T-lymphocyte mitogenesis is accompanied by blastogenic transformation, whereupon the cell volume enlarges before cell division. Here, we describe a method to quantify blastogenesis in T lymphocytes using an automated cell counter with the capability of measuring cell diameters.
Lymfocytproliferation som svar på antigeniska eller mitogen stimulering är en lätt kvantifierbara fenomen användbar för testning immunmodulerande (dvs., immunundertryckande eller immunstimulerande) kemiska föreningar och biologiska läkemedel. En av de tidigaste stegen under mitogenes är utvidgningen cell eller blastogen transformation, varefter cellvolymökningar före division. Det är vanligtvis påvisas i de första timmarna av T-lymfocyter stimulering. Här beskriver vi en snabb metod för att kvantifiera blastogenes i T-lymfocyter isolerade från musmjältar och humana perifera mononukleära blodceller (PBMC) med användning av en automatiserad cellräknare. Olika vanligen använda spridningsanalyser för det mesta är arbetskrävande och endast återspegla den totala populationen effekt snarare än enskilda cellulära effekter inom en population. Däremot ger den presenterade automatiserad celltalsräknare analys snabba, direkta och exakta mätningar av celldiameter som kan varaanvändas för att bedöma effektiviteten av olika mitogener och immunmodulerande läkemedel in vitro.
T-lymfocyter är de primära celler som ansvarar för adaptiv immunitet hos däggdjur. Det är känt att de svarar på specifika antigena peptider som presenteras av MHC-molekyler på ytan av antigenpresenterande celler. Vid aktivering av en besläktad T-cellreceptor (TCR), förstorar cellen i en process som benämns blastogen transformation, eller blastogenes. Denna process är detekterbar i den första ~ 6 timmar efter stimulans anbringas en. Under blastogenes, volymerna enskilda T-celler ökar 2 till 4 gånger 2-6. Lymfocyter börjar föröka sig i en process som kallas klonal expansion, vars syfte är att generera så många kloner av antigen-specifika TCR-bärande celler som möjligt. Avkomman celler utövar då deras immunologiska funktion genom att differentiera i cytotoxiska (CD8 +) eller hjälpare (CD4 +) effektor-T-lymfocyter. Således, naiva T-lymfocyter i humant eller mus blod finns i G 0 (vila) fas av cellcykel och stöd minimal metabolisk aktivitet. Vid exponering för antigener eller mitogener, T-celler återinträda i cellcykeln, med en åtföljande stimulering av transkription och proteinsyntes 7-10. Mitogener, såsom forbol 12-myristat 13-acetat (PMA) och jonomycin stimulera lymfocyterna genom aktivering av proteinkinas C (PKC) och Ca2 + -beroende signaleringsvägar 1. Aktiveringen av T-celler med PMA / jonomycin kringgår TCR signaleringssteg.
In vitro proliferationsanalyser används allmänt för att utvärdera lymfocytfunktion och svar på stimuli. Spridning avläsningar vanligtvis tas en till tre dagar efter starten av T-cellstimulering och återspeglar den kollektiva tillstånd av hundratals eller tusentals celler. Potensen av olika mitogener och immunmodulerande läkemedel in vitro kan utvärderas genom att helt enkelt mäta förökningshastigheter i närvaro av dessa föreningar. Några av dessa enssays och deras begränsningar diskuteras nedan.
För direkt cellantal räkning, är det förfarande tidskrävande, med en hög sannolikhet för operatörsfel.
För DNA-syntes, den 3H-tymidininkorporering analys mäter DNA-syntes, men dess huvudsakliga begränsningen är dess farligheten. En icke-radioaktiv alternativ är BrdU, men utbudet av linjär respons för celltillväxt är begränsad, och antikroppsbehandling krävs, vilket ökar antalet steg i förfarandet 11,12.
För metabolisk aktivitet, tetrazoliumsalter (MTT, MTS, XTT, och WST-1) och resazurin färgämnesbaserade kolorimetriska analyser rapporterar den allmänna metaboliska tillstånd att dela cellpopulationer. Emellertid är MTT inte är löslig i odlingsmediet, vilket kräver ytterligare tvättsteg, vilket sålunda införliva fel i mätningen; XTT behöver ytterligare komponenter för att minska effektivt; MTS-, WST-1, och resazurin baserade mätningar påverkaed av odlingsmediet pH och dess komponenter serum, albumin eller fenolrött 13-16. Dessa analyser mäter inte det faktiska antalet viabla celler utan snarare uppskatta de kombinerade enzymaktiviteterna. Därför spridningen hastigheten kan inte bestämmas noggrant genom metaboliska analyser på grund av den icke-linjärt samband mellan antalet celler och färgämne minskning 12,17.
För mätning av ATP-koncentration, T-cellsaktivering-inducerade ökningar i ATP korrelerar med proliferation. Men en av de första stegen i T-cellsaktivering förhöjning av intracellulär ATP; många steg är bakom själva spridningen 17,18.
För färgämnesspädningsanalys, fläckar CFSE fluorescerande färgämne celler genom kovalent bindning till intracellulära proteiner. Färgämnet visar en proliferation beroende minskning av fluorescensintensitet, vilket kan spåra antalet celldelningar. Men på grund av kovalent proteinmärkning, funktioner dessaproteiner kan äventyras. Färgämnet är toxisk för cellerna vid högre koncentrationer. Vid lägre färgämneskoncentrationer, emellertid den initiala fluorescensintensiteten reduceras, vilket minskar det antal celldelningar som kan spåras. Dessutom, efter märkning med CFSE, det finns en spridning oberoende ~ 50% förlust av initial fluorescens under den första 24 till 48 h period, vilket begränsar det dynamiska området för denna analys 19,20.
De flesta av dessa analyser återspegla det kollektiva tillståndet för ett stort antal celler och kräver behandling av cellerna med fluorescerande färgämnen. Nekrotiska och apoptotiska celler kan också bidra till dessa mätningar, såvida de inte tas bort från analysen genom färgning med kemikalier eller antikroppar.
Lymfocyt blastogenes kan utvärderas genom en mängd olika metoder, såsom optisk mikroskopi eller flödescytometri 4,21,22. Här beskriver vi en snabb metod för att mäta T-cellstorlekar med användning av enn automatiserad cellräknare, som samlar cellbilder i realtid som lagras och kan analyseras på nytt vid ett senare tillfälle. I tillägg till storleksmätningar, ger denna anordning exakta cellantal och den procentuella andelen livsdugliga celler, såsom bestämts genom trypanblå fläck utslagning. Den anordning som används i detta protokoll är kommersiellt tillgängliga, och tillverkaren testade precisionen hos instrumentet med tre olika instrument och flera kontroller koncentration och lönsamhet. Resultaten av dessa studier visade en variationskoefficient som var i allmänhet under 6%. Som nämnts i protokollet, är enheten kalibreras regelbundet med 6 pm och 8 pm polystyren diameter pärlor. Fördelarna med användning av en cellräknare för att skilja mellan vilande T-celler och T-lymfoblaster baserade på celldiametern är lättheten att använda och den automatiserade typen av analys. Programvaran är kapabel att dra en cirkel runt varje cell och beräkningen av celldiametern. Dessutom imåldrar är synliga för operatören, som kan kontrollera riktigheten av instrumentet för att identifiera cellerna och korrekt rita en cirkel runt dem. I termer av begränsningar, kan instrumentet inte i sig skilja mellan skräp och celler; därför är det viktigt att operatören betraktar varje bild som den håller på att bearbetas. Det finns en potential för att införliva luftbubblor, vilket kommer att minska antalet användbara fält för analys; emellertid är detta sällsynt om det vanliga spolnings underhåll utförs.
I denna studie erhöll grupper av mjält-T-lymfocyter stimulerades med ionomycin och ökande koncentrationer av PMA under 12-48 h. PMA så låga koncentrationer som 2 ng / ml inducerade både en robust blastogen respons och betydande spridning. Mätningar av effekterna av flera läkemedel, såsom immunsuppressiva cyklosporin A (CsA), FK506 (takrolimus), och rapamycin (sirolimus), liksom jon kanalblockerare TRAM-34 och FTY720 (fingolimod), på blastogenes visade god överensstämmelse med rapporterade effekter på proliferation. Den blastogen svaret hos humana PBMC till PMA / jonomycin och murin T-cellsstimulering med anti-CD3 och anti-CD28-antikropp-belagda magnetiska pärlor mättes också.
Cellräknare analysen kvantifierar både blastogenes och proliferationshastigheten (celldensitet) samtidigt men separat, till skillnad från de ovan nämnda metoderna, som ser på en kombination av dessa effekter. De presenterade protokoll ger en snabb och robust teknik för att utvärdera styrkan av mitogena och immunmodulerande medel.
Här beskriver vi en teknik för snabb detektering och kvantifiering av T-cells blastogen transformation med användande av en automatiserad cellräknare. Under våra förhållanden (250 ng / ml PMA och 250 nM ionomycin stimulering), var cellytan ökade tvåfaldigt och volymen trefaldigt efter 48 timmar av aktivering. Analysen är tillräckligt känslig för att upptäcka sprängning under de första 12 h av aktivering, där cellvolymen ökade endast 1,25 gånger jämfört med vilande (figur 2D). Ett mer fysiologiskt relevant mekanismen för T-cellsaktivering med användning av anti-CD3 och anti-CD28 antikroppsbelagda magnetiska pärlor gav en signifikant blastogen respons, med en genomsnittlig 2,3-faldig ökning i volym (72 h efter aktivering, figur 3D). Humana mononukleära celler visade en 2,6-faldig förändring av volym vid PMA / ionomycin stimulering under 48 timmar (Figur 4). ICR-mus mjälten T-cellmedeldiameter och volym bestämdes vara6,9 pm och 1,9 x 10 -4 nl respektive. Humana PBMC (från en frisk donator) hade en medeldiameter av 7,7 pm och en genomsnittlig volym av 2,7 x 10 -4 nl. Användning av detta protokoll, testade vi också ökande koncentrationer av PMA på deras förmåga att aktivera T-celler. Dessa encelliga resultat överensstämde med proliferationsanalyser utförda på liknande PMA koncentrationer.
Flera föreningar rapporterade att påverka celltillväxt testades: FTY720 31,32; den immunsuppressiva cyklosporin A, FK506 och rapamycin 27,28; och spårvagn-34, en blockerare av kalciumaktiverade KCa3.1 kanaler 33,35. Vi fann att, vid de testade koncentrationerna, de mest potenta hämmare av blastogenes var CsA och FK506. Rapamycin hade en mindre men statistiskt signifikant undertryckande effekt på blastogenes. TRAM-34, å andra sidan, inte påverkar blastogenes.
CsA tryckte både blastogenes och proliferation, men inte fullständigt (figur 2B och 2C), vilket visar att automatisk cellräknare mätning är en bra korrelat av läkemedelseffektiviteten i T-cellproliferation. I närvaro av rapamycin tillsammans med CsA, blastogenes inhiberades fullständigt, vilket tyder på att NFAT- och mTOR-medierade reaktionsvägar i kombination fullt kan stå för utvidgningen T-cellen vid mitogen stimulering med PMA / jonomycin (figur 3C).
Det dynamiska området för vissa proliferationsanalyser är begränsad (se figur 2). Proliferationsanalyser, såsom den som vi har använt (figur 2C), rapporterar en signal som innehåller bidrag från apoptotiska och nekrotiska celler. Automatiserade ändra diameter mätningar inte har denna begränsning, eftersom mätningarna avser endast levande celler. Cellviabilitet bedöms genom uteslutning av trypanblått fläck från friska, livsdugliga celler. I storleksmätningar med användning av fram-ljusspridning i flödescytometri diskriminering dubb cell kan vara problematiskt 22. I de automatiserade mätningar cell disk, ingen dubb befolkningen hittade (Figur 1). Även mätningen var tillräckligt exakt för att skilja mellan effekterna av 100 och 200 nM cyklosporin (Tabell 1) och för att upptäcka blastogenes inom 12 timmar av mitogen stimulering (figur 2D).
Detta nya assay är särskilt användbar för små antal prover. Upp till 15 prover kan mätas i en timme. Dock har analysen sina begränsningar, varav de flesta kan mildras. Även om det på ett effektivt sätt kan lösa små (<1 pm) skillnad i celldiameter, maskinen modell vi använt har en självrisk på 5 pm upptäckt. Denna gräns kan leda till överskattningen av mycket små cellstorlekar, eftersom det effektivt utesluter alla celler med mindre diameter. Men nyare modeller av cellräknare har upptäckt tröskaåringar på ~ 2 pm, vilket bör lindra detta problem. Om det finns för mycket skräp i provet, instrumentet behandlar dem som livskraftiga celler. Dessutom kan luftbubblor ibland komma in i flödescellen och orsakar förvrängning av cellbilder tagna av maskinen. Distorsionen verkar inte påverka viabilitet, men det kan påverka de uppmätta diametrar. Därför är det rekommenderat att alla bilder kontrolleras av försöksledaren för luftbubblor innan uppgifterna från varje försök accepteras för analys. Eftersom programvaran drar endast cirklar runt cellerna, kan diametrar av icke-sfäriska celler vara sned mot den långa axeln, vilket gör analysen mindre lämpliga för icke-sfäriska celler.
Denna analys är snabb, tar ca 4 min per prov, jämfört med proliferationsanalyser, som kräver ett par timmar. Datainsamling är också ganska enkelt med hjälp av programvara som medföljer enheten. Programmet kan exportera mätdata till en spreadsheet för analys. Slutligen är det en single-cell, i motsats till en population, mätning; både blastogenes och proliferation mäts; och det skiljer mellan levande och döda celler samtidigt. Det kan användas för att utvärdera olika musstammar för deras förmåga att montera ett immunsvar. Analysen kan även användas med framgång för mätning av blastogenes i T-celler från humana givare (Figur 4), och den kan också användas i andra celltyper.
Cellvolymökningar är kända för att bidra till reglering av metabolism: cell svullnad stimulerar glutamin-inducerad glykogensyntes och lipogenes i hepatocyter 36,37. Neutrofiler visar migrationsrelaterade volymökningar på 35-60%, medan kemotaktiska medel inducerar 10-15% svullnad 38-40. Den aktuella analysen kan potentiellt användas för att studera dessa processer.
The authors have nothing to disclose.
We thank Lucile Wrenshall for the use of the plate reader, Nancy Bigley for useful discussion, and Tom Brown for the gift of ICR mice. This work was funded by grant 1R01AI114804 from the National Institute of Allergy and Infectious Diseases and by WSU Faculty Development funds (to J.A.K.). J.N.G. was supported in part by the National Institute of General Medical Sciences grant R25GM090122.
RPMI-1640 | Lonza | BW12-702F | |
40 μm nylon cell strainers | Thermo Fisher Scientific | 22363547 | |
nylon wool fiber columns | Polysciences, Inc. | 21759-1 | |
50 ml conical tubes | The Lab Depot | TLD431697 | |
6-well cell culture treated plates | USA Scientific | CC7682-7506 | |
96-well cell culture treated plates | Thermo Fisher Scientific | 130188 | |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Fisher BioReagents | BP231-100 | |
CellTiter 96 AQueous One Solution Cell Proliferation Assay | Promega | G3582 | MTS based assay |
Cyclosporine A | Sigma-Aldrich | 30024 | |
FK506 | Cayman Chemical Company | 104987-11-3 | |
Rapamycin | Santa Cruz Biotechnology | sc-3504 | |
TRAM-34 | Sigma-Aldrich | T6700 | |
FTY720 | Sigma-Aldrich | SML0700 | |
Dynabeads Mouse T-Activator CD3/CD28 | Gibco | 11456D | |
Phorbol 12-myristate 13-acetate (PMA) | Acros Organics | 356150010 | |
Ionomycin calcium salt | Sigma-Aldrich | I0634 | |
Penicillin-Streptomycin | MP Biomedicals | ICN1670049 | 100 x stock |
Dulbecco’s phosphate buffered saline (DPBS) | HyClone | SH30378.02 | 10 x stock |
1,4-dithiothreitol (DTT) | Research Products International | 12/3/3483 | reducing agent |
8 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 84192-5ML-F | Actual 8.02 µm |
6 µm micro particle size standard | Sigma-Aldrich | 89756-5ML-F | Actual 6.084 µm |
Single magnetic separation stand for 1.5 – 2 mL tube | V&P Scientific, Inc. | VP772F5 | |
Cell culture incubator | Forma Scientific | 3110 | |
Synergy H1 hybrid reader | Bio Tek | BTH1M | |
Vi-CELL cell viability analyzer | Beckman Coulter | 731050 |