에서 세포 독성이있다. 낮은 염료 농도에서, 그러나, 초기 형광 강도를 추적 할 수있는 세포 분열 횟수를 감소, 감소된다. 또한, CFSE로 표지 한 후, 19, 20이 분석의 동적 범위를 제한하는 제 24 내지 48 시간의 기간 동안 초기 형광 확산 독립적 ~ 50 %의 손실이있다.
이러한 분석의 대부분은 세포의 다수의 집합 상태를 반영하고, 형광 염료 세포의 치료를 필요로한다. 그들은 화학 물질이나 항체로 염색하여 분석에서 제거되지 않는 괴사 및 세포 사멸 세포는 또한, 이러한 측정에 기여할 수 있습니다.
림프구 블라스에는 광학 현미경 등의 다양한 방법에 의해 평가 또는 4,21,22 유동 세포 계측법 수있다. 여기서, 우리는를 사용하여 T 세포의 크기를 측정하기위한 신속한 방법을 서술N 저장되고 나중에 다시 분석 할 수 실시간 셀 이미지를 수집하는 셀 카운터 자동화. 트립 판 블루 염색 배제에 의해 결정되는 크기를 측정하는 것 외에도, 본 장치는 정확한 세포 수 및 생존 세포의 백분율을 제공한다. 이 프로토콜에서 사용되는 장치가 시판하고, 제조자는 세 개의 다른 기기와 여러 농도 생존 조절을 사용하여 기기의 정밀도를 테스트 하였다. 이러한 연구 결과는 일반적으로 6 % 이하였다 분산 계수를 보였다. 프로토콜에 명시된 바와 같이,이 장치는 6 ㎛ 내지 8 ㎛의 직경의 폴리스티렌 비드 정기적으로 보정한다. 기포 지름에 기초하여 휴지 T 세포와 T의 lymphoblasts 구분할 세포 계수기를 사용하는 이점은 사용의 용이함 및 분석의 자동화 특성이다. 소프트웨어는 각각의 셀 주변에 원을 드로잉하여 기포 직경을 산출 할 수있다. 또한, IM나이는 세포를 식별하고 올바르게 주위에 원을 그릴 때 기기의 정확성을 확인할 수 있습니다 운영자에 볼 수 있습니다. 제한의 측면에서, 기기는 파편과 세포를 구분하지 자체 수 따라서,이 처리되는대로 오퍼레이터마다 화상을 보는 것이 중요하다. 분석에 사용 가능한 필드의 수를 감소 기포를 혼입하는 가능성이있다; 정기 플러싱 유지 행하는 경우에는,이 드물다.
본 연구에서는 비장 T 림프구 집단 이오 노마 이신 및 12-48 시간 동안 PMA 증가하는 농도로 자극 하였다. 2 NG / ㎖ 유도 강력한 blastogenic 응답 모두 상당한 확산 낮은 PMA 농도. 예컨대 면역 억제제 사이클로스포린 A (CSA), FK506 (타 크롤리 무스), 및 라파 마이신 (시 롤리 무스)뿐만 아니라, 이온 채널 차단제 전차-34 및 FTY720 여러 약물의 효과의 측정 (fingoli모드는) 블라스에 확산에보고 된 영향과 좋은 계약을 보여 주었다. 항 CD3, 항 CD28 항체 - 코팅 된 자성 비드와 PMA / 이오 노마 이신과 쥐 T 세포 자극에 인간 PBMC를 blastogenic의 응답도를 측정 하였다.
셀 카운터 분석법 블라스 동시에 그러나 별도로 증식률 (셀 밀도) 모두 정량화, 이들 효과의 조합을 보면 전술의 방법과 달리. 제시된 프로토콜은 세포 분열과 면역 조절제의 효능을 평가하기위한 신속하고 강력한 기술을 제공한다.
Protocol
모든 실험은 라이트 주립 대학 실험 동물 관리 및 사용위원회와 임상 시험 심사위원회의 승인을 프로토콜에 따라 수행된다.
주 : 인간 PBMC를 피콜는 밀도 구배 원심 분리 방법 (5)에 의해 분리된다.
1. 비장 수확
- 주택의 성인 종에 고유 한 음식, 물, 침구 요구 사항 표준 실험실 조건에서 여성 ICR 마우스.
주 : 동물은 2.9 개월, 평균 연령 안락사시에 30.4 g의 평균 중량을 가졌다. - 분리 (DOI)의 날짜에 개별적으로 존재하는 다른 conspecific 동물없이 동물을 안락사. 마우스에 최소한의 스트레스를 보장하기 위해 모든 노력을합니다. 사망을 위해 보조 경추 탈구 CO 2를 이용하여 안락사.
- 이산화탄소 챔버 역으로, 전송 케이지 안에 여전히 동물을 배치5L / 분의 가스 흐름을 실온. 이 유량은 분당 권장 10~30%에서 산소를 변위시킨다.
- 동물 의식 후 / 분으로 15 L에 CO 2 유량을 증가시킨다. 호흡의 중단을 위해 동물을 확인하고 추가로 2 분 동안 챔버에 둡니다.
- 죽음을 보장하기 위해주의 산만의 힘으로 자궁 경부 전위를 적용합니다.
- 죽음의 10 분 내에 무균 기술을 사용하여 동물에서 비장을 수확.
- 사용하기 전에 오븐을 오토 클레이브에서 비장을 제거하고 가위 집게 두 세트 소독. 70 % 에탄올을 적용하여 절개면을 소독.
- 마우스 복부에 70 % 에탄올을 적용합니다. 가위와 집게의 한 세트를 사용하여 한 떨어져 당겨 복막을 공개하는 피부를 다시 껍질, 복부의 왼쪽에서 털과 피부에 상처를합니다. 노출되면, 복막를 열기 전에 4 % 클로르헥시딘 솔루션을 적용 할 수 있습니다.
- SCI의 제 2 세트를 사용하여ssors와 집게는 중앙 복부를 따라 2 ~ 3 cm 컷을합니다. 복막을 열고 내장 첨부 파일과 여분의 지방을 멀리 절단하여 비장을 제거합니다. 둘 베코 인산염 완충 식염수 (DPBS)의 비장를 놓습니다.
원시 비장 2. 준비
참고 : 무균 기술을 사용하여 층류 바이오 안전성 캐비닛 아래의 모든 단계를 수행합니다.
- 표면 적혈구를 용해시키기 위해 10cm 배양 접시에 5 분 동안 탈 멸균 H 2 O 10 ml의 수확 된 비장을 담근다.
참고 : 비장을 분리하는 동안 손상된 경우이 단계는 생략 할 수 있습니다. - , 비장 세포를 분리 신선한 10cm 배양 접시 위에 (비장에 직면 프로스트 측)이 멸균 유리 슬라이드 사이의 비장을 분쇄합니다. 10 % 소 태아 혈청, 2 mM L- 글루타민, 50 IU / ㎖의 페니실린으로 보충 된 RPMI-1640 10 ㎖, 50 μg의 / ㎖ 스트렙토 마이신 (a 지칭 이하 섞어들) RPMI를 완료합니다.
- 결합 조직 및 파편을 제거하기 위해 새로운 10cm 배양 접시에 멸균 40 μm의 나일론 셀 스트레이너를 통해 세포를 필터링합니다.
- 를 Lyse 20 pH 7.4의 155 mM의 NH 4 CL, 10 mM의 NaHCO3을 0.1 mM의 EDTA로 이루어진 RBC 용해 완충액 ml의 ~ 300 mOsm / L을 첨가함으로써 잔류 적혈구.
참고 삼투압은 빙점 또는 증기압 삼투압에 의해 측정된다.- 10 분 (4 °에 C) 250 XG에 50 ML 원뿔 튜브와 원심 분리기에 10 cm 판에서 세포를 전송합니다.
- 상기 상등액을 제거 적혈구 용해 완충 용액 20 mL를 넣고 피펫 팅하여 세포 펠렛을 다시 일시.
- 부드럽게 흔들 10 분 동안 용해 완충액에서 실온에서 인큐베이션.
- 250 XG (4 °에 C)에서 10 분 동안 원심 분리기 세포 펠렛합니다. 용해 완충액을 붓는다.
- 다시 완전한 RPMI 원심 분리기의 10 ㎖ (250 XG, 10 분, 4 ° C)에서 세포를 다시 일시 중지합니다. 디스크뜨는 ARD.
- 완전한 RPMI 2 ㎖에 비장 세포를 다시 일시는 나일론 울 섬유 칼럼으로 이송하여 37 ° C로 가온.
T 림프구 3. 정제
- 전체 RPMI 5 ㎖로 두 번 나일론 울 열을 씻으십시오. 1 시간 동안 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 37 ℃에서 인큐베이션.
주 : 실험 기간 동안 습식 나일론 울을 유지하고 완전 RPMI 모두 나일론 울 분리 단계는 37 ° C로 가온 사용하는 것이 필수적이다. - 열 절연에 비장 세포를 추가하여 B 세포, 섬유 아세포, 및 액세서리 세포 나일론 울에 부착 할 수 있도록 한 시간 동안 배양한다.
- 컬럼에 비장 세포를 포함하는 RPMI 2 ㎖를 추가하고 나일론 울의 상단에 도달 할 때까지 통과.
- 나일론 울의 상단에 예열 37 ° C에 전체 RPMI 2 ㎖를 추가하고 양모를 통해 매체를 통과액면 상부면에 도달 할 때까지.
- 완전히 나일론 울 다루 컬럼에 따뜻한 완료 RPMI 3 ㎖를 추가합니다.
- 1 시간 동안 37 ° C, 5 % CO 2 세포 배양 인큐베이터에서 방해받지로드 열을 품어.
- 완전한 RPMI 5 ㎖로 두 번 칼럼을 세척하여 세포를 용출. 원심 분리하여 용출 된 세포의 추가 세척을 수행합니다.
- 전체 RPMI와 상위 2 배에 열을 채우고 열의 용액을 50 ml의 멸균 원뿔 튜브를 통해 흐르게 할 수 있습니다.
참고 : 탭 또는 나일론 울에 부착 된 B 세포, 액세서리 세포 및 섬유 아세포을 제거 할 수있는 열을 가하지 마십시오. - 세포 펠렛 10 분 (4 °에 C) 250 XG에 플로우를 통해 부분과 스핀를 수집합니다. 전체 RPMI 10 ㎖로 한 번 씻으십시오. (250 × g으로 10 분, 39 ° C)를 다시 세포 펠렛을 완전 RPMI 2 ㎖에 재현 탁.
- 는 C를 측정 엘 밀도 혈구를 사용하여 0.5 × 106 세포 / ml로 완전 RPMI에 희석.
- 시드 1을 각각 24 개, 6 웰 세포 배양 플레이트의 각 웰에 세포를 2 ㎖ 씩, 문화, 5 % CO 2, 37 ℃에서 세포.
주 : 1 mM의 1,4- 디티 오 트레이 톨 (DTT)의 T 세포의 생존을 향상시키기 위해이 단계에서 각 웰에 첨가 할 수있다. - 선택적 : 유동 세포 계측법에 의해 분리 프로토콜의 효율을 확인한다. 이 프로토콜은 일반적으로 23 ~ T 림프구는 80 %를 산출한다.
참고 : 나일론 울 정제 된 세포는 약 50 % CD4 + 23 %는 CD8 + 세포가 포함되어 있습니다. 상기 CD4 +와 CD8 + 개체군 정화 단일 면역 자기 붕괴 단계 8 개의 항체 및 자성 비드 (24)를 사용하여 수행 될 수있다. 이와 달리, 순수 CD4 + 및 CD8 + T 세포 집단이 특이 적 항체와 양성 또는 음성 선별에 의해 단리 될 수있다.
- 전체 RPMI와 상위 2 배에 열을 채우고 열의 용액을 50 ml의 멸균 원뿔 튜브를 통해 흐르게 할 수 있습니다.
- PMA의 추가를 통해 칼슘 염 또는 항 CD3 및 항 CD28 항체 23,25,26로 코팅 자석 구슬 이오 노마 이신 격리의 24 시간 내 T 림프구를 활성화합니다. 활성화시 실험 약물 (예를 들어 사이클로스포린, FK506, 라파 마이신, TRAM-34 및 FTY720) 추가한다.
참고 : 여기에, PMA 농도는 2 ~ 250 ng를 / ㎖에서 변화하고, 이오 노마 이신 농도는 250 nm에서 유지 하였다. 가능하면 세포의 각 웰에 첨가 볼륨 재현성을 보장 ≥1 μL가되도록, 희석 각 약물의 분취 스톡으로부터 제조한다. 1 비드에 세포 비율 : 항 CD3 / 안티 CD28 코팅 자석 구슬은 1에서 추가됩니다. (즉, 비드에 세포 비) 셀당 비드의 수를 늘리면 자극 (25, 26)의 강도를 증가시킬 것이다. 비드를 세척하고 세포에 첨가 전에 그들의 완전 RPMI에 재현 탁된다. 그 트리 판을 참고파란색 구슬을 얼룩. - 문화 자동 세포 계수기로 분석하기 전에 5 % CO 2와 37 ° C에서 12-72 시간 동안 세포.
5. 자동 셀 카운터 데이터 수집
- 샘플을 실행하기 전에 세포를 부드럽게 덩어리를 피하기 위해 혈청 학적 피펫과 혼합되어 있는지 확인합니다. 이 때문에 증가 된 접착 성 림프구 활성화에 특히 중요하다.
- 피펫 팅 한 후, 항 CD3 / CD28 비드 활성화 문화를 들면, 1.5 ㎖의 2 mL의 원심 분리 튜브에 시료를 옮긴다. 1 ~ 2 분 동안 자석에 튜브를 유지하여 구슬을 분리합니다. 분석을위한 세포를 포함하는 상층 액을 사용합니다.
참고 : 배양액에 존재하는 혈청에 의한 휴식 세포의 사전 정품 인증을 고려하여 1 시간 이내에 모두 휴식과 활성화 된 세포를 분석 할 수 있습니다. PMA 12 시간 후 / 이오 노마 이신 자극, 셀 크기의 작은 증가가 검출되었다 (도 2
- 피펫 팅 한 후, 항 CD3 / CD28 비드 활성화 문화를 들면, 1.5 ㎖의 2 mL의 원심 분리 튜브에 시료를 옮긴다. 1 ~ 2 분 동안 자석에 튜브를 유지하여 구슬을 분리합니다. 분석을위한 세포를 포함하는 상층 액을 사용합니다.
- 샘플 컵에 전송 세포 현탁액 1 ㎖를하고 설명서의 지침에 따라 자동 세포 계수기를 통해 실행합니다.
참고 : 시험의 각각에 대해, 세포 배양 1 ㎖ (2 ㎖의 최대)의 최소 사용되어야한다. 자동 세포 계수기는 세포 현탁액과 트리 판 블루를 혼합하는 주사기를 사용하여 묘화와 소프트웨어에 의해 분석하는 분야에 걸쳐 트리 판 블루 세포 혼합물을 전달한다. 이 소프트웨어는 트리 판 블루 염색 된 세포를 감지 각 셀 주위에 원을 그립니다, 그리고 직경을 결정한다. 이미지 (100)는 각 샘플로부터 수집하고, 세포 생존 및 크기가 결정된다. 여기에 사용 된 세포 계수기의 검출 임계치는 5 ㎛의 하한을 갖는다. - 각각의 전송 데이터가 추가 분석을 위해 스프레드 시트로 실행합니다.
- 1을 이용하여 정기적으로 보정 장치6 μm의 8 μm의 직경 폴리스티렌 비즈 ml의 샘플.
주 : 각 배치 제조업체에 의해 측정 된 실제 비드 크기를 표기하지 공칭 크기. 이러한 직경 휴지 예상 직경 활성화 T 세포에 근접하기 때문에도 6 및 8 ㎛의 비드 (도 1 참조)를 편리하다.
6. 데이터 및 통계 분석
- 적절한 통계적 그래프 소프트웨어를 사용하여 데이터를 분석한다.
참고 : (: 5 μm의 70 μm의 범위) 각 실행에 대한 스프레드 시트는 각각 직경 세포의 수를 포함합니다. 17 μm의 직경을 상기 세포는 먼지와 같은기구에 의해 생존 세포를 읽을 수있는 작은 기포를 배제하는 분석에서 제거된다. - 동일하지 않은 분산과 데이터 세트에 대한 웰치의 t-test를 이용하여 테스트 가설을 수행; 결과는 P <0.001 경우 통계적으로 유의 한 것으로 간주됩니다. 사용되는 식이었다,
어디에
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샘플 수단이, 
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샘플 차이가 있으며, 
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각 데이터 세트에 대한 샘플 크기입니다. 자유도의 수는 보수적 각각 비교를 위해 두 개의 샘플 크기가 작은을 이용하여 추정된다. 막대 그래프는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다.
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각 데이터 세트에 대한 샘플 크기입니다. 자유도의 수는 보수적 각각 비교를 위해 두 개의 샘플 크기가 작은을 이용하여 추정된다. 막대 그래프는 SEM ± 평균으로 표시하고 있습니다. 7. 비장 T 림프구 증식 분석
- MTS- 또는 MTT 기반 비색 플레이트 리더 증식 분석을 사용하여 T 세포 증식을 측정한다.
주 : 분석은 기본이다NADPH 또는 NADH에 의한 가능성이 MTS의 테트라 졸륨 화합물 (오웬의 시약) 가용성 포르 마잔 제품 감소에 d를 탈수소 효소에 의해 대사 활성 세포에서 생성. - 혈구 정제 T 세포 카운트를 1 × 106 세포 / ㎖의 최종 농도로 완전 RPMI-1640을 다시 일시.
주 : 1 mM의 DTT이 단계에서 세포에 첨가 할 수있다. - PMA와 함께 세포를 활성화하여 필요한 경우, 시험 약물 이오 노마 이신과 함께, (4 단계와 유사 함)을 부드럽게 혼합한다.
- 플레이트 (100)를 96- 웰 세포 배양 처리 된 플레이트의 각 웰에있는 세포의 μL 및 48 시간 동안 5 % CO 2, 37 ℃에서 배양한다. 배경 흡광도의 독서를 얻기 위해 한 우물에 세포없이 RPMI-1640 미디어 100 μl를 추가합니다.
- 각 웰에 MTS 기반 시약의 20 μl를 추가하고 4 시간 동안 5 % CO 2와 37 ° C에서 품어.
- 플레이트 판독기를 사용하여 490 nm에서 흡광도 측정을 수행. 다음은bsorbance 측정 각 웰에서 대사 적 활성 세포의 수에 대응한다.
참고 : 필요한 경우 배경의 수준을 뺍니다. 백그라운드 흡광도 값은 광 배양 배지, 혈청, 외부의 pH 및 MTS 시약 노광 기간의 타입에 의존한다. MTS 계 시약은 광 민감하고, 수 시간 동안 노광 높은 배경 흡광도 값을 초래할 수있다.
Representative Results
우리는 PMA하는 포르 볼 에스테르 및 이오 노마 이신, 칼슘 이온 운반체 자극시 림프구 폭발 형성과 비교하기 위해이 시험을 사용 하였다. 도 1a는 휴식의 직경 및 약리 활성 비장의 T 세포의 빈도 분포를 나타낸다. 1 ~ 2 일 PMA / 이오 노마 이신으로 세포의 치료 (예 참조 4 참조) 더 큰 직경으로 분포의 중앙값에 큰 변화의 결과. 작은 직경을 갖는 셀의 개수는 따라서 감소 하였다. 우리의 장치가 정확한 직경을보고 있는지 확인하기 위해, 우리는 6 μm의 폴리스티렌 구슬이 교정 8 μm의 직경 (재료 표 참조) 수행. 6 ㎛의 표준 중첩 8 μm의 표준 및 휴식 T 세포 중첩 활성화 T 세포로부터도 1b 및 1c에 표시 판독. 그림도 1d는 제조자에 의해보고 제어 비드 크기 자동화 된 세포 계수기 중앙값 직경에 대해 도시 나타낸다. 6㎛의 크기는 다소 5 ㎛의 하한을 갖는 장비의 측정 한계 아마도 우리의 측정에 과대 한 것으로 나타났다. 그러나, 셀 카운터 측정으로부터 계산 비드 직경의 표준 편차는 제조자에 의해보고 된 표준 편차와 일치 하였다. 우리는이 장치가 쉬고 분열 촉진 자극 된 마우스의 T 세포의 크기를 비교하기 위해 신뢰성있게 사용될 수 있으며, 장치가 정확하게 실제 기포 직경을 측정 할 수 있음이 실험의 결론.
그런 다음 PMA 농도의 평균 직경의 증가의 의존도를 검사하는 것을 계속하고 250 nm의 고정 이오 노마 이신 농도는 PMA 효과가 대폭 F 농도 상승에 의해 변경되지 않은 것으로 발견ROM (2) 내지 250 ng를 / ㎖ (도 2A). MTS에 기반 분석법을 이용하여, 우리는 (50)와 250 NG / ㎖ PMA에서 T 세포 증식을 측정하고 기포 직경 데이터와 계약 뚜렷한 차이 (도 2C)을 발견하지 못했다. 칼시 뉴린 억제제 약물 사이클로스포린 A (300 ㎚)과 FK506 (1 nm의)는 모두 블라스 (그림 2B) 및 증식 (그림 2C)를 억제. 억제하지만, 두 경우 모두 완료되지 않았다. PMA / 이오 노마 이신 또한 50 NG / ㎖ 및 250 NG / ㎖ PMA, 각각 (그림 2D)에 대한 직경 7.2 %와 6.8 % 증가했다 후 측정은 12 시간을 수행 하였다. 48 시간 자극 (그림 2A 비교)의 경우와 같이이 두 가지 농도의 크기 증가는 유의 한 차이가 없었다.
PMA / 이오 노마 이신 자극 48 시간 후 휴지 수집 기포 직경 데이터 및 활성화 된 T 세포에 요약
CSA, FK506, 라파 마이신, FTY720, 트램-34 : 우리는 또한 다른 면역 억제 것으로보고 화학 화합물을 시험했다. 도 3에서, 셀 크기 측정 쉬고 얻어진 활성화 된 T 세포의 부재 하에서 이러한 약물의 존재를 나타낸다. 활성화 된 T 세포 (NFAT)의 칼시 뉴린 27,28 의존성 핵 인자 타겟팅 사이클로스포린 및 FK506가 약 72 % (도 3a 및 3b)에 의해 blastogenic 반응을 억제하는 가장 강력 하였다. 흥미롭게도,와PMA 증가 농도의 CSA 및 FK506의 효능이 이들 약물 (도 2A 및 2B)의 부재에서 추가로 기포 지름 증가가 없었다하더라도 다소 떨어졌다. 라파 마이신, 라파 마이신 (mTOR의) 29, 30의 포유류 대상을 억제하는 면역 억제제는 온건하지만 통계적으로 유의 한 효과 (그림 3A, 3B 및 3C)를했다. FTY720 순환 림프구 (31)에 출구를 억제하여 최근 TRPM7 높은 32 T 림프구에서 발현 양이온 채널을 저해하는 것으로 확인되었다 스핑 고신 -1- 포스페이트 수용체 아고 니스트이다. FTY720 및 라파 마이신 모두 약 34 % 직경의 52 % 증가의 평균치를 감소 블라스에 필적하는 효과가 있었다 (도 3a 및도 3b). TRAM-34은 칼슘 - 활성화 된 칼륨 채널 KCa3.1 (33)의 차단기이다. 700 nm에서의 테스트, TRAM-34은 내가, 쥐의 T 세포에서 효과가 있었다n은 최근 인간 T 세포 증식 연구에 따라; 그 효력은 자극에 분열 (34) (도 3A 및 3B)의 특성 및 강도에 의존 할 수있다. 700 나노 TRAM-34 우리 패치 클램프 전기 생리학 실험 KCa3.1 채널을 차단하는데 효과적이었다 (데이터는 보이지 않음). 이 비교는 48 시간에서 동일한 실험에서 여러 시험에서 휴식과 약물에 노출 된 세포 사이에 만들어졌다. 라파 마이신과 CSA가 함께 사용했을 때, 블라스 (그림 3C) 완전히 억제했다.
72 시간 동안 항 -CD3 / 항 - CD28 - 코팅 된 자성 비드와 쥐 T 세포의 활성화는 사이클로스포린의 존재 (도 3D)에서 5 %로 감소 된 평균 직경의 27 % 증가를 일으켰다. (48 시간 동안 PMA / 이오 노마 이신 활성화시 인간의 단핵 세포를 33 % 직경의 증가, 및 사이클로스포린의 존재 하에서 활성화가 23 %에 대한 응답을 저하 = "1"> 페이지 내에서 표 1 : 평균 기포 직경 및 비 표면적에 비해 증가 요약. 측정은 250 NG / ㎖ PMA 250 나노 미터 이오 노마 이신과 활성화 후 48 시간을 실시 하였다. 
도 1 : 뮤린 비장 T 세포 입경 빈도 분포. (A) 블랙 열은 휴식을 나타내며 빨간색 열은 PMA / 이오 노마 이신 활성화 (48 시간) 세포를 나타냅니다. 8 ㎛의 입경의 표준 용액에 중첩 활성화 비장 T 세포 (B) 분포. (C)을 6 ㎛의 보정 표준에 중첩 T 세포 휴식의 분포. 사용 된 세포 및 비드의 숫자 상자에 표시된다. 세포 카운터에 의해 측정 (D) 중앙 직경은 제조자에 의해보고 된 비드 직경에 대해 도시. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
도 2 : PMA 농도에 쥐 T 세포 활성화의 의존. (A) T 세포의 고정 농도 이오 노마 이신 (250 ㎚)에서의 치료 또는 제 2 (50)으로 처리하고, 250 NG / ㎖ PMA 하나의 평균 직경. 휴식의 (B) 세포 계수기 측정 및 부재하에 활성화 (2, 50, 250 NG / ㎖ PMA) T 세포를 300 nM의 단면적 또는 1 nM의 FK506의 존재. 250 나노 미터가 없을 이오 노마 이신, 300 nm의 단면적의 존재와 (C) MTS 확산 50 250 NG에서 분석 / ㎖ PMA. 유의 한 차이 (p <0.001)는 별표로 표시됩니다. N은 시험의 총 개수이다. 데이터는 3 쥐에서 분리 된 세포이다. (D) 쉬고 기포 직경 및 활성화 된 T 세포 (250 NG / PMA 및 이오 노마 이신 250 나노 ㎖) 부재와 300nm의 단면적의 존재하에 활성화 후 12 시간. PLOAD / 55212 / 55212fig2large.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 3 : 사이클로스포린의 효과, FK506, FTY720, 라파 마이신, 및 셀 크기에 TRAM-34. (A 및 C) 부재와 약물의 존재 쉬고 PMA / 이오 노마 이신 - 활성화 된 쥐 T 세포의 평균 직경. 농도는 상자에 표시됩니다. A로부터 (B) 데이터는 휴식 T 세포의 직경에 걸쳐 % 증가로 표시됩니다. 림프구 활성화는 250 NG / ㎖ PMA와 이오 노마 이신 (250) 나노 수행하고, 측정은 48 시간 후 수행 하였다. (D) 쉬고 항 CD3 세포의 카운터 측정 / CD28 활성화 된 T 세포의 부재 및 300nm의 단면적의 존재하에 활성화 후 72 시간.rge.jpg "대상 ="_ 빈 ">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 
그림 4 : 미토 겐의 자극에 따라 인간 PBMC를에서 블라스. (A) 블랙 열은 휴식을 나타내며 빨간색 열이 활성화 PBMC를 나타냅니다. (B) 휴식의 평균 직경과 부재의 활성화 PBMC를 300 nm의 단면적의 존재. 세포를 250 NG / ㎖ PMA 및 250 나노 이오 노마 이신으로 활성화하고,이 측정 활성의 48 시간 후 수행 하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오. 컬럼 1 휴식 활성화 CsA를 100 nm의 CsA를 200 nm의 평균 직경 6.94 μm의 9.78 μm의 8.19 μm의 7.92 μm의 직경 평균 증가 40.92 % 17.88 % 14.09 % 평균 노출 영역 151.37 μm² 300.61 μm² 210.56 μm² 197.22 μm² 표면 지역에서의 평균 증가 98.59 % 39.00 % 30.16 %
Discussion
여기서는 자동 세포 계수기를 사용하여 T 세포 blastogenic 변화의 신속한 검출 및 정량하기위한 기술을 설명한다. 우리의 조건 (250 NG / ㎖ PMA 및 이오 노마 이신 자극 250 ㎚)에서, 셀 면적이 두 배 및 활성화의 48 시간 후의 부피 3 배 증가 하였다. 분석은 세포 부피 (도 2D)를 휴식에 비해 1.25 배 증가 된 활성의 처음 12 시간 동안 블라스팅을 검출하기에 충분히 민감하다. 항 CD3, 항 CD28 항체 - 코팅 된 자성 비드를 이용하여 T 세포 활성화의보다 생리 관련 메커니즘은 부피 평균 2.3 배 증가 (활성화 후 72 시간도 3D)와 상당한 blastogenic 반응을 일으켰다. 인간 단핵 세포는 48 시간 (그림 4)에 대한 PMA에 따라 볼륨의 2.6 배 변경 / 자극 이오 노마 이신을 보였다. ICR 마우스 비장의 T 세포 평균 직경과 부피로 측정 하였다각각 6.9 μm의 1.9 × 10 -4에서 nl. 인간 PBMC를는 (하나의 건강한 기증자로부터), 7.7 ㎛의 평균 직경은 2.7 × 10 -4 NL 평균 부피를 가졌다. 이 프로토콜을 이용하여, 우리는 또한 T 세포를 활성화하는 그들의 능력에 대하여 PMA의 농도를 증가시키는 시험. 이 단일 셀과 유사한 결과를 PMA 농도에서 수행 증식 분석법과 일치 하였다.
세포 증식에 영향을 미치는 것으로보고 된 여러 화합물 시험 하였다 : FTY720 31, 32; 면역 억제제 사이클로스포린 A, FK506 및 27, 28를 라파 마이신; 트램-34, 칼슘 활성화 KCa3.1 채널 33, 35의 차단. 우리는 시험 농도에서, 블라스의 가장 강력한 억제제 사이클로스포린과 FK506 있었다 것으로 나타났습니다. 라파 마이신은 블라스에 작지만 통계적으로 유의 한 억제 효과가 있었다. TRAM-34 한편, 블라스 영향을주지 않았다.
사이클로스포린은 모두 블라스 및 P를 억제roliferation는 완전하지는 않지만 (도 2B 및 2C)가 그 자동 세포 계수기 측정을 설명하면 T 세포 증식 약물 효율 좋은 상관 관계이다. 사이클로스포린과 함께 라파 마이신의 존재하에 블라스 조합 NFAT-와 mTOR의 매개 경로가 완전히 PMA / 이오 노마 이신 (도 3c)과 분열 촉진 자극에 T 세포 확대 설명 할 수 있음을 시사 완전히 억제되었다.
좀 증식 분석의 동적 범위 (도 2 참조)에 한정된다. 이러한 우리가 사용했던 하나 (그림 2C), 세포 사멸 및 괴사 세포의 기여를 포함하는 신호를 보고서로 확산 분석. 측정은 생존 세포에만 속하는 자동 직경 변화 측정은, 그 제한이 없다. 세포 생존율은 건강, 생존 세포에서 트리 판 블루 염색의 배제에 의해 평가된다. 크기 측정에서, 앞으로 사용이중 셀 차별 유동 세포 계측법 빛 산란은 22 문제가 될 수 있습니다. 자동 셀 카운터 측정에서 더 이중 인구는 (그림 1) 찾을 수 없습니다. 또한, 측정은 100 내지 200nm의 사이클로스포린 (표 1)과 분열 촉진 자극 12 시간 (도 2D) 내에 블라스 검출하기의 효과를 구별하기에 충분히 정확한이었다.
이 새로운 분석은 샘플의 작은 숫자에 특히 유용합니다. 최대 15 개의 시료를 1 시간에 측정 할 수있다. 그러나, 분석은 완화 될 수 대부분의 한계가있다. 효과적으로 기포 직경의 작은 (<1 ㎛)의 차이를 확인할 수 있지만, 우리가 사용하는 기종 5 ㎛의 낮은 검출 한계를 가진다. 효과적으로 작은 직경 모든 셀을 제외하기 때문에이 제한은, 매우 작은 셀 크기의 과대 평가 될 수 있습니다. 그러나, 셀 카운터의 새로운 모델은 검출 임계점을이 문제를 완화해야 ~ 2 μm의의 세. 너무 많은 이물질 샘플에 존재하는 경우, 기계는 그들을 같은 생존 세포를 취급한다. 또한, 기포가 때때로 플로우 셀에 들어가서 기기의 촬상 화상의 세포 변형을 일으킬 수있다. 왜곡 가능성 판정에 영향을 미치지 않는 것으로 보이지만, 측정 된 직경에 영향을 미칠 수있다. 따라서, 각 시험의 데이터 분석을 위해 허용되기 전에 모든 이미지는 기포의 실험에 의해 확인하는 것이 좋습니다. 소프트웨어 셀만 주위 원 무 때문에 비구면 셀 직경 비구면 세포 분석 덜 적합하다 장축 방향으로 비스듬 할 수있다.
이 분석은 몇 시간을 필요로 증식 분석, 비교, 샘플 당 약 4 분 복용, 빠른이다. 데이터 수집 장치와 함께 제공되는 소프트웨어를 사용하여도 오히려 간단하다. 이 소프트웨어는 SP로 측정 데이터를 내보낼 수 있습니다분석을 위해 readsheet. 인구 측정 달리 마지막으로, 하나의 셀은이고; 블라스 증식 모두 측정; 그리고 동시에 가능한 죽은 세포를 구분합니다. 이는 면역 반응을 탑재 할 수있는 능력에 대한 다양한 변형 마우스를 평가하는데 사용될 수있다. 상기 분석은 인간 기증자 (도 4)에서 T 세포 블라스의 측정을 성공적으로 사용될 수 있으며, 또한 다른 유형의 세포에 사용될 수있다.
세포 부피 증가가 대사의 조절에 기여하는 것으로 알려져있다 : 세포 부종은 간세포 (36, 37)에서 글루타민에 의한 글리코겐 합성 및 지방 생성을 자극한다. 화성 에이전트가 38-40 붓기 10-15%을 유도하면서 호중구는 35~60%의 마이그레이션 관련 볼륨 증가를 표시합니다. 현재의 분석은 잠재적으로 이러한 공정을 연구 할 수있다.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
| 40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
| nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
| 50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
| 6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
| 96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
| Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
| CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
| Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
| FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
| Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
| TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
| FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
| Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
| Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
| Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
| Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100x stock |
| Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10x stock |
| 1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
| 8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
| 6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
| Single magnetic separation stand for 1.5 - 2 ml tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
| Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
| Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
| Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |
References
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