En optimeret protokol til in vitro modning af zebrafisk oocytter anvendes til manipulation af maternelle genprodukter præsenteres her.
Cellulære begivenheder, der finder sted i de tidligste stadier af animalsk embryonale udvikling er drevet af maternelle genprodukter deponeret i udviklingslandene oocyt. Fordi disse begivenheder er afhængige af maternale produkter, som typisk virker meget snart efter befrugtningen-at preexist inde i ægget, standardmetoder til ekspression og funktionel reduktion involverer indsprøjtning af reagenser ind i befrugtede æg er typisk ineffektive. I stedet skal sådanne manipulationer udføres under oogenesen før eller under akkumuleringen af maternelle produkter. Denne artikel beskriver i detaljer en protokol til in vitro modning af umodne zebrafisk oocytter og deres efterfølgende in vitro-befrugtning, hvilket gav levedygtige embryoer, der overlever til voksenalderen. Denne fremgangsmåde tillader funktionelle manipulation af maternelle produkter under oogenese, såsom ekspressionen af produkter til fænotypisk redning og mærkede konstruktion visualisering, samt ens reduktion af genfunktion gennem omvendte-genetik midler.
Under dyreudvikling, moderen indskud genprodukter (fx RNA'er, proteiner og andre biomolekyler) i ægget; disse produkter er vigtige for tidlige cellulære processer umiddelbart efter befrugtning 1, 2. Manipulation af ekspressionen og funktionen af maternelle produkter er typisk ineffektiv, når anvendelse af en standard fremgangsmåde til indsprøjtning af reagenser i befrugtede æg 3. Dette er fordi de fleste RNA'er og proteiner produceres af oocytten under oogenesen så pre-loaded moderen produkter er allerede til stede i det modne æg. Sådanne allerede eksisterende produkter er uigennemtrængelig for funktionelle knockdown med genmålretning midler, såsom Morpholino-antisense-oligoer (MOS), fordi MOS målrette mRNA'et, ikke det forud eksisterende protein allerede er til stede i ægget ved befrugtningen. Hertil kommer, at mange tidlige embryonale processer ske for hurtigt efter befrugtning skal influenced af proteinprodukter afledt fra RNA injiceres i befrugtede æg, som RNA'et ikke kan fremstilles hurtigt nok til at påvirke de første begivenheder af embryogenese. Af samme grund, mærkede proteinfusioner udtrykt gennem et mRNA injektion i det befrugtede æg kan ikke fremstilles i tide til visualisering under deres aktive rolle i det tidlige embryon. Injektion i ekstruderede modne oocytter før æg aktivering er mulig, men er forbundet med lignende tekniske spørgsmål: sådanne modne æg er allerede præinstalleret med maternel protein, og de vil ikke blive translationelt aktiv (dvs. producere protein fra eksogene udskrifter) indtil efter æg aktivering. Af disse grunde, manipulation af maternelle genprodukter handler i tidlig embryogenese skal typisk udføres under oogenese i modnende oocyt.
Som en metode til at overvinde disse forhindringer, i vitro-modning fremgangsmåder, der muliggør modning af OOCytes fra trin IV til dannelse æg, er blevet etableret i zebrafisk. Tidlige metoder tilladt i vitro-modning, men de resulterende modne æg var ikke kompetent til befrugtning 4. Efterfølgende manipulering af dyrkningsbetingelser fra neutral til pH 9,0, efterligner den alkaliske pH af æggestokkene væske findes i fiskearter 5, 6, fik lov til pålidelig in vitro fertilisering (IVF) efter in vitro-modning 7, 8. Faktisk kan in vitro -matured oocytter opnåelse levedygtige embryoer, der overlever til voksenalderen og som er frugtbar 3, 8. Denne forbedrede fremgangsmåde er blevet yderligere tilpasset til at omfatte den funktionelle manipulation af maternelle gener, ekspressionen af taggede proteiner under zebrafisk oogenese gennem exogen udtryk, og MO-medieret funktionel knock down i måttenuring stadie IV oocytter 3 (figur 1).
Zebrafisk oogenese udviser en række karakteristiske faser fører til dannelse af modne oocytter 9 (se tabel 1 for en hurtig guide til de forskellige stadier i oogenese). Kort fortalt er oocytudvikling initieret af Fase I oocytter og bliver arresteret på diplotene etape af profase I i meiosen. Disse oocytter undergår vækst gennem aktiv transkription (påbegyndt i trin IA og IB), dannelsen af corticale alveoler (også kendt som corticale granuler, indledt i trin II), og vitellogenesis (igangsat under trin III). Oocyt vækst er afsluttet i løbet af trin IV, når meiose jeg genoptager, hvilket resulterer i demonteringen af oocytten kerne, benævnt germinale vesikel (GV). Efterfølgende meiose anholdt igen på metafase II. Færdiggørelsen af oocyt vækst og meiotisk standsning under trin IV fører til en moden fase V f.eksg 9. Fjernelsen af den follikulære membran forekommer under frigivelsen af oocytten i lumen i æggestokken 10 og er afgørende for befrugtning og korrekt æg aktivering. Når æggene er ekstruderet fra moderen under naturlig parring, bliver de aktiveret. I zebrafisk, udsættelse for vand er tilstrækkelig til fuld æggeaktivering, uanset tilstedeværelsen af sædceller 11.
In vitro betingelser tillader i øjeblikket for modningen af oocytter fra tidligt stadium IV-, der kan genkendes ved deres størrelse (690-730 um), tilstedeværelsen af et stort GV i en asymmetrisk position, og et fuldt opakt udseende på grund af ophobning af æggeblomme proteiner (figur 2B) -til den modne stadie V æg, kendetegnet ved en fuldt adskilt GV og et gennemskinneligt udseende på grund af æggeblomme proteinbearbejdning 12 (figur 2C). I denne tilgang, hele æggestokke containing oocytter på forskellige udviklingsstadier fjernes fra hundyr. Oocytterne lov at udvikle i 17α-20β-dihydroxy-4 pregnen-3-on (DHP), en effektiv modning-inducerende hormon 8. I denne periode, kan modning oocytter manipuleres ved injektion af ekspression (fx capped in vitro -transcribed mRNA'er) eller revers-genetik midler (fx MOS). Den follikulære lag ikke spontant kaste mod slutningen af modningsperioden, så det skal fjernes manuelt. Efter defolliculation, er in vitro-befrugtning opnås ved at udløse æggeaktivering gennem eksponering af æggene til vand (til stede i embryonisk (E3) medium) 13 og en sædcelle opløsning. De resulterende zygoter gennemgå fosterudvikling og give mulighed for vurdering af evnen af behandlinger til at manipulere mødres gen funktion og til visualisering og analyse af mærkede maternelle produkter ( <strong> Figur 3).
Ovenstående protokol er til manipulation af genprodukter før befrugtning, således tillader studiet af maternelle genprodukter i det tidlige zebrafisk embryo. Tidligere undersøgelser har været i stand til at modne oocytter in vitro 4; denne protokol blev modificeret for at muliggøre efterfølgende befrugtning af in vitro-modnede oocytter 8. Dette tillader igen til indsprøjtning af reagenser til funktionel manipulation og visualisering af maternelt nedarvede produkter i det tidlige embryon 3. Embryoner som følge af denne metode kan være levedygtige og kan overleve at blive frugtbare voksne. I indledende eksperimenter, ca. halvdelen af de befrugtede embryoner fra denne procedure var levedygtige på dag 5 for udvikling, som vurderet ved svømmeblære inflation på dette stadium, hvoraf halvdelen blev raske, frugtbare voksne (ikke offentliggjorte observationer).
Der er en rækkeaf kritiske skridt til at overveje i protokollen. Oocytter på det passende tidspunkt at initiere modning (tidligt stadium IV) kan beriges hvis hunnen er blevet parret nylig, men ikke før 8 dpp. Ved hjælp af fisk, der ikke har parret for nylig kunne resultere i degenererende æg 14, som ikke vil undergå modning. Hunner parret inden for mindre end 8 dage vil have et flertal af æg på stadium III eller mindre, og således vil æggene ikke modne ordentligt in vitro. Æggestokkene hos kvinder, der har parret 8 dage før vil have en optimal del af oocytter i tidligt stadium IV. Disse kan genkendes ved deres opacitet og tilstedeværelsen af GV i en excentrisk position (figur 2B). Oocyt stadium bestemmelse kan også hjælpes ved størrelse måling med oocytterne anbragt på en gradueret mikrometer dias under et mikroskop og i forhold til standard mellemstationer retningslinjer (tabel 1). tidligt stadie IV oocytter har dog næsten maksimal størrelse sammenlignet med modneoocytter (anerkendt af deres relative gennemsigtighed og mangel på en GV, figur 2C) og genkendes let, som beskrevet ovenfor, hvilket generelt undgår behovet for en direkte måling oocyt størrelse.
In vitro modning skal påbegyndes inden for flere timer efter afslutningen af dagslyset cyklus, som de kvindelige oocyt donorer akklimatiseret. Oocytter vil ikke modne ordentligt, hvilket afspejles i dårlige befrugtning satser, hvis dyrkes i løbet af formiddagen periode af lyset cyklus. Årsagen til den cirkadiske afhængighed af in vitro oocytmodning metode er ikke forstået, men afspejler sandsynligvis underliggende cirkadiske skævheder i in vivo ægmodningen involverer cykling genekspression under oogenese 21. En almindelig årsag til oocytter undlader at gennemgå en succes in vitro modning på trods af korrekt oocyt iscenesættelse er, at DHP er udløbet. DHP hormon generelt udløber efter et år, og for at sikre effektive modning, skal arbejdsmiljøet parti udskiftes inden for 9 måneders brug.
Injektion af oocytter er endnu et vigtigt skridt, når formålet med fremgangsmåden er den funktionelle manipulation af maternelle produkter. Denne fremgangsmåde har krav, der adskiller sig fra dem for standard injektioner i det befrugtede æg ved 0-30 mpf. En nøglefaktor i oocyt injektion er behovet for at foretage injektionerne under betingelser, der ikke fører til for tidlig aktivering æg, såsom i Leibovitz L-15-medium 22, 23. Fordi de er indlejret i æggestokke, med udløb oocytter udgør også særlige krav til injektion. Protokollen ovenfor foreslår først at dissociere oocytter fra æggestokkene og derefter holde hver dissocieret oocyt separat med pincet under injektionen. Denne teknik har fungeret godt, og gør det muligt for forsortering oocytter på et passende tidspunkt med minimal håndtering. kan også anvendes alternative metoder, såsomsom: i) anbringelse oocytter i standard injektion agarose render 15, hvor de lodrette vægge af truget støtte oocytten under injektion (i denne alternative fremgangsmåde, behøver oocytterne overføres til injektion plader, mens der holdes in vitro modning medium), og ii ) at give de oocytter at forblive fastgjort til æggestokkene masse, som kan holdes med pincet under injektionen for at undgå kontakt med den injicerede oocyt (i denne fremgangsmåde, bør oocytterne dissocieres efter injektion til både lette DHP eksponering og at tillade deres defolliculation , selv afgørende for IVF). På trods af dette specifikke udfordring, kan trin IV-oocytter let gennemtrænges med en injektionsnål, sandsynligvis fordi chorionmembranen på nuværende tidspunkt ikke er fuldt udviklet 9.
En begrænsning ved det nuværende modning protokol er, at i vitro-modning betingelser, der fremmer ordentlig oocytudviklingkan ikke oprettes når oocytmodning initieres ved trin tidligere end trin IV. Oocyter blive kompetente til at reagere på DHP ved at undergå modning, når de når en diameter på 520 um, der forekommer under trin III (vitellogenesis, svarende til 340-til-690-um) 9. Men kulturen i fase III-oocytter resulterer i oocytter, der ikke er kompetent til befrugtning 3. Kun oocytter hvis in vitro-dyrkning initieres ved trin IV (figur 2B) kan udvikles til modne, trin V oocytter (figur 2C og D). Dette kan være relateret til det faktum, at trin III er afgørende for vitellogenesis og oocyt vækst 9. Således bør in vitro oocytmodning procedure præsenteres i denne artikel kun anvendes med et udgangsmateriale population af trin IV-oocytter (B), og ikke med oocytter på tidligere stadier (stadium I – III; Figur e <strong> 2A). Af samme grund er denne fremgangsmåde er begrænset til gener, som udtrykkes i trin IV eller senere. Den funktionelle manipulation af gener, hvis produkter udtrykkes tidligere kan være afhængig af genetiske fremgangsmåder (se nedenfor). Forbedringer til in vitro-kultur modningsbeholdere metoder kan i fremtiden tillade initiering af oocyt dyrkning på tidligere stadier, og dermed udvide magt in vitro modning tilgang.
En anden begrænsning i den foreliggende fremgangsmåde er, at defolliculation, som er afgørende for de efterfølgende trin, der involverer befrugtning, er i øjeblikket et hastighedsbegrænsende trin i proceduren. Den follikulære membran er en transparent lag, der omgiver den udviklende oocyt, og fjernelse kan være trættende. Hvis denne membran ikke er helt fjernet, vil ægget ikke blive fuldt aktiveret og befrugtede. Dette er gjort tydeligt ved svigt af chorion at udvide og udviklingen af uregelmæssigt placeret, fure-lignende structures (pseudocleavages), karakteristiske for ubefrugtede embryoner 11. Enzymatiske defolliculation metoder såsom kollagenase, som anvendes i Xenopus, har været forsøgt. Men i vore hænder, denne teknik har ikke været en succes, og derfor vi stole på manuel defolliculation. Fordi manuel defolliculation er arbejdskrævende og tidskrævende, er det vanskeligt at opnå store partier af befrugtede æg efter in vitro-oocytmodning. På grund af den tidsmæssige begrænsning ved manuel defolliculation, vi i øjeblikket befrugte et par defollikuleret, modne æg ad gangen, i små partier af 5-10 æg. Inkorporeringen af enzymatisk defolliculation med denne procedure vil sandsynligvis øge dets udbytte og generelle brugervenlighed.
Selvom embryoner efter befrugtning af in vitro -matured oocytter kan blive levedygtige voksne bemærker vi, at efter in vitro-befrugtning, en fraktion af embryoner gøre ikke opdele normalt eller i tide. Vi i øjeblikket selektion for linier, hvis formering omfatter runder af in vitro-oocytmodning, hvilket kan resultere i mere robuste udviklingsmønstre i embryoner gennem denne metode.
Proceduren har muliggjort den klare redning eller visualisering af protein lokalisering for en række mutationer 24, 25. Men for nogle gener, kan reguleringen af produktekspression være afgørende, så produkterne udtrykt af injiceret mRNA kan føre til variable resultater 26. Det er også vigtigt at være opmærksom på alle de kontroller (fx embryoner injiceret med reagenser, som har tilsvarende egenskaber som dem, der anvendes i forsøget endnu forudsiges at ikke frembringe en virkning, såsom kontrol MOS eller RNA'er kun koder for inerte proteiner, såsom som GFP), som underliggende variabilitet kan føre til forkerte konklusioner.
nt "> en metode, hvor in vitro-manipulation efterfulgt af befrugtning er særlig nyttig i tilfælde af maternelt aflejrede produkter, hvor standardmetoden ifølge injicere RNA, MOS, eller protein i det befrugtede æg kan ikke effektivt at reducere produkter, der allerede er akkumuleret i ægget. andre nyligt udviklede metoder, såsom CRISPR-mutant generation, er også effektiv til at generere mutant betingelser for maternelt udtrykte gener 26. Men denne fremgangsmåde kræver vækst af flere generationer af fisk. In vitro oocytmodning teknik tillader hurtig funktionel manipulation for at undersøge funktionen af maternelt udtrykte gener, herunder redning og phenocopy af maternel-effekt mutationer, såvel som ekspressionen af RNA og proteiner i det tidlige embryon.The authors have nothing to disclose.
Vi vil gerne takke medlemmerne af Pelegri lab og fisk facilitet ledende medarbejdere, der var medvirkende til at lette dette projekt. Støtte til dette projekt blev leveret af NIH R56 GM065303 og NIH 2 T32 GM007133 til ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 og NIH 2 T32 GM007133 til CCE, og NIH RO1 GM065303 til FP
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |