Summary
Оптимизированный протокол для созревания в пробирке данио ооцитов , используемых для манипуляции продуктов материнских генов представлен здесь.
Abstract
Клеточные события, которые происходят на ранних стадиях эмбрионального развития животных обусловлены матерински полученных генных продуктов, депонированных в развивающуюся яйцеклетку. Поскольку эти события зависят от материнских продуктов, которые, как правило, действуют очень скоро после оплодотворения, что внутри существовать до яйца, стандартные подходы для экспрессии и функциональной редукции, включающие введение реагентов в оплодотворенную яйцеклетку, как правило, неэффективны. Вместо этого, такие манипуляции должны быть выполнены во время оогенеза, до или во время накопления материнских продуктов. В данной статье подробно описывается протокол для созревания в пробирке незрелых ооцитов данио и их последующего оплодотворения, получая жизнеспособные эмбрионы , которые выживают к взрослой жизни. Этот метод позволяет функциональное манипулирование материнских продуктов во время оогенеза, таких как выражение продуктов для фенотипического спасения и помеченной визуализации конструкта, а такжеево снижение функции гена с помощью обращенно-генетических агентов.
Introduction
Во время развития животных, материнские отложения генные продукты (например, РНК, белки и другие биомолекулы) в яйце; эти продукты имеют важное значение для ранних клеточных процессов сразу после оплодотворения 1, 2. Манипуляции экспрессии и функции материнских продуктов , как правило , неэффективны при использовании стандартного подхода для введения реагентов в оплодотворенных яйца 3. Это происходит потому, что большинство РНК и белки получают ооцита во время оогенеза, так что предварительно загружены материнские продукты уже присутствуют в зрелом яйце. Такие продукты, существующие ранее непроницаемы для функционального нокдауна с генными ориентации агентами, такими как морфолино антисмысловых олигонуклеотидов (MOS), потому что целевой МО мРНК, а не существовавшие ранее уже присутствует белок в яйце при оплодотворении. Кроме того, многие ранние эмбриональные процессы происходят слишком быстро после оплодотворения быть influenКНИ с помощью белковых продуктов, полученных из РНК, введенного в оплодотворенной яйцеклетки, поскольку РНК не может быть получен достаточно быстро, чтобы повлиять на первые события эмбриогенеза. По той же причине, меченый белок слияния, выраженные через инъекции мРНК в оплодотворенной яйцеклетки, не может быть получен во времени для визуализации во время их активной роли в раннем эмбрионе. Инъекция в экструдированных зрелых ооцитов до активации яйца возможно , но связано с подобными техническими вопросами: такие зрелые яйца уже предварительно загружены с материнским белка, и они никогда не станут поступательно активными (то есть, производят белок из экзогенных транскриптов) до тех пор , после того, как яйца активация. По этим причинам, манипулирование продуктов материнских генов, действующих в начале эмбриогенеза обычно необходимо проводить во время оогенеза в вызревании яйцеклетки.
В качестве одного подхода к преодолению этих препятствий, в пробирке методы созревания, которые позволяют созревание МНКАytes от стадии IV до формирования яйца, были созданы в данио. Ранние методы позволили в пробирке созревания, но в результате зрелых яйца не компетентны для оплодотворения 4. Затем манипуляции условий культивирования от нейтрального до рН 9,0, имитируя щелочной рН жидкости яичников , найденного в видов рыб , 5, 6, разрешенный для надежного экстракорпорального оплодотворения (IVF) после созревания в пробирке 7, 8. Действительно, в пробирке -matured ооциты могут давать жизнеспособные эмбрионы , которые выживают к взрослой жизни , и что плодородные 3, 8. Этот усовершенствованный метод был дополнительно выполнен с возможностью включать в себя функциональные манипуляции материнских генов, экспрессию меченных белков во время данио оогенеза через экзогенную экспрессию и Мо-опосредованный функционально сбить в матеэтап IV ооцитов тора 3 (фиг.1).
Рерио оогенез имеет ряд характерных этапов , ведущих к образованию зрелых ооцитов 9 (см таблицу 1 для краткого руководства на различных этапах в оогенезе). Вкратце, развитие ооцитов инициируют стадии I ооцитов и арестовывают на диплотене профазы I мейоза. Эти ооциты подвергаются росту посредством активной транскрипции (инициированного во время стадий IA и IB), образование кортикальных альвеол (также известное как кортикальные гранулы, инициированных во II стадии) и вителлогенез (инициированный во время этапа III). Рост ооцитов завершается на стадии IV, когда я мейоза резюме, в результате разборки ядра ооцита, именуемой зародышевым пузырьком (GV). Впоследствии, мейоз снова арестован в метафазе II. Завершение роста ооцита и остановку мейоза на стадии IV приводит к зрелой стадии V, например,г 9. Удаление фолликулярной мембраны происходит во время высвобождения ооцита в просвет яичник 10 и имеет важное значение для оплодотворения и надлежащей активации яйца. После того, как яйца выдавливаются от матери во время естественного спаривания, они становятся активированными. В данио, воздействие воды достаточно для полной активации яйца, независимо от наличия спермы 11.
В пробирке условий в настоящее время допускают созревание ооцитов от ранней стадии IV-которые могут быть признаны по их размерам (690-730 мкм), в присутствии большого GV в асимметричном положении, а также полностью непрозрачным внешний вид из - за накопление желток белков (Фигура 2В) -в зрелой стадии V яйца, характеризующиеся полностью разобранном GV и полупрозрачный внешний вид из - за обработки белка желток 12 (рис. 2в) При таком подходе целые яичники продAining ооцитов на разных стадиях развития, удаляются от самок. В ооциты могут развиваться в 17α-20β-дигидрокси-4 прегнен-3-она (DHP), эффективного гормона 8 созревания индуцирующие. В течение этого периода созревания ооциты можно манипулировать посредством инъекции экспрессии (например, ограничен, в пробирке -transcribed мРНК) или обращенно-генетика агенты (например, MOS). Фолликулярная слой не самопроизвольно пролила к концу периода созревания, поэтому он должен быть удален вручную. После того, как defolliculation, оплодотворение в пробирке достигается путем запуска активации яйца через воздействия яиц в воде (присутствует в зародыше (Е3) среды) 13 и раствора спермы. Полученные в результате зиготы подвергаются эмбрионального развития и позволяют для оценки способности лечения манипулировать функции гена материнской и для визуализации и анализа меченых материнских продуктов (
Protocol
Все данио были обработаны в строгом соответствии с хорошей практикой животных, как это определено соответствующими национальными органами и / или местного благосостояния животных, и все животное работа была утверждена соответствующим комитетом (Университет Висконсин-Мэдисон обеспечения номер A3368-01). Животных содержали в стандартных условиях при 26,5 ° С.
1. Предварительный отбор суки
Примечание: ооциты у взрослых самок , как правило , охватывают диапазон стадия развития, от стадии я V (рисунок 2). Продувка самками ранее существовавшие ооцитов через успешное естественное спаривание увеличивает синхронизацию ооцитов стадирования, поскольку только развивающиеся ооциты появляются в когорте 3, 14. В течение приблизительно 8 дней после чистки, большинство ооцитов находятся в ранней стадии IV, которая является оптимальной для инициирования созревания в пробирке. Такая синхронизация увеличивает выход ооцитов ТНАт может пройти через весь процесс созревания в пробирке, что облегчает экспериментальные манипуляции. См предыдущих описаний 13 для подробностей о настройке рыбы в парных скрещиваний и по составу рыбы воды (здесь, 14 г соли океана и 150 г NaHCO 3 на 1000 л обратного осмоса воды, рН 6,5-8,5 (предпочтительный диапазон: 6.8 -7,5) и проводимость 180-360 мкСм). См Марка и др. 13 дополнительных рецептов.
- От восьми до десяти дней до экстракорпоральных манипуляций культуры в России , использовать рыболовную сеть для передачи одного самца и единственной самка рыбы требуемого штамма матовую бака. Пара несколько наборов. Оставьте их в брачный бак в течение ночи. Позвольте им спариваться в течение вечера и через день на следующий день.
- Используйте рыболовную сеть, чтобы отделить самка, которые дают яйца во время спаривания и поместить их в отдельную емкость. Поток этих самок два раза в день с пищевой смесью containiнг приблизительно равное количество артемии и пищевые хлопья рыбы. Количество пищи должно быть достаточно, чтобы обеспечить примерно 20 мин, но не более, времени кормления.
2. Приготовление Созревание среды
Примечание: Подготовка созревания среды на день в пробирке созревания эксперимента, в течение 1 ч удаления ооцитов от самки (смотрите раздел 3).
- Добавьте 20 мл L-15 среды Лейбовиц с L-глутамина, рН 7,0, в 50 мл коническую пробирку в стерильных условиях. Доведите его до рН 9,0 с помощью 10 N NaOH.
- Добавить 9 мл L-15 среды Лейбовиц, рН 9,0, 2 отдельные 50 мл конические пробирки. Этикетка 1 тюбик «+ ДГП», а другой «-DHP.»
- В трубке + DHP, добавить 10 мкл 17α-20β-дигидрокси-4 прегнен-3-она (DHP), 490 мкл дН 2 O и 500 мкл 10% -ного бычьего сывороточного альбумина (BSA).
- В -DHP трубки, добавляют 100 мкл 10 мг / мл гентамицина, 40081; л дН 2 O и 500 мкл 10% -ного бычьего сывороточного альбумина.
3. Препарирование ооцитов и Инициирование In Vitro культуры
Примечание: Эксперимент культуры в пробирке осуществляются с предварительно отобранными самками через 8-10 дней после того, как они выпускают яйцо через естественное спаривание. Используйте среду созревания сделали в тот же день (смотрите раздел 2). Яйцеклетки созревают надлежащим образом, если рассечение начинается ближе к концу рыбы суточного цикла (определяется в лаборатории с помощью предварительно установленной искусственного освещения в объекте рыбы) 13, возможно , имитируя процессы , происходящие в результате естественного спаривания. Это означает , что большинство шагов в протоколе должны проводиться в вечернее время, если рыба размещается в объекте с циклом стандартного света (например, начиная с шагом 3.2 в 6 часов вечера в учреждении с 8 утра до 10 часов светового периода) хотя другие временные периоды работы возможны с световым циклом соответствующего сдвига во время.
- Готовят 0,2% Tricaine маточного раствора в дН 2 O, забуференный до рН 7,0 с помощью 1 М Трис, рН 9,0, и держать этот раствор при температуре 4 ° С. Это может быть подготовлено заранее.
- Инициировать эксперимент 0-4 ч до окончания суточного светового цикла в объекте. В химическом стакане на 250 мл, добавляют 20 мл 0,2% раствора Tricaine, фондовой рН 7,0, 80 мл воды рыбы и перемешать.
- Перенести предварительно отобранных самок Tricaine раствора и усыпить их передержки. Оставьте самка в Tricaine раствора в течение 15 мин после прекращения движения жабр.
- Используя ложку, собирать эвтаназии рыбу из раствора Tricaine и промойте их на короткое время в рыбьем воде. Поместите рыбу на бумажное полотенце, чтобы поглотить избыток воды.
- Используйте чистое лезвие бритвы, чтобы обезглавить эвтаназии рыбы на уровне грудного плавника. Используя рассекают ножницы, сделать продольный разрез на брюшной стороне рыбы, проходящий от переднего конца к анальной области.
- Использование рассекает щипцы, осторожно диссоциируют ооциты из фолликулярных масс. Сорт ранней стадии IV ооциты (фигура 2В; перед пробой GV, при почти максимальном размере и характеризуется темным, непрозрачным цитоплазме и легко видимой GV , расположенной асимметрично в ооцит). Откажитесь ооцитов на более ранних стадиях (фигура 2А) и полупрозрачные, зрелые стадии V яиц (аналогичных тем , которые на фиг.2С , но присутствуют в яичниках до лечения ДГП).
Примечание: ооциты выбраны для созревания в ранней стадии IV, на ранней стадии, что приводит к зрелому, этапу V oocytх годов после условий культивирования в пробирке (рис 2C и D) 3. Поскольку этап IV ооциты активно производить продукты, манипуляции на данном этапе позволяет экспрессии экзогенных продуктов через инъекции РНК или для восстановления функции гена с помощью введенных орбиталей. - Использование стекла Пастера пипетку для переноса на ранней стадии IV ооциты ко второму 35 х 10 мм пластиковой чашки для культивирования, содержащей 4 мл Лейбовиц L-15 среды + DHP. Передача минимальные количества -DHP среды в чашку, содержащую раствор + DHP.
4. Микроинъекции ооцита
Примечание: Изолированный стадий IV ооцитов , подвергающихся в пробирке созревания может быть микроинъекции для введения реагентов для функциональной манипуляции или меченой экспрессии белка. Микроинъекции реагентов, таких как мРНК и орбиталей (см раздел 4), как правило , проводят , когда ооциты проходят в пробирке MatuРацион в + DHP среде, перед defolliculation. При желании, для того, чтобы предоставить больше времени для проведения манипуляций перед созреванием ооцитов, инъекции могут также проводиться в -DHP среды, до созревания, в течение по крайней мере 2 ч. Они могут затем быть переданы до + DHP среды.
- Подготовьте мРНК, используя стандартный набор выражений. Хранить их при температуре -80 ° С в качестве 100-500 пг / мкл запаса для инъекций в конечной концентрации 50-500 пг / мкл (200 мкг / мкл рекомендуется) в РНК-класса воды. Подготовка МО при концентрации 4 нг / мкл в воде в соответствии с инструкциями изготовителя. Вводят их в конечной концентрации 2 нг / мкл (или как определено эмпирически).
Примечание: Инъекции обычно проводят в среде + DHP до defolliculation (смотрите примечание в разделе 5). - Если инъекционный мРНК, непосредственно перед инъекцией, разбавленный мРНК с помощью РНК-класс обратного осмоса воды и 0,2 М KCl для достижения конечного раствора 0,1 М KCl.
- Если инъекционные МО, непосредственно перед инъекцией, разбавленные Мос до нужной концентрации с помощью обратного осмоса воды и 0,2 М KCl для достижения конечного раствора 0,1 М KCl.
- Вручную провести ооциты с тонким пинцетом и вводят приблизительно 1 нл в дикий типе IV стадии ооцитов с использованием иглы , сделанную с растянутым стеклянной капиллярной пипеткой.
- Подготовьте стеклянные иглы, потянув нагретые стекла капиллярных трубок, загрузку раствора для инъекций, и разорвать кончик иглы с пинцетом, как описано ранее в протоколах для стандартной инъекции в данио ранних эмбрионов 15.
Примечание: Это полезно, если игла имеет постепенное сужение, а не резкие один; это обеспечивает большую гибкость с точки зрения расположения разрыва кончике иглы, а также помогает предотвратить повреждение нагнетаемой эмбриона. Используя ту же иглу и решение, как для инъекций эмбрионов, регулировать объем впрыскиваемого путем предварительного определения того,Параметры давления microinjector, которые производят желаемый объем. Эти параметры могут быть определены с помощью макета инжекции в каплю минерального масла на калибровочный столик микроскопа слайда (0,01 мм) и настройку параметров microinjector , чтобы получить желаемый диаметр в болюса впрыскиваемого раствора, как описано выше 15.
- Подготовьте стеклянные иглы, потянув нагретые стекла капиллярных трубок, загрузку раствора для инъекций, и разорвать кончик иглы с пинцетом, как описано ранее в протоколах для стандартной инъекции в данио ранних эмбрионов 15.
5. ооцитов Созревание и Defolliculation
Примечание: Во время созревания ооцитов, ооциты будут постепенно полупрозрачный, что позволяет для оценки успешных условий культивирования.
- Продолжить инкубации незрелого (и, в случае необходимости, инъецированные) ооцитов в + DHP среды при 26,5 ° C, проверяя периодически (каждые 30 минут) , чтобы гарантировать , что ооциты остаются нетронутыми и проходят надлежащее созревание, становясь постепенно полупрозрачный (рис 2C) ,
- Удалите Lysing ооциты с пипеткой Пастера и отбросить ихв химическом стакане лаборатории отходов для поддержания качества среды. Обмен культуральной среды с приблизительно половины объема свежей среды + DHP для поддержания прозрачного раствора, в зависимости от количества ооцитов лизиса.
- Разрешить созревание в пробирке , чтобы продолжаться до тех пор большинство ооцитов не становятся полупрозрачными и имеют GV, которое больше не очевидно (приблизительно 2 ч при лечении ДГП, рис 2С по сравнению с D). Просмотреть их под микроскопом рассекает с передаваемой световой оптикой.
- Снимите крайнюю фолликулярной мембрану из каждой созревшей яйцеклетки. Используйте экстра-тонкий пинцет, чтобы сделать разрыв в фолликулярной оболочке в области с увеличенным пространством между ооцитами и мембраной. Лупиться часть мембраны и катить ооцит из мембраны, удерживая очищенную часть.
Примечание: В основе хорионическая мембраны, как правило, будет оставаться в тесной связи с яйцом во время этого процесса; после того, как яйца актаIvation, она расширяется, чтобы сформировать защитный слой для эмбриона. - Передача defolliculated ооцитов в минимальном объеме среды (как правило, передают около 5-10 зрелых ооцитов менее чем 20 мкл) в чашку Петри с несколькими каплями культуральной среды (+ ДГП) и приступить к оплодотворению.
6. Оплодотворение In Vitro культивируемых ооцитов
ПРИМЕЧАНИЕ: Раствор спермы на льде, подготовленное ниже, будет сохранять свою активность в течение приблизительно 2 ч.
- Готовит раствор спермы ближе к концу стадии созревания ооцитов и перед использованием defolliculation семенников из пяти самцов в 500 мкл растворе Хэнкса, как описано ранее , 16, 17.
- Добавить 10-50 мкл раствора спермы в defolliculated ооциты в культуральной среде + DHP. Подождите 10 сек.
- С помощью пипетки добавьте несколько капель эмбриональных (E3) сред для ооцитов. Подождите 1 мин, а затем затопить плели с E3 среды.
Примечание: Состав среды Е3 выглядит следующим образом : 5 мМ NaCl, 0,17 мМ KCl, 0,33 мМ CaCl 2, 0,33 мМ MgSO 4, и 1-5% Метиленовый синий 13. - Повторите шаги 5.3, 6.2, и 6.3, чтобы получить большее количество оплодотворенных эмбрионов.
- Разрешить оплодотворенные эмбрионы развиваться. Используйте рассекает микроскоп с оптикой в проходящем свете , чтобы наблюдать прогрессию через стадию расщепления , чтобы обеспечить успешное оплодотворение, как описано ранее для оплодотворения 17 и 18 постановки.
Representative Results
Для того, чтобы определить , является ли процедура , описанная выше , является успешной, эмбрионы можно наблюдать во время стадий расщепления , чтобы подтвердить появление стереотипного раннего эмбрионального рисунка 18 расщепления, а также через 24 часа после оплодотворения (HPF) , чтобы подтвердить надлежащее развитие основного плана тела. Эта процедура позволяет манипуляции материнских продуктов для функциональных исследований через инъекции реагентов, таких как мРНК и ОЧ, во время развития ооцита.
Манипуляция материнских продуктов для функциональных исследований:
мРНК , кодирующий дикого типа и мутантных продуктов может быть введен в созревающих в пробирке ооцитов , чтобы проверить эффект манипуляции материнской функции генов в мейозе и на ранних эмбриональных стадиях. Например, эмбрионы дикого типа может быть введен с беспроводным доступоммРНК LD-типа для проверки эффекта избыточной экспрессии продукта, или с мутантным РНКОМ для проверки потенциальных доминирующих (например, коэффициент усиления из-функции и antimorphic) эффекты в этих процессах. Ооциты в культуре в пробирке способны производить белка из экзогенного мРНКа в ходе развития ооцита, как показано с помощью экспрессии GFP из впрыскиваемого мРНКа, хотя только ооциты , которые инициируют условие культивирования на стадии IV оогенеза могут развиться в зрелые стадиях V ооцитов (Фигура 2В -2D, смотри также Нэйр и др. 3). Выражение дикого типа продукта через впрыскиваемый мРНК также играют ключевую роль для спасения матери-эффект мутаций , чтобы подтвердить идентичность генов во время позиционного клонирования 3, 24. В этом случае мРНК дикого типа, инъецируют в ооциты от гомозиготных мутантных самок, чтобы проверить, могут ли продукты дикого типа спасти мутантный фенотип. Этот генетический спасательное иллюстрируется на <сильный> Рисунок 3A-3C, где вводил мРНК AurB показан , чтобы спасти фенотипические эффекты мутации в его соответствующем гене, клеточный остров (CEI) (рис 3A-3C). Эмбрионы от контрольной группы также позволили разработать , чтобы показать соответствующий мутантный фенотип 3. Мутант РНК также может быть введен в мутантные ооциты, чтобы проверить, сохраняет ли мутантный продукт частичной функции путем сравнения степени спасения к тому, что вызвано дикому типу продуктом.
Экспрессия белка из мРНКа, введенный в развивающиеся ооциты по-видимому, происходит практически без задержки. Сильное выражение GFP наблюдается в течение 2 ч после инъекции соответствующей мРНК, независимо от стадии развития ооцита 3 (фигура 2В-2D; смотри также Nair и др. 3). Такие продукты, как mCherry:Sas6 и Birc5b (пестрый): GFP может наблюдаться сразу после оплодотворения и во время первого эмбрионального клеточного цикла 3, 25. Инъекции мРНК в ходе оогенеза также приводит к получению белка , который, независимо от слитого помеченной части, является функциональной сразу же после оплодотворения, как показано в случае материнских продуктов для сотового острова / aurB 3 тщетных цикла / lrmp 24, и пестрый / bir5b 25. Перевод блокировки МО также иметь эффект сразу же после оплодотворения, как показано на бесполезный цикл / Lrmp 3 и на более поздних стадиях эмбриогенеза, как и в случае невозможности миссии / dhx16 3. Сращивание блокировки MOS, при введении в созревающих ооцитов, не может оказывать влияние на материнской функции, вероятно из-за уже присутствуют зрелые материнские транскрипты в стадии IV ооцитов <вир класс = "внешние ссылки"> 3.
Генерация морфантов:
При использовании МО, соответствующий ген с уже идентифицированной мутации, то morphant фенотип, как ожидается, чтобы имитировать мутантный фенотип. Морфанты сравнивают с неинъецированными эмбрионами и тем, вводит с помощью стандартного, управления МО. Инъекция перевода блокировки морфолино может успешно фенокопия известного мутантного фенотипа 3, как показано путем инъекции Lrmp MO в ооциты, который имитирует мутантный фенотип соответствующей мутации, бесполезно цикл (рис 3D-F). Специфичность ОЧ может быть определена через те же подходы , используемые при введении в эмбрионы МО (рассмотренный ранее) 19, 20.
Выражение флуоресцентно меченного слитых белков:
мРНК , кодирующих генные продукты , представляющие интерес , слитого с флуоресцентными белками (например, GFP и mCherry) , также могут быть введены в любой из дикого типа или мутантные ооциты , чтобы визуализировать соответствующие продукты в пределах раннего эмбриона (т.е., отражающей внутриклеточную шаблон локализации; рис 3G и 3H). мРНК, кодирующий подобные слитым, но с участием мутантной аллели может быть аналогичным образом выражается, чтобы проверить, влияет ли мутация потенциальных субклеточные локализаций.
Рисунок 1: In Vitro созревания ооцитов. Принципиальная электрическая схема , показывающая различные этапы экстракорпорального созревания ооцитов. Взрослые самки предварительно отобраны для откладки яиц 8 дней до процедуры, чтобы очистить их от яиц, которые уже созрели и к проМошка нового развития ооцитов. Яичники, содержащие развивающиеся ооциты, удаляются из самок и переносили в среду , содержащей гормон DHP , чтобы индуцировать созревание ооцитов в пробирке. После удаления из самок и непосредственно перед или во время созревания ооцитов, ооциты могут быть введены с продуктами РНК и другими реагентами для функционального манипулирования материнских факторов. Зрелые овоциты вручную defolliculated и оплодотворены в пробирке с раствором спермы с получением оплодотворенных, жизнеспособных эмбрионов. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 2: In Vitro созревания ооцитов и экспрессия продуктов из мРНКа впрыска. (А) ооцитов на этапах I-III, наблюдаемых в яичниках отсук 4 дня после продувка (ДПП). (Б) ооциты на стадии IV, наблюдается в яичниках от самок 8 ДПП. Зародышевый пузырек (GV, стрелолист) хорошо виден и занимает эксцентричное положение. На стадии III ооциты в (А) , также обладают очевидной GV, но она находится по центру в ооците. Стадия IV ооциты в (B) имеют размер , который находится вблизи максимальной по сравнению с зрелых ооцитов (С). (С и D) , ооциты на стадии V (зрелые ооциты) после 2 ч в условиях созревания в пробирке , инициированных на стадии IV, как и в (B), и вводят во время созревания с GFP-кодированием, в пробирке транскрипции мРНК (С, видимый свет только, D, наложение видимого света и флуоресценции GFP). Г.В. больше не является очевидной в стадии V ооцитов, которые также являются менее непрозрачным, чем стадия IV ооцитов. Введенные ооциты выразить GFP белок (D). Defolliculation зрелых стадии IV ооцитов дезcribed в разделе протокола. Шкала бар = 300 мкм. Все панели были воспроизведены с разрешения из Наир и др 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Рисунок 3: Манипуляция и визуализация материнской продукции через In Vitro созревание ооцитов. (А - С) Спасением материнского эффектом фенотипа , вызванной мутацией в сотовом острове / Aurora B через инъекцию дикого типа aurB мРНКа в стадии IV CEI / aurB ооциты. Объединенные изображения, показывающие вид на животное из 65 MPF фиксированных blastodiscs, визуализированный с анти-бета-катениным антителами для выделения мембран (зеленый), анти-альфа-тубулина антитело, чтобы указать микротрубочки (красный) и DAPI для обозначения ДНК (синий). (А) накопление β-катенин у эмбрионов дикого типа, что свидетельствует о нормальной борозде созревания. (B) CEI / aurB эмбрион от неинъецированного CEI / aurB стадии IV ооцита показаны частичные, элементарные борозды , которые не аккумулируют -катенин. (C) спасено CEI / aurB эмбрион из CEI / aurB ооцита вводил дикий тип aurB мРНК , показывающий надежное накопление β-катенин в бороздах. (D - F) фенокопии материнского эффекта , вызванного мутацией в бесполезный цикл / lrmp от инъекции Lrmp морфолино в стадии IV ооцитов. Объединенные изображения, показывающие вид на животных из 70 MPF фиксированных blastodiscs, визуализированных с анти-гамма-тубулина антителами, чтобы указать центросомами (красный) и DAPI для обозначения ДНК (синий). (D) В эмбрионах дикого типа, каждое ядро ассоциируется с гамма-тубулином, маркером для центросомного материала. (Е) В материнском эффекте Fue мутантов, пронуклеусы слитый выходит из строя, в результате чего в течение двух-трех пластырей меток ДНК , соответствующих слитые родительские про-ядра и полярное тело для мейоза II. (F) В Lrmp морфантов, где материнская функция Lrmp ингибируется, ядра аналогично не в состоянии разделить и, кроме того, не могут ассоциировать с гамма-тубулина. (G и Н) Визуализация материнским производимого продукта в ранних эмбрионах. Sass6-mCherry белок из экзогенной мРНК вводили в стадии IV ооциты локализуется в центриолей. Объединенные изображения, показывающие вид на животных из 40 МПФ фиксированных blastodiscs, визуализированы с анти-гамма-тубулина антител выделить центросомами (зеленый), mCherry флуоресценцию, чтобы указать Sass6 (красный) и DAPI для обозначения ДНК (синий). (G) Выраженный Sass6-mCherry белок локализуется в очагах помечен центросомой маркерных гамма-тубулин на участках , фланкирующих ядро (стрелка). (Н др 3. Пожалуйста , нажмите здесь , чтобы посмотреть увеличенную версию этой фигуры.
| Этапы оогенеза | Диаметр ооцитов (мкм) | Ключевой ориентир (ы) |
| 1А - Prefollicle | От 7 до 20 | Начало активной транскрипции, накопление ядрышек |
| 1B - Фолликулостимулирующий | От 20 до 140 | Деконденсацию хромосом |
| II - Cortical альвеолы | От 140 до 340 | Кортикальные альвеолы производство |
| III - вителлогенез | 340 до 690 | Потемнение ооплазму путем накопления желтка предшественника белка и липидов |
| В начале IV - созревание ооцитов | 690 до 730 (нижний диапазон) | Асимметричная локализация зародышевого пузырька |
| В начале IV - созревание ооцитов | 690 до 730 (верхний диапазон) | Зародышевый пузырек исчезает, арест на стадии метафазы II |
| В - Зрелый ооците | ~ 750 | Ооплазма / желток становится прозрачным |
Таблица 1: Ориентиры ооцитов развития в Zebraрыба.
Discussion
Выше протокол для манипуляции генных продуктов до оплодотворения, таким образом, позволяя при изучении продуктов материнских генов в раннем данио эмбриона. Предыдущие исследования были в состоянии зрелых ооцитов в пробирке 4; этот протокол был изменен , чтобы для последующего оплодотворения в пробирке созревшей яйцеклетки 8. Это , в свою очередь , позволяет инъекции реагентов для функциональной манипуляции и визуализации матерински унаследованных продуктов в раннем эмбрионе 3. Эмбрионы в результате этого метода могут быть жизнеспособными и могут выжить, чтобы стать плодородными взрослыми. В предварительных экспериментах, примерно половина из оплодотворенных эмбрионов, полученных от этой процедуры была жизнеспособной на 5-е дня развития, по оценке инфляции плавательного пузыря на ту стадию, примерно половина из которых стали здоровыми, плодородными взрослые (неопубликованные наблюдения).
Есть целый рядиз важных шагов, чтобы рассмотреть в протоколе. Ооциты на соответствующем этапе, чтобы инициировать созревание (ранняя стадия IV) может быть обогащен, если женщина была повязана недавно, но не раньше, чем 8 ДПП. Использование рыбы , которые не повязаны в последнее время, может привести к вырождаются яйцами 14, которые не претерпевают созревание. Женщины повязаны в течение менее чем за 8 дней будут иметь большинство яиц на стадии III или меньше, и , таким образом, яйца не созреют должным образом в лабораторных условиях . Яичники у женщин, которые спаренные за 8 дней до будут иметь оптимальную долю ооцитов в ранней стадии IV. Они могут быть признаны их непрозрачностью и наличием GV в эксцентрической позиции (фигура 2В). Определение стадии ооцитов также может быть оказано помощь путем измерения размера, с ооцитами помещали на градуированный микрометр слайд под микроскопом , и по сравнению со стандартными руководящими принципами стадирования (таблица 1). Однако ранняя стадия IV ооциты имеют почти максимальный размер по сравнению с зрелымооциты (распознаваемые их относительная прозрачность и отсутствие GV; Рисунок 2C) и легко узнаваемы, как описаны выше, которые , как правило , устраняет необходимость прямого измерения размера ооцитов.
В пробирке созревания должна начаться в течение нескольких часов после окончания цикла дневного света , к которому приспособились женские доноры ооцитов. Яйцеклетки не созревают должным образом, отражается в низкой скорости оплодотворения, если культивировать в утренний период светового цикла. Причина циркадных зависимости от ооцитов в пробирке метода созревания не поняла , но , вероятно , отражает основные циркадные искажения в естественных условиях яичного созревания с участием велосипедной экспрессии генов во время оогенеза 21. Общая причина для ооцитов не суметь пройти успешным в пробирке созревания, несмотря на надлежащих ооцитах постановки является то , что ДГП истекло. DHP гормон обычно истекает через год, и, чтобы обеспечить эффектив созревание, рабочая партия должна быть заменено в течение 9 месяцев использования.
Инъекции ооцитов является еще одним важным шагом, когда цель метода является функциональной манипуляции материнских продуктов. Эта процедура имеет требование, которые отличаются от стандартных инъекций в оплодотворенной яйцеклетке в 0-30 МПФЕ. Ключевым фактором в инъекции ооцитов является необходимость проводить инъекции в условиях , которые не приводят к преждевременной активации яйца, например, в L-среде 15 Лейбовиц 22, 23. Потому что они встроены в яичниках, созревающие ооциты также создают особые проблемы для инъекций. Протокол выше предполагает первую диссоциацию ооцитов из яичников, а затем, держа друг диссоциированы ооцит отдельно пинцет при введении. Этот метод работает хорошо и позволяет предварительно сортировать ооциты на соответствующей стадии с минимальной обработкой. Альтернативные методы могут быть также использованы, напримеркак: я) размещение ооциты в стандартную инъекцию агарозного желоба 15, где вертикальные стенки опоры желоба ооцита во время инъекции (в этом альтернативном способе, ооциты должны быть переданы для инъекций пластин в то время хранится в экстракорпоральном созревании среды) и II ), что позволяет ооциты оставаться прикреплены к массе яичников, который можно удерживать с пинцетом во время инъекции, чтобы избежать контакта с закачиваемой ооцита (в данном подходе, ооциты должны быть отделены после инъекции и облегчения воздействия DHP и позволить их defolliculation , сам по себе важно для ЭКО). Несмотря на эту конкретную задачу, стадия IV ооциты могут быть легко проникали с инъекционной иглой, вероятно , потому , что хорионический мембрана на этой стадии не полностью развита 9.
Одним из ограничений текущего протокола созревания является то , что в лабораторных условиях созревания , которые способствуют правильному развитию ооцитовне может быть создано, когда созревание ооцитов инициируются на этапах раньше, чем стадия IV. Яйцеклетки стать компетентным , чтобы ответить на DHP, подвергаясь созревания , когда они достигают диаметра 520 мкм, которое происходит во время стадии III (вителлогенеза, что соответствует диапазону от 340 до 690-мкм) 9. Тем не менее, культура стадии III ооцитов результатов в ооцитах, которые не являются компетентными для оплодотворения 3. Только ооцитов в пробирке которого культура начинается на стадии IV (фиг 2В) может развиться в зрелые, этап V ооцитов (рис 2C и D). Это может быть связано с тем , что стадия III имеет важное значение для вителлогенеза и ооцитов роста 9. Таким образом, процедура пробирки созревания ооцитов в представленной в этой статье , должна быть использована только с начальным населением стадии IV ооциты (B), а не с ооцитами на более ранних стадиях (стадия I - III; Figur е
Другое ограничение в представленном способе является то, что defolliculation, что очень важно для последующих стадий, включающих оплодотворение, в настоящее время является лимитирующей стадия в процедуре. Фолликулярная мембрана представляет собой прозрачный слой, окружающий развивающийся ооцит, и удаление может быть утомительным. Если эта мембрана не полностью удалена, яйцо не будет полностью активирована и оплодотворены. Это стало очевидным провалом хориона расширения и развития неравномерно размещены, по бороздам-го типаructures (pseudocleavages), характерный для неоплодотворенных эмбрионов 11. Ферментативные методы defolliculation , такие как коллагеназы, используемая в Xenopus, были опробованы. Тем не менее, в наших руках, эта техника не была успешной, и поэтому мы полагаемся на ручной defolliculation. Поскольку руководство defolliculation является трудоемким и отнимающим много времени, трудно получить крупные партии оплодотворенных яиц после экстракорпорального созревания ооцитов. Из-за временного ограничения, введенного вручную defolliculation, мы в настоящее время оплодотворить несколько defolliculated, зрелые яйца, в то время, небольшими партиями по 5-10 яиц. Введение ферментного defolliculation с этой процедурой, вероятно, значительно повысить его производительность и общую простоту использования.
Хотя эмбрионы , полученные после оплодотворения -matured ооцитов в пробирке могут стать жизнеспособными взрослыми, мы отмечаем , что после оплодотворения в пробирке, доля эмбрионов делать не разъединять нормально или своевременно. Мы в настоящее время для выбора линий, включает в себя распространение раундов в пробирке созревания ооцитов, которые могут привести к более надежным моделям развития у эмбрионов , полученных с помощью этого метода.
Процедура позволила ясном спасения или визуализации локализации белка для ряда мутаций 24, 25. Тем не менее, для некоторых генов, регуляция экспрессии продукта может иметь решающее значение, так что продукты , выраженные впрыскиваемый мРНК могут привести к переменным результатам 26. Важно также иметь в виду все элементы управления (например, эмбрионы , инъецированные с реагентами , которые имеют аналогичные свойства, используемые в эксперименте , пока, по прогнозам, не производить эффект, таких как контроль ОЧ или РНК , кодирующих только для инертных белков, таких , в GFP), поскольку основная изменчивость может привести к неправильным выводам.
нт "> Подход с участием манипуляции в пробирке с последующим оплодотворением является особенно полезным в случае материнским осажденных продуктов, где стандартный метод инъекционного РНК, MOS, или белок в оплодотворенной яйцеклетки не может эффективно снижать продукцию уже накопленных в яйце. Другие недавно разработанные методы, такие как CRISPR-мутант поколение, также являются эффективными при создании мутантного условия для материнский экспрессируемых генов 26. Тем не менее, этот метод требует ростов нескольких поколений рыб. методика созревание ооцитов в пробирке позволяет быстро функциональную манипуляцию с изучения функции матерински экспрессируемых генов, в том числе аварийно-спасательных и фенокопии материнской-эффект мутаций, а также экспрессии РНК и белков в ранних эмбрионов.Disclosures
Авторы не имеют конкурирующих финансовых интересов.
Acknowledgments
Мы хотели бы поблагодарить членов лаборатории и рыбы управленческого персонала учреждения Пелегри, которые сыграли важную роль в содействии этому проекту. Поддержка данного проекта была предоставлена NIH R56 GM065303 и NIH 2 T32 GM007133 к РПД, NIH 5 F31 GM108449-02 и NIH 2 T32 GM007133 к CCE, и NIH RO1 GM065303 к FP
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
| NaCl | Sigma | S5886 | |
| KCl | Sigma | P5405 | |
| Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
| KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
| CaCl2 | Sigma | C7902 | |
| MgSO2-7H2O | Sigma | 63138 | |
| NaHCO2 | Sigma | S5761 | |
| Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
| Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
| Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
| Plastic spoon | available in most standard stores | ||
| Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
| Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
| Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
| Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
| Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
| Eppendorf tubes 1.5 mL | any maker | ||
| Ice bucket | any maker | ||
| Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
| Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
| Paper towels | any maker | ||
| Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
| Timer stop watch | any maker | ||
| Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
| beakers, 250 mL (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
| Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
| NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
| BSA | Sigma | A2058 | |
| 17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
| gentamicin | Sigma | G1272 | |
| Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
| Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
| Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
| Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips | any maker | ||
| Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips | any maker | ||
| Conical tubes 15 mL | any maker | ||
| Conical tubes 50 mL | any maker | ||
| plastic pipette 10 mL with bulb | any maker | ||
| plastic pipette 20 mL with bulb | any maker | ||
| Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
| Reagents for fish water: | |||
| Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
| Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
| Reagents for E3 medium: | |||
| NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
| KCl | Sigma | P5405-500G | |
| CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
| MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
| Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
| Fish Food: | |||
| Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
| Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |
References
- Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77 (4), 299-313 (2010).
- Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it's in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19 (4), 396-403 (2009).
- Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242 (1), 44-52 (2013).
- Selman, K., Petrino, T. R., Wallace, R. A. Experimental conditions for oocyte maturation in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Exp Zool. 269 (6), 538-550 (1994).
- Fauvel, C., Omnes, M. H., Suquet, M., Normant, Y. Reliable assessment of overripening in turbot (Scophtalmus maximus) by a simple pH measurement. Aquaculture. 117 (1-2), 107-113 (1993).
- Lahnsteiner, F., Weismann, T., Patzner, R. A. Composition of the ovarian fluid in 4 salmonid speices: Onchorhynchus mykiss, Salmo trutta flacustris, Salvelinus alpinus and Husho hucho. Reprod Nutr Dev. 35 (5), 465-474 (1995).
- Patiño, R., Bolamba, D., Thomas, P., Kumakura, N. Effects of external pH on hormonally regulated ovarian follicle maturation and ovulation in Atlantic croaker. Gen Comp Endocrinol. 141 (2), 126-134 (2005).
- Seki, S., et al. Development of a reliable in vitro maturation system for zebrafish oocytes. Reproduction. 135 (3), 285-292 (2008).
- Selman, K., Wallace, R. A., Sarka, A., Qi, X. Stages of oocyte development in the zebrafish, Brachydanio rerio. J Morphol. 218 (2), 203-224 (1993).
- Clelland, E., Peng, C. Endocrine/paracrine control of zebrafish ovarian development. Mol Cell Endocrinol. 312 (1-2), 42-52 (2009).
- Kane, D. A., Kimmel, C. B.
- Kanagaraj, P., et al. Souffle/Spastizin controls secretory vesicle maturation during zebrafish oogenesis. PLoS Genet. 10 (6), e1004449 (2014).
- Brand, M., Granato, M., Nüsslein-Volhard, C. Keeping and raising zebrafish,Zebrafish - A Practical Approach. Nüsslein-Volhard, C., Dahm, R. , Oxford University Press. Oxford. 7-37 (2002).
- Connoly, M. H., Dutkosky, R. M., Heah, T. P., Sayler, G. S., Henry, T. B. Temporal dynamics of oocyte growth and vitellogenin gene expression in zebrafish (Danio rerio). Zebrafish. 11 (2), 107-114 (2014).
- Rosen, J. N., Sweeney, M. F., Mably, J. D. Microinjection of zebrafish embryos to analyze gene function. J Vis Exp. (25), e1115 (2009).
- Pelegri, F., Mullins, M. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 104, 83-120 (2011).
- Baars, D. L., Takle, K. A., Heier, J., Pelegri, F. Ploidy manipulation of zebrafish embryos with Heat Shock 2 treatment. J Vis Exp. , (2016).
- Kimmel, C., Ballard, W. W., Kimmel, S. R., Ullman, B., Schilling, T. F.
- Eisen, J. S., Smith, J. C. Controlling morpholino experiments: don't stop making antisense. Development. 135 (10), 1735-1743 (2008).
- Schulte-Merker, S., Stainier, D. Y. R. Out with the old, in with the new: reassessing morpholino knockdowns in light of genome editing technology. Development. 141 (16), 3103-3104 (2014).
- Dekens, M. P. S., Santoriello, C., Vallone, D., Frassi, G., Whitmore, D., Foulkes, N. S. Light regulates the cell cycle in zebrafish. Curr Biol. 13 (23), 2051-2057 (2003).
- Sakai, N., Burgess, S., Hopkins, N. Delayed in vitro fertilization of zebrafish eggs in Hank's saline containing bovine serum albumin. Mol Mar Biotechnol. 6 (2), 84-87 (1997).
- Pelegri, F., Mullins, M. C. Genetic screens for mutations affecting adult traits and parental-effect genes. Meth Cell Biol. 135, (2016).
- Lindeman, R. E., Pelegri, F. Localized products of futile cycle/lrmp promote centrosome-nucleus attachment in the zebrafish zygote. Curr Biol. 22 (10), 843-851 (2012).
- Nair, S., Marlow, F., Abrams, E., Kapp, L., Mullins, M., Pelegri, F. The chromosomal passenger protein Birc5b organizes microfilaments and germ plasm in the zebrafish embryo. PLoS Genetics. 9 (4), e1003448 (2013).
- Eno, C., Solanki, B., Pelegri, F. aura (mid1ip1l) regulates the cytoskeleton at the zebrafish egg-to-embryo transition. Development. 143 (9), 1585-1599 (2016).
