T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
जवाब में लिम्फोसाइट प्रसार प्रतिजनी करने के लिए या mitogenic उत्तेजना एक आसानी से मात्रात्मक घटना परीक्षण इम्यूनोमॉड्यूलेटरी (यानी, प्रतिरक्षा को दबाने या immunostimulatory) रासायनिक यौगिकों और बायोलॉजिक्स के लिए उपयोगी है। mitogenesis के दौरान जल्द से जल्द कदम से एक सेल वृद्धि या blastogenic परिवर्तन, विभाजन से पहले सेल की मात्रा बढ़ जाती है जिस है। यह आमतौर पर टी लिम्फोसाइट उत्तेजना के पहले कई घंटों में detectable है। यहाँ, हम माउस spleens और मानव परिधीय रक्त कोशिकाओं mononuclear (PBMCs) से अलग टी lymphocytes में blastogenesis यों के लिए एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग कर एक तेजी से विधि का वर्णन है। अधिकांश भाग के लिए विभिन्न आमतौर पर इस्तेमाल प्रसार assays श्रमसाध्य हैं और केवल एक आबादी के भीतर कुल जनसंख्या प्रभाव के बजाय व्यक्तिगत सेलुलर प्रभाव दर्शाते हैं। इसके विपरीत, प्रस्तुत स्वचालित सेल काउंटर परख सेल व्यास है कि हो सकता है की, तेजी से प्रत्यक्ष, और सटीक मापन प्रदान करता हैविभिन्न mitogens और इन विट्रो में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं के प्रभाव का आकलन करने के लिए इस्तेमाल किया।
टी lymphocytes स्तनधारियों में अनुकूली प्रतिरक्षा के लिए जिम्मेदार प्राथमिक कोशिकाओं रहे हैं। यह ज्ञात है कि वे प्रतिजन पेश कोशिकाओं की सतह पर MHC अणुओं द्वारा प्रस्तुत विशिष्ट प्रतिजनी पेप्टाइड का जवाब। एक आत्मीय टी सेल रिसेप्टर (TCR) के सक्रियण पर, सेल मायनों में इजाफा करने में एक प्रक्रिया blastogenic परिवर्तन, या blastogenesis करार दिया। बाद प्रोत्साहन 1 लागू किया जाता है इस प्रक्रिया को पहली ~ 6 घंटे में detectable है। Blastogenesis के दौरान अलग-अलग टी कोशिकाओं की मात्रा को बढ़ाने के लिए 2- 4 गुना 2-6। लिम्फोसाइटों एक प्रक्रिया क्लोनल विस्तार बुलाया में पैदा करने के लिए शुरू, जिस उद्देश्य के लिए संभव के रूप में विशिष्ट प्रतिजन TCR असर कोशिकाओं के रूप में कई क्लोन पैदा करने के लिए है। संतान कोशिकाओं तो साइटोटोक्सिक (सीडी 8 +) या सहायक (CD4 +) प्रेरक टी lymphocytes में फर्क द्वारा उनकी immunologic समारोह डालती है। इस प्रकार, मानव या माउस रक्त में भोले टी lymphocytes सेल के जी 0 (आराम) चरण में हैंचक्र और समर्थन के लिए कम से कम चयापचय क्रिया। एंटीजन या mitogens के लिए जोखिम पर, टी कोशिकाओं प्रतिलेखन और प्रोटीन संश्लेषण 7-10 के एक सहवर्ती उत्तेजना के साथ, कोशिका चक्र फिर से दर्ज। ऐसे phorbol 12 myristate 13-एसीटेट (पीएमए) और ionomycin प्रोटीन काइनेज सी (पीकेसी) और सीए 2 निर्भर संकेत दे रास्ते 1 के सक्रियण के माध्यम लिम्फोसाइट को प्रोत्साहित के रूप में mitogens। पीएमए / ionomycin के साथ टी कोशिकाओं की सक्रियता TCR संकेत कदम नजरअंदाज।
इन विट्रो प्रसार में assays व्यापक रूप से लिम्फोसाइट समारोह और उत्तेजनाओं के जवाब के मूल्यांकन के प्रयोजन के लिए उपयोग किया जाता है। प्रसार रीडिंग आम तौर पर एक से तीन दिन टी सेल उत्तेजना की शुरुआत के बाद लिया गया है और सैकड़ों या कोशिकाओं के हजारों की सामूहिक स्थिति को प्रतिबिंबित कर रहे हैं। विभिन्न mitogens और इन विट्रो में इम्यूनोमॉड्यूलेटरी दवाओं की शक्ति बस इन यौगिकों की उपस्थिति में प्रसार दर को मापने के द्वारा मूल्यांकन किया जा सकता है। इनमें से एक में से कुछssays और अपनी सीमाओं से नीचे चर्चा कर रहे हैं।
प्रत्यक्ष सेल संख्या की गणना के लिए, प्रक्रिया ऑपरेटर त्रुटियों की एक उच्च संभावना के साथ, समय लगता है।
डीएनए संश्लेषण के लिए, 3H-thymidine निगमन परख डीएनए संश्लेषण के उपाय है, लेकिन इसकी प्रमुख सीमा अपने radiotoxicity है। एक गैर रेडियोधर्मी विकल्प BrdU है, लेकिन सेल के विकास के लिए रेखीय प्रतिक्रिया की सीमा सीमित है, और एंटीबॉडी उपचार की आवश्यकता है, जो प्रक्रिया 11,12 में कदम की संख्या बढ़ जाती है।
चयापचय क्रिया, tetrazolium लवण (MTT, एमटीएस, XTT, और WST-1) और resazurin के लिए डाई आधारित वर्णमिति assays सेल आबादी को विभाजित करने की सामान्य चयापचय राज्य की रिपोर्ट। हालांकि, MTT नहीं संस्कृति के माध्यम में घुलनशील, अतिरिक्त धोने कदम की आवश्यकता होती है, इस प्रकार की माप में त्रुटियों को शामिल है; XTT कुशलता से कम करने के लिए अतिरिक्त घटकों की जरूरत है; MTS-, WST-1-, और resazurin आधारित माप प्रभावित कर रहे हैंसंस्कृति के माध्यम से पीएच और उसके घटकों सीरम, एल्बुमिन या फिनोल लाल 13-16 से एड। ये assays व्यवहार्य कोशिकाओं की वास्तविक संख्या को मापने के लिए नहीं है बल्कि संयुक्त एंजाइम गतिविधियों का अनुमान है। इसलिए, प्रसार दर सही सेल नंबर और डाई कमी 12,17 के बीच गैर रैखिक संबंध की वजह से चयापचय assays के द्वारा निर्धारित नहीं किया जा सकता है।
एटीपी एकाग्रता को मापने के लिए, एटीपी में टी सेल सक्रियण प्रेरित बढ़ जाती प्रसार के साथ सहसंबंधी। हालांकि, intracellular एटीपी की ऊंचाई टी सेल सक्रियण के प्रारंभिक चरणों में से एक है; कई कदम पीछे वास्तविक प्रसार 17,18 है।
डाई कमजोर पड़ने परख के लिए, CFSE फ्लोरोसेंट डाई covalently intracellular प्रोटीन के बंधन से कोशिकाओं दाग। डाई फ्लोरोसेंट तीव्रता में एक प्रसार पर निर्भर कमी है, जो कोशिका विभाजन की संख्या को ट्रैक कर सकते हैं पता चलता है। हालांकि, क्योंकि सहसंयोजक प्रोटीन लेबलिंग की, इन के कार्योंप्रोटीन से समझौता किया जा सकता है। डाई उच्च सांद्रता में कोशिकाओं को विषैला होता है। कम डाई सांद्रता में, हालांकि, प्रारंभिक प्रतिदीप्ति तीव्रता कम हो जाता है, कोशिका विभाजन की संख्या लगाया जा सकता है कम। इसके अतिरिक्त, CFSE के साथ लेबलिंग के बाद, वहाँ पहले 24 से 48 घंटा अवधि है, जो इस परख 19,20 के गतिशील रेंज की सीमा के दौरान प्रारंभिक प्रतिदीप्ति के प्रसार-स्वतंत्र ~ 50% नुकसान हुआ है।
इन परीक्षणों की सबसे कोशिकाओं की बड़ी संख्या के सामूहिक स्थिति को प्रतिबिंबित और फ्लोरोसेंट रंगों के साथ कोशिकाओं के इलाज की आवश्यकता होती है। परिगलित और apoptotic कोशिकाओं को भी जब तक वे रसायन या एंटीबॉडी के साथ धुंधला द्वारा विश्लेषण से हटा रहे हैं, इन मापों के लिए योगदान कर सकता है।
लिम्फोसाइट blastogenesis जैसे ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी के रूप में तरीकों की एक किस्म के द्वारा मूल्यांकन या 4,21,22 प्रवाह cytometry जा सकता है। यहाँ, हम एक का उपयोग कर टी सेल आकार के माप के लिए एक तेजी से विधि का वर्णनn सेल काउंटर, जो कि जमा हो जाती है और बाद में फिर से विश्लेषण किया जा सकता वास्तविक समय सेल छवियों को इकट्ठा स्वचालित। आकार माप के अलावा, इस उपकरण के रूप में trypan नीले दाग बहिष्कार द्वारा निर्धारित, सटीक सेल नंबर और व्यवहार्य कोशिकाओं का प्रतिशत प्रदान करता है। इस प्रोटोकॉल में प्रयुक्त उपकरण व्यावसायिक रूप से उपलब्ध है, और निर्माता तीन विभिन्न उपकरणों और कई एकाग्रता और व्यवहार्यता नियंत्रण का उपयोग कर साधन की परिशुद्धता परीक्षण किया। इन अध्ययनों के परिणामों विचरण का एक गुणांक है कि आम तौर पर 6% से नीचे था प्रदर्शन किया। प्रोटोकॉल में उल्लेख किया, डिवाइस 6 माइक्रोन और 8 मीटर व्यास polystyrene मोतियों के साथ एक नियमित आधार पर calibrated है। आराम टी कोशिकाओं और टी lymphoblasts सेल व्यास के आधार पर के बीच अंतर करने के लिए एक सेल काउंटर का उपयोग करने के फायदे उपयोग की आसानी और विश्लेषण के स्वचालित स्वभाव है। सॉफ्टवेयर प्रत्येक कोशिका के चारों ओर एक वृत्त चित्र और सेल व्यास की गणना करने में सक्षम है। इसके अतिरिक्त, आईएमउम्र के ऑपरेटर, जो कोशिकाओं की पहचान करने और उन्हें सही ढंग से चारों ओर एक वृत्त चित्र में साधन की सटीकता की पुष्टि कर सकते हैं करने के लिए दिखाई दे रहे हैं। सीमाओं के संदर्भ में, साधन मलबे और कोशिकाओं के बीच अंतर नहीं प्रतिशत से कर सकते हैं; इसलिए, यह महत्वपूर्ण है कि ऑपरेटर हर छवि विचारों के रूप में यह कार्रवाई की जा रही है। वहाँ हवा के बुलबुले, जो विश्लेषण के लिए प्रयोग करने योग्य क्षेत्रों की संख्या में कमी होगी शामिल करने के लिए एक संभावित है; हालांकि, इस दुर्लभ यदि नियमित निस्तब्धता रखरखाव किया जाता है।
इस अध्ययन में, प्लीहा टी लिम्फोसाइटों के समूहों ionomycin और 12-48 घंटे के लिए बढ़ रही है पीएमए की सांद्रता के साथ प्रेरित किया गया। पीएमए सांद्रता 2 एनजी / एमएल प्रेरित दोनों एक मजबूत blastogenic प्रतिक्रिया और महत्वपूर्ण प्रसार के रूप में के रूप में कम। ऐसे immunosuppressants Cyclosporine ए (सीएसए), FK506 (tacrolimus), और rapamycin (सिरोलिमस), साथ ही आयन चैनल ब्लॉकर्स ट्राम 34 और FTY720 के रूप में कई दवाओं के प्रभाव का माप (fingoliरक्षा मंत्रालय), blastogenesis पर प्रसार पर सूचना प्रभाव के साथ अच्छे समझौते का प्रदर्शन किया। विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों के साथ पीएमए / ionomycin और murine टी सेल उत्तेजना के लिए मानव PBMCs के blastogenic प्रतिक्रिया भी मापा गया।
सेल काउंटर परख दोनों blastogenesis और प्रसार दर (सेल घनत्व) एक साथ लेकिन अलग से quantifies, उपरोक्त विधियों, जो इन प्रभावों का एक संयोजन को देखने के विपरीत है। प्रस्तुत प्रोटोकॉल mitogenic और इम्यूनोमॉड्यूलेटरी एजेंटों की शक्ति के मूल्यांकन के लिए एक तेजी से और मजबूत तकनीक प्रदान करता है।
यहाँ, हम तेजी से पता लगाने और टी-सेल blastogenic परिवर्तन की मात्रा का ठहराव के लिए एक तकनीक एक स्वचालित सेल काउंटर का उपयोग का वर्णन है। हमारी शर्तों (250 एनजी / एमएल पीएमए और 250 एनएम उत्तेजना ionomycin) के तहत, कोशिका की सतह क्षेत्र की दो गुना और सक्रियण के 48 घंटे के बाद मात्रा तीन गुना वृद्धि की गई थी। परख पर्याप्त सक्रियण के पहले 12 घंटा, जहां सेल की मात्रा आराम कर (चित्रा 2 डी) की तुलना में केवल 1.25 गुना वृद्धि हुई दौरान नष्ट पता लगाने के लिए संवेदनशील है। विरोधी CD3 और विरोधी CD28 एंटीबॉडी लेपित चुंबकीय मोतियों का उपयोग टी सेल सक्रियण के एक अधिक physiologically प्रासंगिक तंत्र एक महत्वपूर्ण blastogenic प्रतिक्रिया, मात्रा में औसतन 2.3 गुना वृद्धि (सक्रियता के बाद 72 घंटा, चित्रा 3 डी) के साथ उत्पादन किया। मानव कोशिकाओं mononuclear 48 घंटा (चित्रा 4) के लिए पीएमए पर मात्रा में 2.6 गुना परिवर्तन / उत्तेजना ionomycin दिखाया। आईसीआर माउस प्लीहा टी सेल औसत व्यास और मात्रा होने के लिए निर्धारित किया गया है6.9 माइक्रोन और 1.9 x 10 -4 NL, क्रमशः। मानव PBMCs (एक स्वस्थ दाता से) 7.7 माइक्रोन के एक औसत व्यास और 2.7 x 10 -4 nl के एक औसत मात्रा था। इस प्रोटोकॉल का उपयोग करना, हम भी टी कोशिकाओं को सक्रिय करने की क्षमता के लिए पीएमए की सांद्रता में वृद्धि का परीक्षण किया। ये एकल कोशिका परिणाम समान पीएमए सांद्रता पर प्रदर्शन प्रसार assays के साथ संगत कर रहे थे।
सेल प्रसार को प्रभावित करने के लिए सूचित कई यौगिकों का परीक्षण किया गया: FTY720 31,32; immunosuppressants Cyclosporine ए, FK506, और 27,28 rapamycin; और ट्राम-34, कैल्शियम सक्रिय KCa3.1 चैनलों 33,35 के एक अवरोधक। हमने पाया है कि परीक्षण किया सांद्रता में, blastogenesis के सबसे शक्तिशाली अवरोधकों सीएसए और FK506 थे। Rapamycin blastogenesis पर एक छोटी लेकिन महत्वपूर्ण सांख्यिकीय दमनकारी प्रभाव नहीं पड़ा। ट्राम 34, दूसरे हाथ पर, blastogenesis प्रभावित नहीं किया।
सीएसए दोनों blastogenesis और पी दबा दियाroliferation, लेकिन पूरी तरह से नहीं (चित्रा 2 बी और 2 सी), प्रदर्शन है कि स्वचालित सेल काउंटर माप टी सेल प्रसार में दवा क्षमता का अच्छा सहसंबंधी है। एक साथ सीएसए के साथ rapamycin की उपस्थिति में, blastogenesis पूरी तरह से हिचकते था, सुझाव है कि संयोजन में NFAT- और mTOR की मध्यस्थता रास्ते पूरी तरह से पीएमए / ionomycin (चित्रा 3 सी) के साथ mitogenic उत्तेजना पर टी सेल वृद्धि के लिए खाते सकता है।
कुछ प्रसार assays के गतिशील रेंज सीमित है (देखें चित्र 2)। ऐसा ही एक हम इस्तेमाल किया है (चित्रा 2 सी), एक संकेत है कि apoptotic और परिगलित कोशिकाओं से योगदान भी शामिल है रिपोर्ट के रूप में प्रसार assays। के रूप में माप केवल व्यवहार्य कोशिकाओं से संबंधित स्वचालित व्यास परिवर्तन माप है कि सीमा नहीं है। सेल व्यवहार्यता स्वस्थ, व्यवहार्य कोशिकाओं से trypan नीले रंग के दाग के बहिष्कार से मूल्यांकन किया है। आकार माप में, आगे का उपयोग करनक़ल सेल भेदभाव प्रवाह cytometry में प्रकाश तितर बितर समस्याग्रस्त 22 हो सकती है। स्वचालित सेल काउंटर माप में, कोई नक़ल आबादी (चित्रा 1) मिला था। इसके अलावा, माप पर्याप्त रूप से 100 और 200 एनएम Cyclosporine (1 टेबल) और mitogenic उत्तेजना के 12 घंटा (चित्रा 2 डी) के भीतर blastogenesis का पता लगाने के प्रभाव के बीच भेद करने के लिए सटीक था।
इस नए परख नमूनों की कम संख्या के लिए विशेष रूप से उपयोगी है। अप करने के लिए 15 नमूने 1 घंटे में मापा जा सकता है। हालांकि, परख की अपनी सीमाएं हैं, जिनमें से अधिकांश कम किया जा सकता है। हालांकि इसे प्रभावी ढंग से सेल व्यास में छोटे (<1 माइक्रोन) के अंतर को हल कर सकते हैं, मशीन मॉडल हम इस्तेमाल 5 माइक्रोन की एक कम का पता लगाने सीमा है। इस सीमा, बहुत छोटे सेल आकार की overestimation पैदा कर सकता है, क्योंकि यह प्रभावी रूप से छोटे व्यास के साथ सभी कोशिकाओं को शामिल नहीं है। हालांकि, सेल काउंटर के नए मॉडल का पता लगाने ताड़ना है~ 2 माइक्रोन के बच्चों, जो इस समस्या को कम करना चाहिए। अगर वहाँ नमूने में बहुत ज्यादा मलबे है, साधन के रूप में उन्हें व्यवहार्य कोशिकाओं को मानते हैं। इसके अतिरिक्त, हवा के बुलबुले कभी कभी प्रवाह सेल में मिलता है और मशीन द्वारा कब्जा कर लिया सेल छवियों की विकृति पैदा कर सकता है। विरूपण व्यवहार्यता निर्धारण को प्रभावित करने के लिए प्रकट नहीं होता है, लेकिन यह मापा व्यास को प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, यह सिफारिश की है कि सभी छवियों हवा के बुलबुले के लिए प्रयोगकर्ता द्वारा जाँच की जा प्रत्येक परीक्षण से डेटा के विश्लेषण के लिए स्वीकार कर रहे हैं पहले। चूंकि यह सॉफ्टवेयर केवल कोशिकाओं के आसपास हलकों आ रही है, गैर गोलाकार कोशिकाओं के व्यास लंबे अक्ष की दिशा में टेढ़ी हो सकता है, गैर गोलाकार कोशिकाओं के लिए परख कम उपयुक्त बना रही है।
इस परख प्रसार assays, जो कुछ ही घंटे की आवश्यकता की तुलना में जल्दी है, नमूना के अनुसार लगभग 4 मिनट ले रही है। डेटा संग्रह भी सॉफ्टवेयर डिवाइस के साथ शामिल का उपयोग कर के बजाय सरल है। सॉफ्टवेयर एक सपा को माप डेटा निर्यात कर सकते हैंविश्लेषण के लिए readsheet। अंत में, यह एक एकल कोशिका, के रूप में आबादी, माप करने का विरोध किया है; दोनों blastogenesis और प्रसार मापा जाता है; और इसके साथ ही व्यवहार्य और मृत कोशिकाओं के बीच अलग। यह एक प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया माउंट करने के लिए उनकी क्षमता के लिए विभिन्न माउस उपभेदों का मूल्यांकन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। परख भी मानव दाताओं (चित्रा 4) से टी कोशिकाओं में blastogenesis की माप के लिए सफलतापूर्वक इस्तेमाल किया जा सकता है, और यह भी अन्य प्रकार की कोशिकाओं में इस्तेमाल किया जा सकता है।
सेल की मात्रा बढ़ जाती है चयापचय के नियमन में योगदान करने के लिए जाना जाता है: सेल सूजन glutamine प्रेरित ग्लाइकोजन संश्लेषण और hepatocytes 36,37 में lipogenesis को उत्तेजित करता है। न्यूट्रोफिल, 35-60% के पलायन से जुड़े मात्रा बढ़ जाती है, जबकि प्रदर्शित कीमोटैक्टिक एजेंटों 10-15% प्रेरित 38-40 सूजन। वर्तमान परख संभावित इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है।
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |