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Developmental Biology

मातृ जीन उत्पाद के कार्यात्मक हेरफेर का उपयोग करना doi: 10.3791/55213 Published: April 22, 2017
* These authors contributed equally

Summary

Zebrafish मातृ जीन उत्पादों के हेरफेर के लिए इस्तेमाल किया oocytes की इन विट्रो परिपक्वता के लिए एक अनुकूलित प्रोटोकॉल यहाँ प्रस्तुत किया है।

Abstract

सेलुलर घटनाओं है कि पशु भ्रूण के विकास के प्रारंभिक चरणों के दौरान जगह ले माता के रूप में ली गई जीन के विकास डिम्बाणुजनकोशिका में जमा उत्पादों पर निर्भर है। क्योंकि इन घटनाओं मातृ उत्पादों जो आम तौर पर के बाद निषेचन-कि अंडे के अंदर पहले ही से देखना बहुत जल्द ही कार्य पर भरोसा करते हैं, अभिव्यक्ति और कार्यात्मक कम करने के लिए मानक विधियों निषेचित अंडा में अभिकर्मकों के इंजेक्शन से जुड़े आम तौर पर अप्रभावी कर रहे हैं। इसके बजाय, ऐसे जोड़तोड़ करने के लिए या मातृ उत्पादों के संचय के दौरान पहले, oogenesis दौरान किया जाना चाहिए। यह लेख अपरिपक्व zebrafish oocytes की इन विट्रो परिपक्वता और उनके बाद इन विट्रो निषेचन के लिए एक प्रोटोकॉल का विस्तार से वर्णन, व्यवहार्य भ्रूण कि वयस्कता के लिए जीवित उपज। इस विधि में इस तरह के और प्ररूपी बचाव के लिए उत्पादों में चिह्नित निर्माण दृश्य, की अभिव्यक्ति के रूप oogenesis दौरान मातृ उत्पादों के कार्यात्मक हेरफेर की अनुमति देता है और साथ ही एकरिवर्स आनुवंशिकी एजेंटों के माध्यम से जीन समारोह की कमी है।

Introduction

पशु विकास के दौरान, अंडा में मां जमा जीन उत्पादों (जैसे, आरएनए, प्रोटीन, व अन्य जैविक अणुओं); इन उत्पादों जल्दी कोशिकीय प्रक्रियाओं तुरंत निषेचन 1, 2 निम्नलिखित के लिए महत्वपूर्ण हैं। अभिव्यक्ति और मातृ उत्पादों के समारोह के हेरफेर आम तौर पर अप्रभावी जब निषेचित अंडे 3 में अभिकर्मकों के इंजेक्शन के लिए एक मानक दृष्टिकोण का उपयोग कर रहा है। इसका कारण यह है सबसे RNAs और प्रोटीन oogenesis दौरान डिम्बाणुजनकोशिका द्वारा उत्पादित कर रहे हैं, तो पहले से लोड मातृ उत्पादों को पहले से ही परिपक्व अंडे में मौजूद हैं है। इस तरह पहले से मौजूद उत्पादों, इस तरह के morpholino एंटिसेंस ओलिगोस (एमओएस) के रूप में जीन लक्ष्यीकरण एजेंटों, साथ कार्यात्मक नॉकडाउन अभेद्य होते हैं, क्योंकि राज्यमंत्री mRNA, नहीं पहले से मौजूद प्रोटीन पहले से ही निषेचन पर अंडे में मौजूद लक्ष्य। इसके अलावा, कई जल्दी भ्रूण प्रक्रियाओं हो बहुत जल्दी के बाद निषेचन प्रभावों जैसे किया जाना है, निषेचित अंडे में इंजेक्शन शाही सेना से प्राप्त प्रोटीन उत्पादों द्वारा ced के रूप में शाही सेना काफी तेजी से उत्पादन नहीं किया जा सकता है embryogenesis की पहली घटनाओं को प्रभावित करने के लिए। उसी कारण से, निषेचित अंडे में एक mRNA इंजेक्शन के माध्यम से व्यक्त जल्दी भ्रूण में उनकी सक्रिय भूमिका दौरान दृश्य के लिए समय में उत्पादन नहीं किया जा सकता है प्रोटीन fusions टैग किया। अंडा सक्रियण से पहले extruded परिपक्व oocytes में इंजेक्शन के लिए संभव है लेकिन इसी तरह के तकनीकी मुद्दों से संबद्ध है: इस तरह के परिपक्व अंडे पहले से ही मातृ प्रोटीन के साथ पहले से लोड कर रहे हैं, और वे translationally सक्रिय नहीं हो जाएगा (यानी, बहिर्जात टेप से प्रोटीन का उत्पादन) अंडे के बाद तक सक्रियण। इन कारणों से, जल्दी embryogenesis में अभिनय मातृ जीन उत्पादों के हेरफेर आम तौर पर परिपक्व डिम्बाणुजनकोशिका में oogenesis दौरान बाहर किया जाना चाहिए।

इन बाधाओं पर काबू पाने के लिए एक दृष्टिकोण है, इन विट्रो परिपक्वता विधियों, जो OOC की परिपक्वता के लिए अनुमति देते हैं के रूप मेंytes चतुर्थ चरण से अंडा गठन के लिए, zebrafish में स्थापित किया गया है। प्रारंभिक तरीकों इन विट्रो परिपक्वता में अनुमति दी है, लेकिन जिसके परिणामस्वरूप परिपक्व अंडे निषेचन 4 के लिए सक्षम नहीं थे। बाद में, पीएच 9.0 करने के लिए तटस्थ से संस्कृति की स्थिति में हेरफेर, इन विट्रो परिपक्वता 7, 8 के बाद मछली प्रजातियों 5, 6 में पाया डिम्बग्रंथि तरल पदार्थ की क्षारीय पीएच, विश्वसनीय इन विट्रो निषेचन (आईवीएफ) के लिए अनुमति दी नकल उतार। दरअसल, इन विट्रो -matured oocytes व्यवहार्य भ्रूण कि वयस्कता के लिए जीवित रहते हैं और कि उपजाऊ 3, 8 हैं उपज कर सकते हैं। इस बेहतर विधि आगे चटाई में नीचे दस्तक मातृ जीन के कार्यात्मक हेरफेर, बहिर्जात अभिव्यक्ति के माध्यम से zebrafish oogenesis दौरान टैग किए गए प्रोटीन की अभिव्यक्ति, और शामिल करने के लिए अनुकूलित किया गया है कार्यात्मक एमओ की मध्यस्थताuring चतुर्थ चरण oocytes 3 (चित्रा 1)।

Zebrafish oogenesis परिपक्व oocytes 9 (oogenesis में विभिन्न चरणों की एक त्वरित मार्गदर्शिका के लिए तालिका 1 देखें) के निर्माण का नेतृत्व विशेषता चरणों का एक संख्या दर्शाती है। संक्षेप में, डिम्बाणुजनकोशिका विकास के चरण मैं oocytes द्वारा की जा रही है और अर्धसूत्रीविभाजन के प्रोफेज़ मैं की diplotene चरण में गिरफ्तार किया गया है। ये oocytes, cortical एल्वियोली के गठन (यह भी cortical कणिकाओं, द्वितीय चरण के दौरान शुरू किए गए के रूप में जाना जाता है) (चरणों आइए और आईबी के दौरान शुरू की) सक्रिय प्रतिलेखन के माध्यम से विकास, और vitellogenesis (तृतीय चरण के दौरान शुरू की) गुज़रना पड़ता है। डिम्बाणुजनकोशिका विकास चतुर्थ चरण, जब अर्धसूत्रीविभाजन मैं शुरू, डिम्बाणुजनकोशिका नाभिक के disassembly में जिसके परिणामस्वरूप, कीटाणु पुटिका (जीवी) के रूप में भेजा दौरान पूरा हो गया। बाद में, अर्धसूत्रीविभाजन मेटाफ़ेज़ द्वितीय पर फिर से गिरफ्तार किया गया है। चतुर्थ चरण के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका विकास और अर्धसूत्रीविभाजनिक गिरफ्तारी के पूरा होने के एक परिपक्व चरण वी जैसे की ओर जाता हैजी 9। कूपिक झिल्ली को हटाने अंडाशय 10 के लुमेन में डिम्बाणुजनकोशिका की रिहाई के दौरान होता है और निषेचन और उचित अंडा क्रियान्वयन के लिए आवश्यक है। एक बार अंडे प्राकृतिक संभोग के दौरान मां से चली जाती हैं, वे ही सक्रिय हो जाते हैं। Zebrafish में, पानी के संपर्क में शुक्राणु 11 की उपस्थिति की परवाह किए बिना पूरा अंडा क्रियान्वयन के लिए पर्याप्त है,।

इन विट्रो परिस्थितियों में वर्तमान में प्रारंभिक चरण से oocytes की परिपक्वता चतुर्थ जो के संचय के कारण उनके आकार (690-730 सुक्ष्ममापी), एक असममित स्थिति में एक बड़ी जीवी की उपस्थिति, और एक पूरी तरह से अपारदर्शी उपस्थिति से पहचाना जा सकता के लिए अनुमति जर्दी प्रोटीन (चित्रा 2 बी) परिपक्व चरण वी अंडा करने वाली, एक पूरी तरह से disassembled जीवी और प्रोटीन प्रसंस्करण 12 (चित्रा 2C) की जर्दी के कारण एक पारदर्शी उपस्थिति की विशेषता। इस दृष्टिकोण में, पूरे अंडाशय शेष भागविकास के विभिन्न चरणों में aining oocytes महिलाओं से निकाल दिए जाते हैं। Oocytes 17α-20β-dihydroxy -4 pregnen-3-वन (DHP), एक प्रभावी परिपक्वता-उत्प्रेरण हार्मोन 8 में विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। इस अवधि के दौरान परिपक्व oocytes अभिव्यक्ति के इंजेक्शन (जैसे, छाया हुआ, इन विट्रो -transcribed mRNAs) या रिवर्स आनुवंशिकी एजेंट (जैसे, एमओएस) के माध्यम से चालाकी से किया जा सकता है। कूपिक परत अनायास परिपक्वता अवधि के अंत में शेड नहीं है, इसलिए इसे मैन्युअल रूप से हटा दिया जाना चाहिए। Defolliculation के बाद, इन विट्रो निषेचन पानी (भ्रूण (ई 3) मध्यम में अब तक) से 13 अंडे के जोखिम और एक शुक्राणु समाधान के माध्यम से अंडे सक्रियण ट्रिगर द्वारा हासिल की है। जिसके परिणामस्वरूप युग्मनज भ्रूण के विकास से गुजरना और उपचार की क्षमता मातृ जीन समारोह में हेरफेर करने के मूल्यांकन के लिए और दृश्य और टैग मातृ उत्पादों के विश्लेषण के लिए अनुमति देते हैं (

Protocol

के रूप में प्रासंगिक राष्ट्रीय और / या स्थानीय पशु कल्याण निकायों द्वारा परिभाषित सभी zebrafish, अच्छा पशु अभ्यास के साथ सख्त अनुसार संभाली जा रही थीं, और सभी जानवर काम उचित समिति (विस्कॉन्सिन-मैडिसन आश्वासन संख्या A3368-01 विश्वविद्यालय) द्वारा अनुमोदित किया गया। पशु 26.5 डिग्री सेल्सियस पर मानक परिस्थितियों में बनाए रखा गया था।

1. महिलाओं की पूर्व चयन

नोट: (चित्र 2) Oocytes वयस्क महिलाओं में आम तौर पर, विकास के चरणों की एक सीमा अवधि मंच से मैं वी के लिए। एक सफल प्राकृतिक संभोग के माध्यम से पहले से मौजूद oocytes की महिलाओं के शुद्धिकरण डिम्बाणुजनकोशिका मचान के तुल्यकालन बढ़ जाती है, के रूप में नव विकसित oocytes एक पलटन 3, 14 के रूप में दिखाई देते हैं। के बारे में 8 दिन बाद पर्ज के भीतर, सबसे oocytes प्रारंभिक चरण चतुर्थ, जो इन विट्रो परिपक्वता की दीक्षा के लिए इष्टतम है में हैं। इस तरह के तुल्यकालन oocytes था की उपज बढ़ जाती हैटी इन विट्रो परिपक्वता की पूरी प्रक्रिया के माध्यम से जा सकते हैं, प्रयोगात्मक हेरफेर की सुविधा। बनती संभोग में और मछली पानी संरचना (यहाँ पर मछली की स्थापना पर जानकारी के लिए पिछले विवरण 13 देखें, सागर नमक की 14 ग्राम और प्रति रिवर्स ऑस्मोसिस पानी के 1,000 एल 3 NaHCO की 150 ग्राम, पीएच 6.5-8.5 (पसंदीदा रेंज: 6.8 -7.5) और 180-360 μS की चालकता)। ब्रांड एट अल देखें। अतिरिक्त व्यंजनों के लिए 13।

  1. आठ से दस दिनों में इन विट्रो संस्कृति में गड़बड़ी करने से पहले, एक संभोग टैंक के लिए एक एकल पुरुष और वांछित तनाव का एक मादा मछली हस्तांतरण करने के लिए एक मछली जाल का उपयोग करें। जोड़ी एकाधिक सेट। उन्हें संभोग टैंक रात भर में छोड़ दें। उन्हें शाम के दौरान और अगले दिन की दोपहर के माध्यम से संभोग करने की अनुमति दें।
  2. महिलाओं है कि संभोग के दौरान अंडे उपज और उन्हें एक अलग टैंक में जगह अलग करने के लिए एक मछली जाल का प्रयोग करें। एक खाद्य मिश्रण के साथ दिन में दो बार इन महिलाओं फ़ीड containiनमकीन चिंराट और मछली खाना गुच्छे के लगभग बराबर संख्या में एनजी। भोजन की मात्रा लगभग 20 मिनट है, लेकिन अधिक नहीं, खिला समय की उपलब्ध कराने के लिए पर्याप्त होना चाहिए।

2. परिपक्वता माध्यम की तैयारी

नोट:, इन विट्रो परिपक्वता प्रयोग के दिन पर परिपक्वता मध्यम तैयार महिला से oocytes को दूर करने के 1 घंटे के भीतर (खंड 3 देखें)।

  1. एल glutamine, पीएच 7.0 के साथ लेबोविट्ज़ एल -15 माध्यम के 20 एमएल, एक 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब को बाँझ परिस्थितियों में जोड़ें। 10 एन NaOH के साथ पीएच 9.0 पर ले आएं।
  2. लेबोविट्ज़ एल -15 मध्यम, पीएच 9.0, 9 एमएल 2 अलग 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में जोड़े। लेबल 1 ट्यूब "+ DHP" और अन्य "-DHP।"
  3. + DHP ट्यूब में 17α-20β-dihydroxy -4 pregnen-3-वन के 10 μL (DHP), DH 2 हे 490 μL, और 10% गोजातीय सीरम albumin के 500 μL (BSA) जोड़ें।
  4. -DHP ट्यूब में 10 मिलीग्राम / एमएल gentamycin, 400 के 100 μL जोड़ने81; DH 2 हे एल, और 10% बीएसए के 500 μL।

3. Oocytes के विच्छेदन और इन विट्रो संस्कृति दीक्षा

नोट: इन विट्रो संस्कृति प्रयोग पूर्व चयनित महिलाओं 8-10 दिन के बाद वे प्राकृतिक संभोग के माध्यम से अंडे को रिहा साथ किया जाता है। परिपक्वता मध्यम उसी दिन किया जाता का उपयोग करें (धारा 2 देखें)। Oocytes उचित रूप से परिपक्व यदि विच्छेदन मछली प्रतिदिन चक्र (मछली सुविधा में पूर्व निर्धारित कृत्रिम प्रकाश से प्रयोगशाला में निर्धारित) 13 के अंत के पास शुरू कर दिया है जो संभवतः प्राकृतिक संभोग के माध्यम से होने वाली प्रक्रियाओं की नकल उतार। इसका मतलब है कि प्रोटोकॉल में सबसे अधिक चरणों शाम को किया जाना चाहिए अगर मछली एक मानक प्रकाश चक्र के साथ एक सुविधा में रखे जाते हैं (जैसे, एक 8 से 10 बजे बजे प्रकाश अवधि के साथ एक सुविधा में 6 बजे चरण 3.2 शुरुआत), हालांकि अन्य काम समय अवधि के लिए एक उचित रूप से समय-स्थानांतरित प्रकाश चक्र के साथ संभव हो रहे हैं।

  1. DH 2 हे में एक 0.2% tricaine शेयर समाधान, 1 एम Tris, पीएच 9.0 के साथ पीएच 7.0 बफ़र तैयार, और 4 डिग्री सेल्सियस पर इस समाधान रहते हैं। यह समय से आगे तैयार किया जा सकता।
  2. प्रयोग 0-4 घंटे सुविधा में दैनिक प्रकाश चक्र के अंत से पहले आरंभ करें। 250 एमएल बीकर में, 0.2% tricaine शेयर समाधान, पीएच 7.0 के 20 एमएल जोड़ने मछली पानी के 80 एमएल के लिए और मिश्रण।
  3. tricaine समाधान के लिए पूर्व चयनित महिलाओं स्थानांतरण और overexposure द्वारा उन्हें euthanize। गिल आंदोलन की समाप्ति के बाद 15 मिनट के लिए tricaine समाधान में महिलाओं छोड़ दें।
  4. एक चम्मच का उपयोग करना, tricaine समाधान से euthanized मछली को इकट्ठा करने और उन्हें मछली पानी में संक्षेप में कुल्ला। एक कागज तौलिया पर मछली जगह अतिरिक्त पानी को अवशोषित।
  5. छाती पर का कवच पंख के स्तर पर euthanized मछली सिर काटना करने के लिए एक साफ रेजर ब्लेड का प्रयोग करें। चीर-फाड़ कैंची का प्रयोग, गुदा क्षेत्र के लिए पूर्वकाल अंत से विस्तार, मछली के उदर पक्ष पर एक अनुदैर्ध्य चीरा बनाने।
  6. नोट: अंडाशय, जो विकासशील oocytes होते हैं, शरीर की आंतरिक गुहा के भीतर अपारदर्शी और clumpy संरचनाओं के रूप में दिखाई देगा।
  7. चीर-फाड़ संदंश का प्रयोग, धीरे कूपिक जनता से अलग कर देना oocytes। क्रमबद्ध प्रारंभिक चरण चतुर्थ oocytes (चित्रा 2 बी;, जीवी टूटने से पहले लगभग अधिक से अधिक आकार में और एक अंधेरे, अपारदर्शी कोशिका द्रव्य और एक तत्काल स्पष्ट जीवी डिम्बाणुजनकोशिका भीतर विषम स्थित की विशेषता)। पहले चरण (चित्रा 2A) और पारदर्शी, परिपक्व चरण वी अंडे (DHP उपचार से पहले अंडाशय में चित्रा 2C में उन लेकिन वर्तमान के समान) में oocytes त्यागें।
    नोट: Oocytes प्रारंभिक चरण चतुर्थ, प्रारंभिक चरण है कि परिपक्व, मंच वी oocyt में जो परिणाम में परिपक्वता के लिए चुने गए हैंइन विट्रो संस्कृति की स्थिति (चित्रा 2C और डी) के बाद तों 3। क्योंकि चतुर्थ चरण oocytes सक्रिय रूप से उत्पादों के उत्पादन कर रहे हैं, इस स्तर पर हेरफेर आरएनए इंजेक्शन के माध्यम से या शुरू की राज्यमंत्री के माध्यम से जीन समारोह की कमी के लिए बहिर्जात उत्पादों की अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देता है।
  8. युक्त 4 लेबोविट्ज़ के एल 15 मध्यम + DHP की एमएल एक दूसरे 35 x 10 मिमी प्लास्टिक संस्कृति डिश के लिए प्रारंभिक चरण चतुर्थ oocytes हस्तांतरण करने के लिए एक गिलास पाश्चर pipet का प्रयोग करें। + DHP समाधान युक्त पकवान को -DHP मध्यम की मात्रा न्यूनतम स्थानांतरित करें।

4. Oocyte Microinjections

नोट: पृथक चतुर्थ चरण विट्रो परिपक्वता में के दौर से गुजर oocytes कार्यात्मक हेरफेर या टैग किए गए प्रोटीन अभिव्यक्ति के लिए अभिकर्मकों पेश करने microinjected किया जा सकता। इस तरह के mRNA और विदेश राज्य मंत्री (अनुभाग 4 देखें) के रूप में अभिकर्मकों, के microinjection, आम तौर पर किया जाता है जब oocytes इन विट्रो matu दौर से गुजर रहे+ DHP माध्यम में राशन, पूर्व defolliculation के लिए। ज़रूरत पड़ने पर, आदेश डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता से पहले जोड़तोड़ का संचालन करने के लिए और अधिक समय की अनुमति देने के लिए, इंजेक्शन भी बाहर -DHP माध्यम में, कम से कम 2 घंटे के लिए किया जा सकता है परिपक्वता से पहले। वे बाद में + DHP मध्यम को हस्तांतरित किया जा सकता है।

  1. एक मानक अभिव्यक्ति किट का उपयोग mRNAs तैयार करें। 50-500 स्नातकोत्तर / μL के अंतिम एकाग्रता पर इंजेक्शन के लिए एक 100-500 स्नातकोत्तर / μL शेयर के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर उन्हें रखें आरएनए ग्रेड पानी में (200 स्नातकोत्तर / μL की सिफारिश की है)। निर्माता के निर्देशों के अनुसार पानी में 4 एनजी / μL की एकाग्रता पर राज्यमंत्री तैयार करें। उन्हें 2 एनजी के अंतिम सांद्रता में इंजेक्षन / μL (या के रूप में अनुभव निर्धारित)।
    नोट: इंजेक्शन आम तौर पर बाहर + DHP माध्यम में पूर्व defolliculation के लिए (खंड 5 में नोट देखें) किया जाता है।
  2. mRNA इंजेक्शन लगाने हैं, तो तुरंत इंजेक्शन से पहले, शाही सेना ग्रेड रिवर्स ऑस्मोसिस पानी और 0.2 एम KCl का उपयोग कर 0.1 एम KCl का एक अंतिम समाधान प्राप्त करने के लिए mRNA पतला।
  3. तो राज्यमंत्री इंजेक्शन लगाने, तुरंत इंजेक्शन से पहले, रिवर्स ऑस्मोसिस पानी और 0.2 एम KCl का उपयोग कर 0.1 एम KCl का एक अंतिम समाधान प्राप्त करने के लिए वांछित एकाग्रता के लिए राज्यमंत्री पतला।
  4. मैन्युअल रूप से ठीक संदंश के साथ oocytes पकड़ और जंगली प्रकार चतुर्थ चरण एक खींच लिया ग्लास केशिका विंदुक के साथ किए गए एक सुई का उपयोग oocytes में लगभग 1 nl इंजेक्षन।
    1. गर्म गिलास केशिका ट्यूब खींच, समाधान लोड हो रहा है इंजेक्ट किया जा करने के लिए, और संदंश के साथ सुई टिप को तोड़ने, जैसा कि पहले zebrafish जल्दी भ्रूण 15 में मानक इंजेक्शन के लिए प्रोटोकॉल में वर्णित द्वारा कांच सुइयों तैयार करें।
      ध्यान दें: यह उपयोगी है अगर सुई धीरे-धीरे शंकु के बजाय अचानक एक है; इस सुई टिप में तोड़ने के स्थान के संदर्भ में अधिक लचीलापन देता है और यह भी इंजेक्शन भ्रूण को क्षति से बचाने में मदद करता है। एक ही सुई और भ्रूण इंजेक्शन के लिए के रूप में समाधान का उपयोग करना, पूर्व निर्धारण से इंजेक्शन वॉल्यूम समायोजितmicroinjector दबाव सेटिंग्स कि वांछित मात्रा का उत्पादन। ये सेटिंग इसके द्वारा निर्धारित किया जा सकता नकली इंजेक्शन लगाने, एक खुर्दबीन के चरण अंशांकन स्लाइड (0.01 मिमी) और इंजेक्शन समाधान के सांस में वांछित व्यास प्राप्त करने के लिए microinjector सेटिंग्स समायोजित करने के खनिज तेल की एक बूंद में के रूप में पहले से 15 का वर्णन किया।

5. oocyte परिपक्वता और Defolliculation

नोट: डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान oocytes उत्तरोत्तर पारदर्शी हो जाएगा, जो सफल संस्कृति की स्थिति के आकलन के लिए अनुमति देता है।

  1. अपरिपक्व विकासशील जारी रखें (और, यदि उपयुक्त, इंजेक्शन) 26.5 डिग्री सेल्सियस पर + DHP माध्यम में oocytes, समय-समय पर (हर 30 मिनट) की जाँच के लिए सुनिश्चित करें कि oocytes बरकरार रहेगा और उत्तरोत्तर पारदर्शी बनने के द्वारा उचित परिपक्वता दौर से गुजर रहे (चित्र 2C) ।
    1. पाश्चर विंदुक के साथ किसी भी lysing oocytes निकालें और उन्हें त्यागनेएक प्रयोगशाला बेकार बीकर में मध्यम की गुणवत्ता बनाए रखने के लिए। ताजा + DHP माध्यम के लगभग एक आधा मात्रा के साथ संवर्धन माध्यम का आदान-प्रदान डिम्बाणुजनकोशिका lysis की मात्रा पर निर्भर एक स्पष्ट समाधान बनाए रखने के लिए,।
    2. इन विट्रो परिपक्वता आगे बढ़ने के लिए जब तक oocytes के बहुमत पारदर्शी बन जाता है और एक जीवी स्पष्ट है कि अब और नहीं है (लगभग 2 DHP उपचार में ज, चित्रा 2C के रूप में डी की तुलना में देखें) की अनुमति दें। उन्हें प्रेषित प्रकाश प्रकाशिकी के साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप के तहत देखें।
  2. प्रत्येक परिपक्व डिम्बाणुजनकोशिका से सबसे बाहरी कूपिक झिल्ली निकालें। डिम्बाणुजनकोशिका और झिल्ली के बीच वृद्धि की जगह के साथ एक क्षेत्र में कूपिक झिल्ली में टूटन बनाने के लिए अतिरिक्त ठीक संदंश का प्रयोग करें। झिल्ली के एक हिस्से को छील और जब तक नीचे खुली हिस्सा पकड़े झिल्ली से बाहर डिम्बाणुजनकोशिका रोल।
    नोट: अंतर्निहित कोरियोनिक झिल्ली आम तौर पर इस प्रक्रिया के दौरान अंडे के साथ घनिष्ठ सहयोग में रहेगा; अंडा अधिनियम के बादivation, यह भ्रूण के लिए एक सुरक्षात्मक परत के रूप में फैलता है।
  3. माध्यम की एक न्यूनतम मात्रा में defolliculated oocytes स्थानांतरण (आमतौर पर, कम से कम 20 μL में 5-10 के बारे में परिपक्व oocytes हस्तांतरण) संस्कृति (+ DHP) मध्यम की कुछ बूँदें साथ एक पेट्री डिश के लिए और निषेचन के लिए आगे बढ़ें।

6. इन विट्रो सुसंस्कृत Oocytes के निषेचन

नोट: बर्फ पर शुक्राणु समाधान, नीचे तैयार, के बारे में 2 घंटे के लिए अपने शक्ति को बनाए रखेगा।

  1. वृषण का उपयोग कर के रूप में पहले से 16, 17 में वर्णित है, हैंक्स समाधान के 500 μL में पांच पुरुषों से defolliculation के लिए डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता कदम के अंत और पूर्व के पास एक शुक्राणु समाधान तैयार करें।
  2. + DHP संस्कृति माध्यम में defolliculated oocytes के लिए शुक्राणु समाधान के 10-50 μL जोड़ें। 10 एस प्रतीक्षा करें।
  3. एक विंदुक का प्रयोग, oocytes को भ्रूण (ई 3) मध्यम की कुछ बूँदें जोड़ें। 1 मिनट प्रतीक्षा करें और फिर बाढ़ plE3 माध्यम के साथ खा लिया।
    नोट: 5 मिमी NaCl, 0.17 मिमी KCl, 0.33 मिमी 2 CaCl, 0.33 मिमी MgSO 4, और 1-5% Methylene ब्लू 13: E3 माध्यम की संरचना इस प्रकार है।
  4. चरण दोहराएं 5.3, 6.2, और 6.3 निषेचित भ्रूण के अधिक से अधिक संख्या प्राप्त करने के लिए।
  5. निषेचित भ्रूण को विकसित करने की अनुमति दें। दरार चरणों के माध्यम से प्रगति का निरीक्षण करने, सफल निषेचन सुनिश्चित करने के लिए के रूप में पहले से निषेचन 17 और 18 के मंचन के लिए वर्णित प्रेषित प्रकाश प्रकाशिकी साथ एक विदारक माइक्रोस्कोप का उपयोग करें।

Representative Results

निर्धारित करने के लिए प्रक्रिया ऊपर वर्णित सफल होता है, भ्रूण दरार चरणों के दौरान टकसाली प्रारंभिक भ्रूण दरार पैटर्न 18 की उपस्थिति की पुष्टि करने, साथ ही 24 घंटे के बाद निषेचन (HPF) के रूप में मनाया जा सकता है समुचित विकास पुष्टि करने के लिए बुनियादी शरीर योजना का। यह प्रक्रिया डिम्बाणुजनकोशिका विकास के दौरान, इस तरह के mRNAs और राज्यमंत्री के रूप में अभिकर्मकों, के इंजेक्शन के माध्यम से कार्यात्मक अध्ययन के लिए मातृ उत्पादों के हेरफेर के लिए अनुमति देता है।

कार्यात्मक अध्ययन के लिए मातृ उत्पादों के हेरफेर:

जंगली प्रकार और उत्परिवर्तित उत्पादों के लिए mRNA कोडिंग अर्धसूत्रीविभाजन और जल्दी भ्रूण चरणों के दौरान मातृ जीन समारोह के हेरफेर के प्रभाव का परीक्षण करने के लिए इन विट्रो परिपक्व oocytes में इंजेक्ट किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, जंगली प्रकार भ्रूण वाई के साथ इंजेक्ट किया जा सकताld प्रकार mRNA उत्पाद overexpression के प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए, या उत्परिवर्ती आरएनए के साथ संभावित प्रमुख (जैसे, लाभ-ऑफ-समारोह और antimorphic) इन प्रक्रियाओं में प्रभाव के लिए परीक्षण करने के लिए। इन विट्रो संस्कृति में Oocytes, प्रोटीन के रूप में इंजेक्ट mRNA से GFP की अभिव्यक्ति से दिखाया गया है, डिम्बाणुजनकोशिका विकास के दौरान बहिर्जात mRNA से उत्पादन करने में सक्षम हैं, हालांकि केवल oocytes कि oogenesis के चतुर्थ चरण में संस्कृति की स्थिति आरंभ (चित्रा 2 बी परिपक्व चरण वी oocytes में विकसित कर सकते हैं -2D, यह भी नायर एट अल। 3 देखें)। इंजेक्शन mRNA के माध्यम से जंगली प्रकार उत्पाद की अभिव्यक्ति भी मातृ-प्रभाव परिवर्तन के बचाव स्थितीय क्लोनिंग 3, 24 के दौरान जीन पहचान की पुष्टि करने के लिए महत्वपूर्ण भूमिका निभाई है। इस मामले में, जंगली प्रकार mRNA जंगली प्रकार के उत्पादों उत्परिवर्ती phenotype बचाव कर सकते हैं कि परीक्षण करने के लिए समयुग्मक उत्परिवर्ती महिलाओं से oocytes में इंजेक्ट किया जाता। यह आनुवंशिक बचाव में चित्रित किया गया है <strong> चित्रा 3 ए -3 सी, जहां इंजेक्शन AurB mRNA उससे संबंधित जीन, सेलुलर द्वीप (CEI) (चित्रा 3 ए -3 सी) में एक उत्परिवर्तन के प्ररूपी प्रभाव को बचाने के लिए दिखाया गया है। एक नियंत्रण समूह से भ्रूण भी इसी उत्परिवर्ती phenotype 3 को दिखाने के लिए विकसित करने के लिए अनुमति दी जाती है। उत्परिवर्ती आरएनए भी उत्परिवर्तित उत्पाद जंगली प्रकार उत्पाद की वजह से है कि करने के लिए बचाव की हद तक की तुलना द्वारा आंशिक समारोह को बरकरार रखे हुए है कि क्या परीक्षण करने के लिए उत्परिवर्ती oocytes में इंजेक्ट किया जा सकता है।

विकासशील oocytes में इंजेक्शन mRNA से प्रोटीन अभिव्यक्ति कम या कोई देरी के साथ होने के लिए प्रकट होता है। मजबूत GFP अभिव्यक्ति डिम्बाणुजनकोशिका 3 के विकास मंच की परवाह किए बिना, इसी mRNA के इंजेक्शन के 2 घंटे के भीतर मनाया जाता है (चित्रा 2 बी-2 डी, यह भी देखना नायर एट अल 3।)। इस तरह के mCherry के रूप में उत्पाद:Sas6 और Birc5b (पंचमेल): GFP निषेचन के बाद और पहले भ्रूण कोशिका चक्र 3, 25 के दौरान तुरंत देखा जा सकता है। Oogenesis दौरान mRNA के इंजेक्शन भी प्रोटीन के उत्पादन में, आपस में जुड़े टैग किए गए आधा भाग की परवाह किए बिना, कार्यात्मक तुरंत निषेचन के बाद, के रूप में सेलुलर द्वीप / aurB 3, व्यर्थ चक्र / lrmp 24 के लिए मातृ उत्पादों के मामले में दिखाया गया है की ओर जाता है, और बहुरंग / bir5b 25। अनुवाद-अवरुद्ध राज्यमंत्री के रूप में भी व्यर्थ चक्र / Lrmp 3 के लिए और embryogenesis के बाद के चरणों में दिखाया गया है, असंभव मिशन / dhx16 3 के मामले में, तुरंत निषेचन के बाद एक प्रभाव है। जोड़-अवरुद्ध राज्यमंत्री, जब परिपक्व oocytes में इंजेक्शन, मातृ समारोह पर असर नहीं हो सकता है, की संभावना की वजह से पहले से ही से अब तक परिपक्व मातृ चतुर्थ चरण oocytes में टेप <sup वर्ग = "xref"> 3।

morphants की पीढ़ी:

एक एमओ पहले से पहचान उत्परिवर्तन के साथ एक जीन के लिए इसी का उपयोग कर, morphant फेनोटाइप उत्परिवर्ती phenotype की नकल करने की उम्मीद है। Morphants uninjected भ्रूण के लिए और एक मानक इंजेक्शन वालों की तुलना में कर रहे हैं, एमओ नियंत्रित करते हैं। एक अनुवाद-अवरुद्ध morpholino की इंजेक्शन सफलतापूर्वक जाना जाता उत्परिवर्ती phenotype 3 phenocopy कर सकते हैं के रूप में Lrmp एमओ के इंजेक्शन oocytes में है, जो इसी उत्परिवर्तन के उत्परिवर्ती phenotype, व्यर्थ चक्र (चित्रा 3 डी-एफ) की नकल करता द्वारा दिखाए गए। राज्यमंत्री की विशिष्टता जब (पूर्व में समीक्षा) भ्रूणों में राज्यमंत्री 19, 20 इंजेक्शन लगाने के द्वारा उपयोग किए गए दृष्टिकोण के माध्यम से निर्धारित किया जा सकता।

fluorescently लेबल संलयन प्रोटीन की अभिव्यक्ति:

चित्रा 3 जी; mRNA फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जैसे, GFP और mCherry) के लिए जुड़े हुए ब्याज की जीन उत्पादों के लिए कोडिंग भी या तो जंगली प्रकार या उत्परिवर्ती oocytes जल्दी भ्रूण के अंदर संबंधित उत्पादों कल्पना करने के लिए (यानी, एक subcellular स्थानीयकरण पैटर्न को दर्शाती में इंजेक्ट किया जा सकता है और 3H)। समान fusions के लिए कोडिंग लेकिन उत्परिवर्ती युग्मजीविकल्पी से जुड़े mRNAs इसी तरह है कि क्या उत्परिवर्तन किसी भी संभावित subcellular स्थानीयकरणों को प्रभावित करता है परीक्षण करने के लिए व्यक्त किया जा सकता।

आकृति 1
चित्र 1: इन विट्रो oocyte परिपक्वता में। योजनाबद्ध आरेख इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता में शामिल विभिन्न चरणों दिखा। वयस्क मादा के लिए पूर्व चयन किया जाता है अंडे बिछाने की प्रक्रिया करने के लिए 8 दिन पहले, उन्हें अंडे कि पहले से ही परिपक्व और समर्थक के लिए है की शुद्ध करने के लिएनई डिम्बाणुजनकोशिका विकास मोटे। अंडाशय, विकासशील oocytes युक्त, महिलाओं से हटा दिया और एक मध्यम इन विट्रो में डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता प्रेरित करने के लिए हार्मोन DHP युक्त करने के लिए स्थानांतरित कर रहे हैं। महिलाओं और करने के लिए या डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौरान तुरंत पहले से निकालने के बाद, oocytes मातृ कारकों में से कार्यात्मक हेरफेर के लिए शाही सेना उत्पादों और अन्य अभिकर्मकों के साथ इंजेक्ट किया जा सकता। परिपक्व oocytes मैन्युअल defolliculated और एक शुक्राणु समाधान के साथ इन विट्रो में निषेचित निषेचित, व्यवहार्य भ्रूण उपज के लिए कर रहे हैं। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्र 2: इन विट्रो oocyte परिपक्वता में और इंजेक्शन mRNA से उत्पाद की अभिव्यक्ति। (ए) के चरणों I-III, से अंडाशय में मनाया पर oocytesमहिलाओं 4 दिनों के बाद शुद्धिकरण (डीपीपी)। (बी) के चतुर्थ चरण में oocytes, महिलाओं 8 डीपीपी से अंडाशय में मनाया। कीटाणु पुटिका (जीवी, तीर) स्पष्ट रूप से दिखाई दे रहा है और एक विलक्षण स्थान पर है। में तृतीय चरण oocytes (ए) भी एक तत्काल स्पष्ट जीवी दिखा रहे हैं, लेकिन यह डिम्बाणुजनकोशिका में केंद्रित पाया जाता है। (बी) में चतुर्थ चरण oocytes एक आकार है कि में परिपक्व oocytes (सी) की तुलना में अधिक से अधिक निकट है। (सी और डी) चरण वी (oocytes परिपक्व) इन विट्रो परिपक्वता की स्थिति (बी), के रूप में, चतुर्थ चरण में शुरू की है और GFP-एन्कोडिंग के साथ परिपक्वता के दौरान इंजेक्शन में 2 घंटे के बाद कम से oocytes, इन विट्रो लिखित mRNA (सी, दृश्य प्रकाश में केवल; डी, दृश्य प्रकाश और GFP प्रतिदीप्ति) के ओवरले। जीवी मंच वी oocytes है, जो भी चतुर्थ चरण oocytes की तुलना में कम अपारदर्शी हैं में अब स्पष्ट है। इंजेक्शन oocytes GFP प्रोटीन (डी) व्यक्त करते हैं। परिपक्व चतुर्थ चरण oocytes की Defolliculation des हैप्रोटोकॉल खंड में cribed। स्केल बार = 300 सुक्ष्ममापी। सभी पैनलों अनुमति के साथ, पुन: उत्पादित कर रहे थे, नायर एट अल 3 से। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र तीन
चित्र 3: इन विट्रो oocyte परिपक्वता के माध्यम से हेरफेर और मातृत्व उत्पाद का विजुअलाइजेशन। (ए - सी) मातृ-प्रभाव चतुर्थ चरण cei / aurB oocytes में जंगली प्रकार aurB mRNA के इंजेक्शन के माध्यम से सेलुलर द्वीप / औरोरा बी में एक उत्परिवर्तन के कारण लक्षण प्रारूप का बचाव। 65 MPF तय blastodiscs के पशु विचारों, झिल्ली (हरा) को उजागर करने के विरोधी ß-catenin एंटीबॉडी के साथ कल्पना दिखा मर्ज किए गए चित्र, विरोधी α ट्यूबिलिन एंटीबॉडी सूक्ष्मनलिकाएं से संकेत मिलता है (लाल), और DAPI डीएनए (नीला) को नामित करने के। (ए) जंगली प्रकार भ्रूण में β-catenin संचय, सामान्य कुंड परिपक्वता का संकेत। (बी) के एक uninjected cei / aurB चतुर्थ चरण डिम्बाणुजनकोशिका से एक cei / aurB भ्रूण आंशिक, अल्पविकसित furrows कि β-catenin अर्जित नहीं करेंगे पता चलता है। एक cei / aurB डिम्बाणुजनकोशिका जंगली प्रकार aurB mRNA furrows पर मजबूत β-catenin संचय दिखा इंजेक्शन से (ग) एक बचाया cei / aurB भ्रूण। (डी - एफ) मातृ-प्रभाव morpholino चतुर्थ चरण oocytes में Lrmp के इंजेक्शन से व्यर्थ चक्र / lrmp में एक उत्परिवर्तन के कारण की Phenocopy। 70 MPF तय blastodiscs, विरोधी γ ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ कल्पना के पशु दृश्य दिखाती मर्ज किए गए छवियों तारक काय (लाल) और DAPI इंगित करने के लिए डीएनए (नीला) को नामित करने के। (डी) जंगली प्रकार भ्रूण, γ ट्यूबिलिन, centrosomal सामग्री के लिए एक मार्कर के साथ प्रत्येक नाभिक सहयोगियों में। (ई) मातृ-प्रभाव fue उत्परिवर्ती में, pronuclear संलयन विफल रहता है, unfused माता पिता का समर्थक नाभिक और अर्धसूत्रीविभाजन II के लिए पोलर बॉडी के लिए इसी डीएनए लेबल के दो से तीन पैच में जिसके परिणामस्वरूप। (एफ) Lrmp morphants, जहां मातृ Lrmp समारोह को रोके जाने पर, नाभिक इसी तरह विभाजित करने के लिए असफल और, इसके अलावा, γ ट्यूबिलिन के साथ संबद्ध करने के लिए असफल हैं। (जी और एच) जल्दी भ्रूण में माता के रूप में उत्पादित उत्पाद का विजुअलाइजेशन। बहिर्जात mRNA से Sass6-mCherry प्रोटीन चरण में इंजेक्शन चतुर्थ oocytes centrioles लिए localizes। 40 MPF तय blastodiscs के पशु विचारों, तारक काय (हरा) को उजागर करने के विरोधी γ ट्यूबिलिन एंटीबॉडी के साथ कल्पना, mCherry प्रतिदीप्ति दिखा मर्ज किए गए छवियों Sass6 (लाल) से संकेत मिलता है, और DAPI डीएनए (नीला) को नामित करने के। (G) व्यक्त Sass6-mCherry प्रोटीन नाभिक (तीर) अगल स्थलों पर सेंट्रोसोम मार्कर γ ट्यूबिलिन द्वारा लेबल फोकी लिए localizes। (एच एट अल 3। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Oogenesis के चरण डिम्बाणुजनकोशिका व्यास (सुक्ष्ममापी) कुंजी मील का पत्थर (रों)
1 ए - Prefollicle 7 करने के लिए 20 सक्रिय प्रतिलेखन के दीक्षा, उपकेन्द्रक के संचय
1 बी - कूप 20 करने के लिए 140 गुणसूत्रों की Decondensation
द्वितीय - कोर्टिकल दंतकोटर 140 करने के लिए 340 Cortical एल्वियोली उत्पादन
तृतीय - Vitellogenesis 340 करने के लिए 690 जर्दी पूर्वगामी प्रोटीन और लिपिड के संचय से ooplasm का काला पड़ना
प्रारंभिक चतुर्थ - oocyte परिपक्वता 690 730 के लिए (कम रेंज) कीटाणु पुटिका के असममित स्थानीयकरण
प्रारंभिक चतुर्थ - oocyte परिपक्वता 690 730 के लिए (ऊपरी सीमा) कीटाणु पुटिका मेटाफ़ेज़ द्वितीय में गायब हो जाता है, गिरफ्तारी
वी - परिपक्व डिम्बाणुजनकोशिका ~ 750 Ooplasm / जर्दी पारदर्शी हो जाता है

तालिका 1: ज़ेबरा में Oocyte विकास लैंडमार्क्समछली।

Discussion

ऊपर प्रोटोकॉल इस प्रकार जल्दी zebrafish भ्रूण में मातृ जीन उत्पादों के अध्ययन के लिए अनुमति देता है, निषेचन से पहले जीन उत्पादों के हेरफेर के लिए है। पिछले अध्ययनों से इन विट्रो 4 में oocytes परिपक्व करने में सक्षम है; इस प्रोटोकॉल में इन विट्रो निषेचन के बाद परिपक्व oocytes 8 के लिए अनुमति देने के लिए संशोधित किया गया था। यह बदले में जल्दी भ्रूण 3 में कार्यात्मक हेरफेर और माता के रूप में विरासत में मिला उत्पादों के दृश्य के लिए अभिकर्मकों के इंजेक्शन के लिए अनुमति देता है। इस विधि से उत्पन्न भ्रूण व्यवहार्य हो सकता है और उपजाऊ वयस्कों बनने के लिए जीवित रह सकते हैं। प्रारंभिक प्रयोगों में, इस प्रक्रिया से प्राप्त निषेचित भ्रूण के लगभग आधे के रूप में उस समय लगभग आधा जिनमें से स्वस्थ, उपजाऊ वयस्कों (अप्रकाशित टिप्पणियों) बन गया पर तैरने मूत्राशय मुद्रास्फीति द्वारा मूल्यांकन, विकास के 5 दिन पर व्यवहार्य थे।

एक संख्या हैंके महत्वपूर्ण चरणों प्रोटोकॉल में विचार करने के लिए। उचित स्तर पर Oocytes परिपक्वता (प्रारंभिक चरण चतुर्थ) शुरू करने के लिए समृद्ध किया जा सकता है, तो महिला ने हाल ही में mated गया है, लेकिन 8 से पहले नहीं डीपीपी। मछली है कि हाल ही में mated नहीं किया है का उपयोग करते हुए अंडे 14 है, जो परिपक्वता नहीं गुजरना होगा degenerating हो सकती है। कम से कम 8 दिनों के भीतर mated महिलाओं चरण III या उससे कम पर अंडे के बहुमत होगा, और इस तरह, अंडे इन विट्रो में ठीक से परिपक्व नहीं होंगे। महिलाओं है कि 8 दिन पहले mated में अंडाशय प्रारंभिक चरण चतुर्थ में oocytes की एक इष्टतम अंश होगा। ये उनके अस्पष्टता और एक विलक्षण स्थिति (चित्रा 2 बी) में जी.वी. की मौजूदगी से पहचाना जा सकता है। डिम्बाणुजनकोशिका चरण दृढ़ संकल्प भी, आकार माप द्वारा सहायता प्राप्त किया जा सकता है के साथ oocytes एक खुर्दबीन के नीचे एक स्नातक की उपाधि प्राप्त माइक्रोमीटर स्लाइड पर रखा और मानक मचान दिशा निर्देशों (तालिका 1) की तुलना में। हालांकि, प्रारंभिक चरण चतुर्थ oocytes के पास अधिक से अधिक आकार परिपक्व की तुलना मेंoocytes (उनके रिश्तेदार पारदर्शिता और एक जीवी की कमी के द्वारा मान्यता प्राप्त, चित्रा 2C) और आसानी से पहचाने जाते हैं जैसा कि ऊपर वर्णित है, जो आम तौर पर एक सीधा डिम्बाणुजनकोशिका आकार माप की जरूरत obviates।

इन विट्रो परिपक्वता में दिन के उजाले चक्र महिला डिम्बाणुजनकोशिका दाताओं अनुकूलित कर रहे हैं जो करने के लिए के अंत के कई घंटे के भीतर शुरू होगा। Oocytes ठीक से परिपक्व नहीं होगा, गरीब निषेचन दरों में परिलक्षित करता है, तो प्रकाश चक्र की सुबह की अवधि के दौरान संवर्धित किया। इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता विधि के circadian निर्भरता का कारण समझ नहीं है लेकिन संभावना oogenesis 21 के दौरान साइकिल जीन की अभिव्यक्ति से जुड़े इन विवो अंडा परिपक्वता में अंतर्निहित circadian पूर्वाग्रहों को दर्शाता है। उचित डिम्बाणुजनकोशिका मचान के बावजूद इन विट्रो परिपक्वता में सफल गुजरना करने में नाकाम रहने के लिए oocytes एक आम कारण है कि DHP हो गई है। DHP हार्मोन आम तौर पर एक वर्ष के बाद समाप्त हो रहा है, और प्रभाव का बीमा करने केIve परिपक्वता, काम बैच उपयोग की 9 महीनों के भीतर बदल दिया जाना चाहिए।

oocytes की इंजेक्शन एक और महत्वपूर्ण कदम है जब विधि के प्रयोजन के मातृ उत्पादों के कार्यात्मक हेरफेर है। यह प्रक्रिया आवश्यकताओं कि 0-30 MPF में निषेचित अंडे में मानक इंजेक्शन के लिए उन लोगों से अलग है। डिम्बाणुजनकोशिका इंजेक्शन में एक प्रमुख कारक की स्थिति, इस तरह के लेबोविट्ज़ के एल 15 मध्यम 22, 23 में के रूप में है कि समय से पहले अंडा सक्रियण की ओर नहीं ले के तहत इंजेक्शन बाहर ले जाने की जरूरत है। क्योंकि वे अंडाशय में एम्बेडेड रहे हैं, परिपक्व oocytes भी इंजेक्शन के लिए विशेष चुनौती। प्रोटोकॉल ऊपर पहले अंडाशय से oocytes अलग कर और फिर पकड़े प्रत्येक संदंश के साथ अलग से डिम्बाणुजनकोशिका अलग जबकि इंजेक्शन लगाने का सुझाव देते हैं। इस तकनीक को कम से कम से निपटने के साथ उचित स्तर पर अच्छी तरह से काम किया है और पूर्व छँटाई oocytes की अनुमति देता है है। वैकल्पिक तरीकों का भी इस्तेमाल किया जा सकता है, इस तरह केके रूप में: i) मानक इंजेक्शन में रखने oocytes agarose troughs 15, जहां गर्त समर्थन इंजेक्शन के दौरान डिम्बाणुजनकोशिका के ऊर्ध्वाधर दीवारों (यह वैकल्पिक पद्धति में, oocytes जबकि इन विट्रो परिपक्वता मध्यम में रखा इंजेक्शन प्लेटों को हस्तांतरित करने की जरूरत है) और ii ) की इजाजत दी oocytes डिम्बग्रंथि बड़े पैमाने पर है, जो संदंश के साथ इंजेक्शन के दौरान आयोजित किया जा सकता (इस दृष्टिकोण में इंजेक्शन डिम्बाणुजनकोशिका के साथ संपर्क से बचने के लिए से जुड़ी, oocytes दोनों को इंजेक्शन के बाद अलग किया जाना चाहिए DHP जोखिम को सुविधाजनक बनाने के रहने के लिए और उनके defolliculation अनुमति देने के लिए , जो अपने आप आईवीएफ के लिए आवश्यक)। इस विशिष्ट चुनौती के बावजूद, चतुर्थ चरण oocytes आसानी से, एक इंजेक्शन की सुई के साथ प्रवेश किया जा सकता है की संभावना है क्योंकि इस स्तर पर कोरियोनिक झिल्ली पूरी तरह से 9 विकसित नहीं है।

वर्तमान परिपक्वता प्रोटोकॉल की एक सीमा है कि इन विट्रो परिपक्वता की स्थिति में है कि उचित डिम्बाणुजनकोशिका विकास को बढ़ावा देने हैजब डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता चतुर्थ चरण की तुलना में प्रारंभिक चरणों में शुरू किया जाता है नहीं बनाया जा सकता। Oocytes परिपक्वता के दौर से गुजर द्वारा DHP पर प्रतिक्रिया के लिए सक्षम हो जाते हैं जब वे 520 सुक्ष्ममापी के एक व्यास, जो तृतीय चरण के दौरान होता है (vitellogenesis, 340-टू-690-सुक्ष्ममापी रेंज के लिए इसी) तक पहुँचने 9। हालांकि, oocytes कि निषेचन 3 के लिए सक्षम नहीं हैं में तृतीय चरण oocytes परिणामों की संस्कृति। केवल जिसका इन विट्रो संस्कृति चतुर्थ चरण (चित्रा 2 बी) पर शुरू किया जाता है परिपक्व, चरण वी oocytes (चित्रा 2C और डी) में विकसित हो सकता oocytes। यह तथ्य यह है कि तृतीय चरण vitellogenesis और डिम्बाणुजनकोशिका वृद्धि 9 के लिए आवश्यक है से संबंधित हो सकता। इस प्रकार, इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता इस लेख में प्रस्तुत प्रक्रिया केवल चतुर्थ oocytes (बी), और न प्रारंभिक चरणों में oocytes (चरणों मैं के साथ मंच का कोई आरंभिक आबादी के साथ प्रयोग किया जाना चाहिए - तृतीय, Figurइन विट्रो संस्कृति परिपक्वता तरीकों में सुधार भविष्य में प्रारंभिक चरणों में डिम्बाणुजनकोशिका संवर्धन की शुरुआत के लिए अनुमति दे सकता है, इस प्रकार इन विट्रो परिपक्वता दृष्टिकोण की शक्ति का विस्तार।

प्रस्तुत विधि में एक और सीमा यह है कि defolliculation, जो बाद में निषेचन को शामिल चरणों के लिए आवश्यक है, वर्तमान में प्रक्रिया में एक दर सीमित कदम है। कूपिक झिल्ली एक पारदर्शी विकासशील डिम्बाणुजनकोशिका आसपास परत है, और हटाने थकाऊ हो सकता है। इस झिल्ली को पूरी तरह से नहीं हटाया जाता है, तो अंडा पूरी तरह से सक्रिय है और निषेचित नहीं हो पाएगी। यह जरायु की विफलता का विस्तार करने और अनियमित रखा, कुंड की तरह सेंट के विकास के द्वारा स्पष्ट किया गया हैructures (pseudocleavages), unfertilized भ्रूण 11 की विशेषता। इस तरह के कोलैजिनेज़ के रूप में एंजाइमी defolliculation तरीकों, के रूप में Xenopus में इस्तेमाल किया, कोशिश की गई है। हालांकि, हमारे हाथों में, इस तकनीक नहीं सफल रहा है, और इसलिए हम पुस्तिका defolliculation पर भरोसा करते हैं। क्योंकि पुस्तिका defolliculation श्रम प्रधान और समय लेने है, यह इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के बाद निषेचित अंडे के बड़े बैच प्राप्त करना कठिन है। मैनुअल defolliculation द्वारा लगाए गए अस्थायी सीमा के कारण, हम वर्तमान में एक समय में कुछ defolliculated, परिपक्व अंडे खाद, 5-10 अंडे के छोटे समूहों में। इस प्रक्रिया के साथ एंजाइमी defolliculation के समावेश की संभावना काफी इसकी उपज और उपयोग के समग्र आसानी वृद्धि होगी।

इन विट्रो -matured oocytes की निषेचन के बाद उत्पादित भ्रूण व्यवहार्य वयस्कों बन सकती है, हमने ध्यान दें कि इन विट्रो निषेचन के बाद, भ्रूण का एक अंश करना सामान्य रूप से या एक समय पर फैशन में विभाजित नहीं। वर्तमान में हम लाइनों जिसका प्रचार इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता के दौर है, जो इस पद्धति के माध्यम से ली गई भ्रूण में विकास के और अधिक मजबूत पैटर्न में हो सकता है शामिल है के लिए चयन कर रहे हैं।

प्रक्रिया स्पष्ट बचाव या प्रोटीन स्थानीयकरण के दृश्य म्यूटेशन 24, 25 के एक नंबर के लिए के लिए अनुमति दी गई है। हालांकि, कुछ जीनों के लिए, उत्पाद अभिव्यक्ति के नियमन महत्वपूर्ण, हो सकता है तो इंजेक्शन mRNA के द्वारा व्यक्त उत्पादों अलग-अलग परिणाम 26 को जन्म दे सकती। यह भी सभी नियंत्रण (जैसे, इस तरह के नियंत्रण राज्यमंत्री के रूप में अभिकर्मकों प्रयोग अभी तक भविष्यवाणी कर रहे हैं में इस्तेमाल किया उन लोगों के समान गुण होते हैं कि एक प्रभाव का उत्पादन नहीं करने के लिए, या RNAs केवल निष्क्रिय प्रोटीन के लिए कोडिंग के साथ इंजेक्शन भ्रूण, इस तरह के प्रति जागरूक होना महत्वपूर्ण है GFP के रूप में), अंतर्निहित परिवर्तनशीलता अनुचित निष्कर्ष को जन्म दे सकती है।

NT "> इन विट्रो निषेचन में गड़बड़ी के बाद से जुड़े एक दृष्टिकोण माता के रूप में जमा उत्पादों, जहां शाही सेना, राज्यमंत्री, या प्रोटीन इंजेक्शन लगाने निषेचित अंडे में कर सकते हैं प्रभावी रूप से उत्पादों को कम नहीं की मानक पद्धति पहले से ही अंडे में जमा करने के मामले में विशेष रूप से उपयोगी है। इस तरह के CRISPR-उत्परिवर्ती पीढ़ी के रूप में अन्य हाल ही में विकसित तरीकों में भी माता के रूप में व्यक्त जीनों 26 के लिए उत्परिवर्ती की स्थिति पैदा करने में प्रभावी रहे हैं। हालांकि, इस विधि मछली की कई पीढ़ियों के विकास की आवश्यकता है। इन विट्रो डिम्बाणुजनकोशिका परिपक्वता तकनीक को तेजी से कार्यात्मक हेरफेर के लिए अनुमति देता है बचाव और मातृ-प्रभाव परिवर्तन के phenocopy, साथ ही जल्दी भ्रूण में शाही सेना और प्रोटीन की अभिव्यक्ति सहित माता के रूप में व्यक्त जीनों के समारोह का अध्ययन।

Disclosures

लेखकों कोई प्रतिस्पर्धा वित्तीय हितों की है।

Acknowledgments

हम Pelegri प्रयोगशाला और मछली सुविधा प्रबंधकीय स्टाफ, जो इस परियोजना को सुविधाजनक बनाने में महत्वपूर्ण भूमिका निभाई थी के सदस्यों का शुक्रिया अदा करना चाहते हैं। इस परियोजना के लिए समर्थन एनआईएच R56 GM065303 और ELW को एनआईएच 2 T32 GM007133, एनआईएच 5 F31 GM108449-02 और एनआईएच 2 T32 GM007133 सीसीई के लिए, और एनआईएच RO1 GM065303 एफपी करने द्वारा प्रदान किया गया

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Zebrafish mating boxes Aqua Schwarz SpawningBox1
NaCl Sigma S5886
KCl Sigma P5405
Na2HPO4 Sigma S3264
KH2PO4 Sigma P9791
CaCl2 Sigma C7902
MgSO2-7H2O Sigma 63138
NaHCO2 Sigma S5761
Tricaine Western Chemical Tricaine-D (MS 222) FDA approved (ANADA 200-226)
Tris base Sigma 77-86-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
HCl Sigma 920-1 to prepare 1 M Tris pH 9.0
Fish net (fine mesh) (4 - 5 in) PennPlax (ThatFishThatPlace # 212370) available in ThatFishThatPlace
Plastic spoon available in most standard stores
Dissecting scissors Fine Science Tools 14091-09
Dissecting forceps Dumont SS available from Fine Science Tools
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) Nikon SMZ645 or equivalent
Reflective light source (LED arms) Fostec KL1600 LED or equivalent
Petri plates 10 cm diameter any maker
Eppendorf tubes 1.5 mL any maker
Ice bucket any maker
Narrow spatula Fisher 14-374
Depression glass plate Corning Inc 722085 (Fisher cat. No 13-748B) available from Fisher Scientific
Paper towels any maker
Kimwipes Kimberly-Clark 06-666-11 available from Fisher Scientific
Timer stop watch any maker
Wash bottle Thermo Scientific 24020500 available from Fisher Scientific
beakers, 250 mL (2) Corning Inc. 1000250 available from Fisher Scientific
Leibovitz'z L-15 medium Thermofisher 11415064
NaOH  Sigma 221465 for pH'ing
BSA Sigma A2058
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) Sigma P6285
gentamicin Sigma G1272
Injection Apparatus Eppendorf FemtoJet or equivalent
Capillary Tubing for injection needles FHC 30-30-1 or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm
Needle puller Sutter Instruments Model P-87 any maker
Micropipetor (1 - 20 µL range) with tips any maker
Micropipetor (20 - 200 µL range) with tips any maker
Micropipetor (100 - 1000 µL range) with tips any maker
Conical tubes 15 mL any maker
Conical tubes 50 mL any maker
plastic pipette 10 mL with bulb any maker
plastic pipette 20 mL with bulb any maker
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm AmScope MR095 or equivalent
Reagents for fish water:
Instant Ocean Salt Drs. Foster & Smith  CD-116528
Sodium bicarbonate (cell culture tested) Sigma S5761-1KG
Reagents for E3 medium:
NaCl Sigma S5886-1KG
KCl Sigma P5405-500G
CaCl2, dihydrate Sigma C7902-500G
MgSO4, heptahydrate Sigma 63138-250G
Methylene Blue Sigma M9140-25G
Fish Food:
Frozen brine shrimp Brine Shrimp Direct FBSFKG50
Tetramin Flakes Drs. Foster & Smith 16623

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References

  1. Lindeman, R., Pelegri, F. Vertebrate maternal-effect genes: insights into fertilization, early cleavage divisions, and germ cell determinant localization from studies in the zebrafish. Mol Rep Dev. 77, (4), 299-313 (2010).
  2. Abrams, E. W., Mullins, M. C. Early zebrafish development: it's in the maternal genes. Curr Opin Genet Dev. 19, (4), 396-403 (2009).
  3. Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. In vitro oocyte culture-based manipulation of zebrafish maternal genes. Dev Dyn. 242, (1), 44-52 (2013).
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मातृ जीन उत्पाद के कार्यात्मक हेरफेर का उपयोग करना<em&gt; इन विट्रो</em&gt; Zebrafish में oocyte परिपक्वता
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Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55213, doi:10.3791/55213 (2017).More

Welch, E. L., Eno, C. C., Nair, S., Lindeman, R. E., Pelegri, F. Functional Manipulation of Maternal Gene Products Using In Vitro Oocyte Maturation in Zebrafish. J. Vis. Exp. (122), e55213, doi:10.3791/55213 (2017).

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