Zebrafish मातृ जीन उत्पादों के हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया oocytes की इन विट्रो परिपक्वता के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया है।
सेलुलर घटनाओं है कि पशु भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान जगह ले माता के रूप में ली गई जीन के विकास डिम्बाणुजनकोशिका में जमा उत्पादों पर निर्भर है। क्योंकि इन घटनाओं मातृ उत्पादों जो आम तौर पर के बाद निषेचन-कि अंडे के अंदर पहले ही से देखना बहुत जल्द ही कार्य पर भरोसा करते हैं, अभिव्यक्ति और कार्यात्मक कम करने के लिए मानक विधियों निषेचित अंडा में अभिकर्मकों के इंजेक्शन से जुड़े आम तौर पर अप्रभावी कर रहे हैं। इसके बजाय, ऐसे जोड़तोड़ करने के लिए या मातृ उत्पादों के संचय के दौरान पहले, oogenesis दौरान किया जाना चाहिए। यह लेख अपरिपक्व zebrafish oocytes की इन विट्रो परिपक्वता और उनके बाद इन विट्रो निषेचन के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन, व्यवहार्य भ्रूण कि वयस्कता के लिए जीवित उपज। इस विधि में इस तरह के और प्ररूपी बचाव के लिए उत्पादों में चिह्नित निर्माण दृश्य, की अभिव्यक्ति के रूप oogenesis दौरान मातृ उत्पादों के कार्यात्मक हेरफेर की अनुमति देता है और साथ ही एकरिवर्स आनुवंशिकी एजेंटों के माध्यम से जीन समारोह की कमी है।
पशु विकास के दौरान, अंडा में मां जमा जीन उत्पादों (जैसे, आरएनए, प्रोटीन, व अन्य जैविक अणुओं); इन उत्पादों जल्दी कोशिकीय प्रक्रियाओं तुरंत निषेचन 1, 2 निम्नलिखित के लिए महत्वपूर्ण हैं। अभिव्यक्ति और मातृ उत्पादों के समारोह के हेरफेर आम तौर पर अप्रभावी जब निषेचित अंडे 3 में अभिकर्मकों के इंजेक्शन के लिए एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर रहा है। इसका कारण यह है सबसे RNAs और प्रोटीन oogenesis दौरान डिम्बाणुजनकोशिका द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, तो पहले से लोड मातृ उत्पादों को पहले से ही परिपक्व अंडे में मौजूद हैं है। इस तरह पहले से मौजूद उत्पादों, इस तरह के morpholino एंटिसेंस ओलिगोस (एमओएस) के रूप में जीन लक्ष्यीकरण एजेंटों, साथ कार्यात्मक नॉकडाउन अभेद्य होते हैं, क्योंकि राज्यमंत्री mRNA, नहीं पहले से मौजूद प्रोटीन पहले से ही निषेचन पर अंडे में मौजूद लक्ष्य। इसके अलावा, कई जल्दी भ्रूण प्रक्रियाओं हो बहुत जल्दी के बाद निषेचन प्रभावों जैसे किया जाना है, निषेचित अंडे में इंजेक्शन शाही सेना से प्राप्त प्रोटीन उत्पादों द्वारा ced के रूप में शाही सेना काफी तेजी से उत्पादन नहीं किया जा सकता है embryogenesis की पहली घटनाओं को प्रभावित करने के लिए। उसी कारण से, निषेचित अंडे में एक mRNA इंजेक्शन के माध्यम से व्यक्त जल्दी भ्रूण में उनकी सक्रिय भूमिका दौरान दृश्य के लिए समय में उत्पादन नहीं किया जा सकता है प्रोटीन fusions टैग किया। अंडा सक्रियण से पहले extruded परिपक्व oocytes में इंजेक्शन के लिए संभव है लेकिन इसी तरह के तकनीकी मुद्दों से संबद्ध है: इस तरह के परिपक्व अंडे पहले से ही मातृ प्रोटीन के साथ पहले से लोड कर रहे हैं, और वे translationally सक्रिय नहीं हो जाएगा (यानी, बहिर्जात टेप से प्रोटीन का उत्पादन) अंडे के बाद तक सक्रियण। इन कारणों से, जल्दी embryogenesis में अभिनय मातृ जीन उत्पादों के हेरफेर आम तौर पर परिपक्व डिम्बाणुजनकोशिका में oogenesis दौरान बाहर किया जाना चाहिए।
इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण है, इन विट्रो परिपक्वता विधियों, जो OOC की परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं के रूप मेंytes चतुर्थ चरण से अंडा गठन के लिए, zebrafish में स्थापित किया गया है। प्रारंभिक तरीकों इन विट्रो परिपक्वता में अनुमति दी है, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप परिपक्व अंडे निषेचन 4 के लिए सक्षम नहीं थे। बाद में, पीएच 9.0 करने के लिए तटस्थ से संस्कृति की स्थिति में हेरफेर, इन विट्रो परिपक्वता 7, 8 के बाद मछली प्रजातियों 5, 6 में पाया डिम्बग्रंथि तरल पदार्थ की क्षारीय पीएच, विश्वसनीय इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) के लिए अनुमति दी नकल उतार। दरअसल, इन विट्रो -matured oocytes व्यवहार्य भ्रूण कि वयस्कता के लिए जीवित रहते हैं और कि उपजाऊ 3, 8 हैं उपज कर सकते हैं। इस बेहतर विधि आगे चटाई में नीचे दस्तक मातृ जीन के कार्यात्मक हेरफेर, बहिर्जात अभिव्यक्ति के माध्यम से zebrafish oogenesis दौरान टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति, और शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया है कार्यात्मक एमओ की मध्यस्थताuring चतुर्थ चरण oocytes 3 (चित्रा 1)।
Zebrafish oogenesis परिपक्व oocytes 9 (oogenesis में विभिन्न चरणों की एक त्वरित मार्गदर्शिका के लिए तालिका 1 देखें) के निर्माण का नेतृत्व विशेषता चरणों का एक संख्या दर्शाती है। संक्षेप में, डिम्बाणुजनकोशिका विकास के चरण मैं oocytes द्वारा की जा रही है और अर्धसूत्रीविभाजन के प्रोफेज़ मैं की diplotene चरण में गिरफ्तार किया गया है। ये oocytes, cortical एल्वियोली के गठन (यह भी cortical कणिकाओं, द्वितीय चरण के दौरान शुरू किए गए के रूप में जाना जाता है) (चरणों आइए और आईबी के दौरान शुरू की) सक्रिय प्रतिलेखन के माध्यम से विकास, और vitellogenesis (तृतीय चरण के दौरान शुरू की) गुज़रना पड़ता है। डिम्बाणुजनकोशिका विकास चतुर्थ चरण, जब अर्धसूत्रीविभाजन मैं शुरू, डिम्बाणुजनकोशिका नाभिक के disassembly में जिसके परिणामस्वरूप, कीटाणु पुटिका (जीवी) के रूप में भेजा दौरान पूरा हो गया। बाद में, अर्धसूत्रीविभाजन मेटाफ़ेज़ द्वितीय पर फिर से गिरफ्तार किया गया है। चतुर्थ चरण के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका विकास और अर्धसूत्रीविभाजनिक गिरफ्तारी के पूरा होने के एक परिपक्व चरण वी जैसे की ओर जाता हैजी 9। कूपिक झिल्ली को हटाने अंडाशय 10 के लुमेन में डिम्बाणुजनकोशिका की रिहाई के दौरान होता है और निषेचन और उचित अंडा क्रियान्वयन के लिए आवश्यक है। एक बार अंडे प्राकृतिक संभोग के दौरान मां से चली जाती हैं, वे ही सक्रिय हो जाते हैं। Zebrafish में, पानी के संपर्क में शुक्राणु 11 की उपस्थिति की परवाह किए बिना पूरा अंडा क्रियान्वयन के लिए पर्याप्त है,।
इन विट्रो परिस्थितियों में वर्तमान में प्रारंभिक चरण से oocytes की परिपक्वता चतुर्थ जो के संचय के कारण उनके आकार (690-730 सुक्ष्ममापी), एक असममित स्थिति में एक बड़ी जीवी की उपस्थिति, और एक पूरी तरह से अपारदर्शी उपस्थिति से पहचाना जा सकता के लिए अनुमति जर्दी प्रोटीन (चित्रा 2 बी) परिपक्व चरण वी अंडा करने वाली, एक पूरी तरह से disassembled जीवी और प्रोटीन प्रसंस्करण 12 (चित्रा 2C) की जर्दी के कारण एक पारदर्शी उपस्थिति की विशेषता। इस दृष्टिकोण में, पूरे अंडाशय शेष भागविकास के विभिन्न चरणों में aining oocytes महिलाओं से निकाल दिए जाते हैं। Oocytes 17α-20β-dihydroxy -4 pregnen-3-वन (DHP), एक प्रभावी परिपक्वता-उत्प्रेरण हार्मोन 8 में विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। इस अवधि के दौरान परिपक्व oocytes अभिव्यक्ति के इंजेक्शन (जैसे, छाया हुआ, इन विट्रो -transcribed mRNAs) या रिवर्स आनुवंशिकी एजेंट (जैसे, एमओएस) के माध्यम से चालाकी से किया जा सकता है। कूपिक परत अनायास परिपक्वता अवधि के अंत में शेड नहीं है, इसलिए इसे मैन्युअल रूप से हटा दिया जाना चाहिए। Defolliculation के बाद, इन विट्रो निषेचन पानी (भ्रूण (ई 3) मध्यम में अब तक) से 13 अंडे के जोखिम और एक शुक्राणु समाधान के माध्यम से अंडे सक्रियण ट्रिगर द्वारा हासिल की है। जिसके परिणामस्वरूप युग्मनज भ्रूण के विकास से गुजरना और उपचार की क्षमता मातृ जीन समारोह में हेरफेर करने के मूल्यांकन के लिए और दृश्य और टैग मातृ उत्पादों के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं ( <strong> चित्रा 3)।
ऊपर प्रोटोकॉल इस प्रकार जल्दी zebrafish भ्रूण में मातृ जीन उत्पादों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, निषेचन से पहले जीन उत्पादों के हेरफेर के लिए है। पिछले अध्ययनों से इन विट्रो 4 में oocytes परिपक्व करने में सक्षम है; इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो निषेचन के बाद परिपक्व oocytes 8 के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया था। यह बदले में जल्दी भ्रूण 3 में कार्यात्मक हेरफेर और माता के रूप में विरासत में मिला उत्पादों के दृश्य के लिए अभिकर्मकों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है। इस विधि से उत्पन्न भ्रूण व्यवहार्य हो सकता है और उपजाऊ वयस्कों बनने के लिए जीवित रह सकते हैं। प्रारंभिक प्रयोगों में, इस प्रक्रिया से प्राप्त निषेचित भ्रूण के लगभग आधे के रूप में उस समय लगभग आधा जिनमें से स्वस्थ, उपजाऊ वयस्कों (अप्रकाशित टिप्पणियों) बन गया पर तैरने मूत्राशय मुद्रास्फीति द्वारा मूल्यांकन, विकास के 5 दिन पर व्यवहार्य थे।
एक संख्या हैंके महत्वपूर्ण चरणों प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए। उचित स्तर पर Oocytes परिपक्वता (प्रारंभिक चरण चतुर्थ) शुरू करने के लिए समृद्ध किया जा सकता है, तो महिला ने हाल ही में mated गया है, लेकिन 8 से पहले नहीं डीपीपी। मछली है कि हाल ही में mated नहीं किया है का उपयोग करते हुए अंडे 14 है, जो परिपक्वता नहीं गुजरना होगा degenerating हो सकती है। कम से कम 8 दिनों के भीतर mated महिलाओं चरण III या उससे कम पर अंडे के बहुमत होगा, और इस तरह, अंडे इन विट्रो में ठीक से परिपक्व नहीं होंगे। महिलाओं है कि 8 दिन पहले mated में अंडाशय प्रारंभिक चरण चतुर्थ में oocytes की एक इष्टतम अंश होगा। ये उनके अस्पष्टता और एक विलक्षण स्थिति (चित्रा 2 बी) में जी.वी. की मौजूदगी से पहचाना जा सकता है। डिम्बाणुजनकोशिका चरण दृढ़ संकल्प भी, आकार माप द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है के साथ oocytes एक खुर्दबीन के नीचे एक स्नातक की उपाधि प्राप्त माइक्रोमीटर स्लाइड पर रखा और मानक मचान दिशा निर्देशों (तालिका 1) की तुलना में। हालांकि, प्रारंभिक चरण चतुर्थ oocytes के पास अधिक से अधिक आकार परिपक्व की तुलना मेंoocytes (उनके रिश्तेदार पारदर्शिता और एक जीवी की कमी के द्वारा मान्यता प्राप्त, चित्रा 2C) और आसानी से पहचाने जाते हैं जैसा कि ऊपर वर्णित है, जो आम तौर पर एक सीधा डिम्बाणुजनकोशिका आकार माप की जरूरत obviates।
इन विट्रो परिपक्वता में दिन के उजाले चक्र महिला डिम्बाणुजनकोशिका दाताओं अनुकूलित कर रहे हैं जो करने के लिए के अंत के कई घंटे के भीतर शुरू होगा। Oocytes ठीक से परिपक्व नहीं होगा, गरीब निषेचन दरों में परिलक्षित करता है, तो प्रकाश चक्र की सुबह की अवधि के दौरान संवर्धित किया। इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता विधि के circadian निर्भरता का कारण समझ नहीं है लेकिन संभावना oogenesis 21 के दौरान साइकिल जीन की अभिव्यक्ति से जुड़े इन विवो अंडा परिपक्वता में अंतर्निहित circadian पूर्वाग्रहों को दर्शाता है। उचित डिम्बाणुजनकोशिका मचान के बावजूद इन विट्रो परिपक्वता में सफल गुजरना करने में नाकाम रहने के लिए oocytes एक आम कारण है कि DHP हो गई है। DHP हार्मोन आम तौर पर एक वर्ष के बाद समाप्त हो रहा है, और प्रभाव का बीमा करने केIve परिपक्वता, काम बैच उपयोग की 9 महीनों के भीतर बदल दिया जाना चाहिए।
oocytes की इंजेक्शन एक और महत्वपूर्ण कदम है जब विधि के प्रयोजन के मातृ उत्पादों के कार्यात्मक हेरफेर है। यह प्रक्रिया आवश्यकताओं कि 0-30 MPF में निषेचित अंडे में मानक इंजेक्शन के लिए उन लोगों से अलग है। डिम्बाणुजनकोशिका इंजेक्शन में एक प्रमुख कारक की स्थिति, इस तरह के लेबोविट्ज़ के एल 15 मध्यम 22, 23 में के रूप में है कि समय से पहले अंडा सक्रियण की ओर नहीं ले के तहत इंजेक्शन बाहर ले जाने की जरूरत है। क्योंकि वे अंडाशय में एम्बेडेड रहे हैं, परिपक्व oocytes भी इंजेक्शन के लिए विशेष चुनौती। प्रोटोकॉल ऊपर पहले अंडाशय से oocytes अलग कर और फिर पकड़े प्रत्येक संदंश के साथ अलग से डिम्बाणुजनकोशिका अलग जबकि इंजेक्शन लगाने का सुझाव देते हैं। इस तकनीक को कम से कम से निपटने के साथ उचित स्तर पर अच्छी तरह से काम किया है और पूर्व छँटाई oocytes की अनुमति देता है है। वैकल्पिक तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह केके रूप में: i) मानक इंजेक्शन में रखने oocytes agarose troughs 15, जहां गर्त समर्थन इंजेक्शन के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका के ऊर्ध्वाधर दीवारों (यह वैकल्पिक पद्धति में, oocytes जबकि इन विट्रो परिपक्वता मध्यम में रखा इंजेक्शन प्लेटों को हस्तांतरित करने की जरूरत है) और ii ) की इजाजत दी oocytes डिम्बग्रंथि बड़े पैमाने पर है, जो संदंश के साथ इंजेक्शन के दौरान आयोजित किया जा सकता (इस दृष्टिकोण में इंजेक्शन डिम्बाणुजनकोशिका के साथ संपर्क से बचने के लिए से जुड़ी, oocytes दोनों को इंजेक्शन के बाद अलग किया जाना चाहिए DHP जोखिम को सुविधाजनक बनाने के रहने के लिए और उनके defolliculation अनुमति देने के लिए , जो अपने आप आईवीएफ के लिए आवश्यक)। इस विशिष्ट चुनौती के बावजूद, चतुर्थ चरण oocytes आसानी से, एक इंजेक्शन की सुई के साथ प्रवेश किया जा सकता है की संभावना है क्योंकि इस स्तर पर कोरियोनिक झिल्ली पूरी तरह से 9 विकसित नहीं है।
वर्तमान परिपक्वता प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि इन विट्रो परिपक्वता की स्थिति में है कि उचित डिम्बाणुजनकोशिका विकास को बढ़ावा देने हैजब डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता चतुर्थ चरण की तुलना में प्रारंभिक चरणों में शुरू किया जाता है नहीं बनाया जा सकता। Oocytes परिपक्वता के दौर से गुजर द्वारा DHP पर प्रतिक्रिया के लिए सक्षम हो जाते हैं जब वे 520 सुक्ष्ममापी के एक व्यास, जो तृतीय चरण के दौरान होता है (vitellogenesis, 340-टू-690-सुक्ष्ममापी रेंज के लिए इसी) तक पहुँचने 9। हालांकि, oocytes कि निषेचन 3 के लिए सक्षम नहीं हैं में तृतीय चरण oocytes परिणामों की संस्कृति। केवल जिसका इन विट्रो संस्कृति चतुर्थ चरण (चित्रा 2 बी) पर शुरू किया जाता है परिपक्व, चरण वी oocytes (चित्रा 2C और डी) में विकसित हो सकता oocytes। यह तथ्य यह है कि तृतीय चरण vitellogenesis और डिम्बाणुजनकोशिका वृद्धि 9 के लिए आवश्यक है से संबंधित हो सकता। इस प्रकार, इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता इस लेख में प्रस्तुत प्रक्रिया केवल चतुर्थ oocytes (बी), और न प्रारंभिक चरणों में oocytes (चरणों मैं के साथ मंच का कोई आरंभिक आबादी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए – तृतीय, Figur ई <strओंग> 2 ए)। उसी कारण से, इस प्रक्रिया जीन है कि चतुर्थ चरण या बाद में व्यक्त कर रहे हैं तक सीमित है। जीन जिसके उत्पाद पहले व्यक्त कर रहे हैं के कार्यात्मक हेरफेर बजाय आनुवंशिक तरीकों (नीचे देखें) का सहारा लेना पड़ सकता है। इन विट्रो संस्कृति परिपक्वता तरीकों में सुधार भविष्य में प्रारंभिक चरणों में डिम्बाणुजनकोशिका संवर्धन की शुरुआत के लिए अनुमति दे सकता है, इस प्रकार इन विट्रो परिपक्वता दृष्टिकोण की शक्ति का विस्तार।
प्रस्तुत विधि में एक और सीमा यह है कि defolliculation, जो बाद में निषेचन को शामिल चरणों के लिए आवश्यक है, वर्तमान में प्रक्रिया में एक दर सीमित कदम है। कूपिक झिल्ली एक पारदर्शी विकासशील डिम्बाणुजनकोशिका आसपास परत है, और हटाने थकाऊ हो सकता है। इस झिल्ली को पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, तो अंडा पूरी तरह से सक्रिय है और निषेचित नहीं हो पाएगी। यह जरायु की विफलता का विस्तार करने और अनियमित रखा, कुंड की तरह सेंट के विकास के द्वारा स्पष्ट किया गया हैructures (pseudocleavages), unfertilized भ्रूण 11 की विशेषता। इस तरह के कोलैजिनेज़ के रूप में एंजाइमी defolliculation तरीकों, के रूप में Xenopus में इस्तेमाल किया, कोशिश की गई है। हालांकि, हमारे हाथों में, इस तकनीक नहीं सफल रहा है, और इसलिए हम पुस्तिका defolliculation पर भरोसा करते हैं। क्योंकि पुस्तिका defolliculation श्रम प्रधान और समय लेने है, यह इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के बाद निषेचित अंडे के बड़े बैच प्राप्त करना कठिन है। मैनुअल defolliculation द्वारा लगाए गए अस्थायी सीमा के कारण, हम वर्तमान में एक समय में कुछ defolliculated, परिपक्व अंडे खाद, 5-10 अंडे के छोटे समूहों में। इस प्रक्रिया के साथ एंजाइमी defolliculation के समावेश की संभावना काफी इसकी उपज और उपयोग के समग्र आसानी वृद्धि होगी।
इन विट्रो -matured oocytes की निषेचन के बाद उत्पादित भ्रूण व्यवहार्य वयस्कों बन सकती है, हमने ध्यान दें कि इन विट्रो निषेचन के बाद, भ्रूण का एक अंश करना सामान्य रूप से या एक समय पर फैशन में विभाजित नहीं। वर्तमान में हम लाइनों जिसका प्रचार इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौर है, जो इस पद्धति के माध्यम से ली गई भ्रूण में विकास के और अधिक मजबूत पैटर्न में हो सकता है शामिल है के लिए चयन कर रहे हैं।
प्रक्रिया स्पष्ट बचाव या प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य म्यूटेशन 24, 25 के एक नंबर के लिए के लिए अनुमति दी गई है। हालांकि, कुछ जीनों के लिए, उत्पाद अभिव्यक्ति के नियमन महत्वपूर्ण, हो सकता है तो इंजेक्शन mRNA के द्वारा व्यक्त उत्पादों अलग-अलग परिणाम 26 को जन्म दे सकती। यह भी सभी नियंत्रण (जैसे, इस तरह के नियंत्रण राज्यमंत्री के रूप में अभिकर्मकों प्रयोग अभी तक भविष्यवाणी कर रहे हैं में इस्तेमाल किया उन लोगों के समान गुण होते हैं कि एक प्रभाव का उत्पादन नहीं करने के लिए, या RNAs केवल निष्क्रिय प्रोटीन के लिए कोडिंग के साथ इंजेक्शन भ्रूण, इस तरह के प्रति जागरूक होना महत्वपूर्ण है GFP के रूप में), अंतर्निहित परिवर्तनशीलता अनुचित निष्कर्ष को जन्म दे सकती है।
NT "> इन विट्रो निषेचन में गड़बड़ी के बाद से जुड़े एक दृष्टिकोण माता के रूप में जमा उत्पादों, जहां शाही सेना, राज्यमंत्री, या प्रोटीन इंजेक्शन लगाने निषेचित अंडे में कर सकते हैं प्रभावी रूप से उत्पादों को कम नहीं की मानक पद्धति पहले से ही अंडे में जमा करने के मामले में विशेष रूप से उपयोगी है। इस तरह के CRISPR-उत्परिवर्ती पीढ़ी के रूप में अन्य हाल ही में विकसित तरीकों में भी माता के रूप में व्यक्त जीनों 26 के लिए उत्परिवर्ती की स्थिति पैदा करने में प्रभावी रहे हैं। हालांकि, इस विधि मछली की कई पीढ़ियों के विकास की आवश्यकता है। इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता तकनीक को तेजी से कार्यात्मक हेरफेर के लिए अनुमति देता है बचाव और मातृ-प्रभाव परिवर्तन के phenocopy, साथ ही जल्दी भ्रूण में शाही सेना और प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित माता के रूप में व्यक्त जीनों के समारोह का अध्ययन।The authors have nothing to disclose.
हम Pelegri प्रयोगशाला और मछली सुविधा प्रबंधकीय स्टाफ, जो इस परियोजना को सुविधाजनक बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस परियोजना के लिए समर्थन एनआईएच R56 GM065303 और ELW को एनआईएच 2 T32 GM007133, एनआईएच 5 F31 GM108449-02 और एनआईएच 2 T32 GM007133 सीसीई के लिए, और एनआईएच RO1 GM065303 एफपी करने द्वारा प्रदान किया गया
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |