En optimalisert protokoll for in vitro modning av oocytter sebrafisk som benyttes for manipulering av matern genprodukter er presentert her.
Cellulære hendelser som finner sted i løpet av de tidligste stadiene av animalsk embryoutvikling drives av maternale genprodukter deponert i den utviklende oocytten. Fordi disse bivirkningene er avhengige av maternale produkter som vanligvis opptrer meget snart etter befruktning-at preexist inne i egget, vanlige metoder for ekspresjon og funksjonell reduksjon involverer injeksjon av reagenser i det befruktede egg er vanligvis ineffektive. I stedet må slike manipulasjoner utføres under oogenesen, før eller under akkumulering av mors produkter. Denne artikkelen beskriver i detalj en protokoll for in vitro modning av umodne sebrafisk oocytter og deres etterfølgende in vitro fertilisering, og man oppnådde levedyktige embryoer som overlever til voksen alder. Denne metoden gir den funksjonelle manipulering av maternelle produkter under oogenesen, slik som uttrykket av produkter for fenotypisk redning og merket konstruksjon visualisering, samt ens reduksjon av genfunksjon ved reverse-genetikk midler.
Under dyr utvikling, moder innskudd genprodukter (f.eks RNA'er, proteiner og andre biomolekyler) inn i egg; Disse produktene er viktig for tidlig cellulære prosesser umiddelbart etter befruktning 1, 2. Manipuleringen av ekspresjon og funksjon av maternelle produkter er vanligvis ineffektive når de ved hjelp av en standard metode for injeksjon av reagenser i befruktede egg 3. Dette er fordi de fleste RNA og proteiner blir produsert ved en oocytt under oogenesen, så forhåndslastede maternale produkter er allerede tilstede i den modne egg. Slike forhåndseksisterende produkter er ugjennomtrengelig for funksjonell knockdown med gen-målsøking midler, slik som morfolino antisens oligonukleotidene (MOS), fordi MOS målrette mRNA, ikke den på forhånd eksisterende protein allerede var tilstede i egg ved befruktning. I tillegg har mange tidlige embryonale prosesser skje for tidlig etter befruktning skal influensert ved protein produkter avledet fra RNA injiseres i det befruktede egget, som RNA ikke kan fremstilles hurtig nok til å påvirke de første hendelsene i embryogenesen. Av samme grunn, merket proteinfusjoner uttrykkes gjennom et mRNA-injeksjon i befruktede egg kan ikke fremstilles i tid for visualisering under deres aktiv rolle i den tidlige embryoet. Injeksjon i ekstruderte modne oocytter før egg-aktivering er mulig, men er forbundet med lignende tekniske problemer: slike modne egg allerede er forhåndslastet med mors-protein, og de vil ikke bli translatorisk aktiv (dvs. å produsere proteiner fra eksogene transkripter) før etter egg aktivering. Av disse grunner manipulering av matern genprodukter som opptrer tidlig i embryogenese må vanligvis utføres i løpet av oogenesen i modningen oocytt.
Som en tilnærming for å overkomme disse hindringene, in vitro modning metoder, som gir mulighet for modning av oocytes fra trinn IV til egg dannelse, er blitt etablert i sebrafisk. Tidlige metoder tillatt in vitro modning, men de resulterende modne egg ikke var kompetent for befruktning 4. Deretter manipulering av dyrkningsforhold fra nøytral til pH 9,0, etterligne den alkaliske pH-verdien i eggstokk væsken som finnes i fiskeslag 5, 6, tillatt for pålitelig in vitro fertilisering (IVF) etter in vitro-modning 7, 8. Faktisk kan in vitro -matured oocytter gi levedyktige embryoer som overlever til voksen alder og som er fruktbar 3, 8. Denne fremgangsmåte er ytterligere tilpasset til å inkludere funksjonelle manipulering av maternelle gener, ekspresjonen av merkede proteiner under zebrafisk oogenesen gjennom eksogene uttrykk, og MO-medierte funksjonelle slå ned i mattenuring stadium IV oocytter 3 (figur 1).
Sebrafisk oogenesen oppviser et antall karakteristiske trinn som fører til dannelse av modne oocytter 9 (se tabell 1 for en rask til de forskjellige trinn i oogenesen). Kort fortalt er eggcelle utvikling initiert av stadium I oocytter og arrestert på diplotene stadium av profase jeg av meiose. Disse oocytter gjennomgå vekst gjennom aktiv transkripsjon (initiert under trinn IA og IB), dannelse av kortikale alveoler (også kjent som cortical granuler, som ble initiert i trinn II), og vitellogenesis (initiert under trinn III). Oocytt vekst blir fullført under stadium IV, når meiose I fortsetter, noe som resulterer i den demontering av oocytten kjernen, referert til som germinal vesikkel (GV). Deretter meiose arrestert igjen ved metafase II. Fullføringen av egg vekst og meiotisk arrest i trinn IV fører til en moden fase V f.eksg 9. Fjerningen av den follikulære membranen oppstår under frigjøring av eggcelle i lumen av eggstokken 10 og er essensiell for befruktning og riktig egg aktivering. Når eggene er ekstrudert fra mor under naturlig parring, blir de aktivert. I sebrafisk, eksponering for vann er tilstrekkelig for fullstendig aktivering egg, uavhengig av tilstedeværelsen av sperm 11.
In vitro-betingelser for tiden tillate modning av oocytter fra tidlig stadium IV-, som kan gjenkjennes ved deres størrelse (690-730 um), tilstedeværelse av en stor GV i en asymmetrisk stilling, og en helt ugjennomsiktig utseende på grunn av opphopning av plommeproteiner (figur 2B) -til det modne stadiet V egg, karakterisert ved at en fullstendig demontert GV og en gjennomskinnelig utseende på grunn av eggeplomme protein prosessering 12 (figur 2C). I denne tilnærmingen, hele eggstokkene fortsinnelukker ubefruktede egg på ulike utviklingsstadier er fjernet fra kvinner. Oocyttene får lov til å utvikle seg i 17α-20β-dihydroksy-4-pregnen-3-on (DHP), en effektiv modningsinduserende hormon 8. I løpet av denne perioden, kan modnings oocytter manipuleres ved injeksjon av uttrykket (f.eks, avkortet, in vitro -transcribed mRNA-er) eller revers genetikk-midler (f.eks, Mos). Follikulær lag ikke spontant felle mot slutten av modningsperioden, slik at det må fjernes manuelt. Etter defolliculation, er in vitro fertilisering oppnås ved å utløse egg aktivering gjennom eksponering av eggene til vann (til stede i embryonisk (E3) medium) 13 og en sperm løsning. De resulterende zygoter gjennomgå embryonal utvikling og gi rom for evaluering av evnen til behandlinger for å manipulere maternal genfunksjon og for visualisering og analyse av merket maternelle produkter ( <strong> Figur 3).
Den ovennevnte protokoll er for manipulering av genprodukter før befruktning, og dermed gir for studiet av maternale genprodukter i den tidlige sebrafisk embryo. Tidligere studier har vært i stand til å modne oocytter in vitro 4; denne protokoll ble modifisert for å muliggjøre den påfølgende befruktning in vitro modne oocyttene 8. Dette i sin tur gjør det mulig for injeksjon av reagenser for funksjonell manipulering og visualisering av matern arvet produkt i tidlig embryo 3. Embryoer som følge av denne metoden kan være levedyktig og kan overleve å bli frukt voksne. I preliminære eksperimenter, omtrent halvparten av det befruktede embryo som avledes fra denne fremgangsmåte var levedyktige på dag 5 i utvikling, som bedømt ved svømmeblæren inflasjon på det stadiet, hvorav omtrent halvparten ble fertile, friske voksne (upubliserte observasjoner).
Det finnes en rekkeav kritiske tiltak for å vurdere i protokollen. Oocytter ved passende trinn for å initiere modning (tidlig stadium IV) kan anrikes hvis hunn var blitt paret med nylig, men ikke før 8 dpp. Ved hjelp av fisk som ikke har parret sist kan resultere i dårligere egg 14, som ikke vil gjennomgå modning. Hunner parret i løpet av mindre enn 8 dager vil ha et flertall av egg i stadium III eller mindre, og dermed vil eggene ikke modne ordentlig in vitro. Eggstokkene hos hunner som parret 8 dager før vil ha en optimal andel av oocytter i tidlig stadium IV. Disse kan bli gjenkjent ved deres opasitet og tilstedeværelsen av GV i en eksentrisk stilling (figur 2B). Oocytt trinns bestemmelse kan også bli hjulpet av størrelsesmåling, med oocyttene plassert på en gradert mikrometer lysbilde under et mikroskop og sammenlignet med standard stillas retningslinjer (tabell 1). Imidlertid tidlig stadium IV oocytter som har tilnærmet maksimal størrelse i forhold til modenoocytter (gjenkjent ved deres relative gjennomsiktighet og mangel på en GV, figur 2C), og er lett å kjenne igjen, som beskrevet ovenfor, som generelt unngår behovet for en direkte oocyte størrelsesmåling.
In vitro-modning skal påbegynnes innen flere timer etter avslutningen av den dagslyset syklusen til hvilken hunn Oocytt donorer akklimatiseres. Eggceller vil ikke modne ordentlig, gjenspeiles i fattige befruktning priser, hvis dyrket i løpet av formiddagen perioden av lys syklus. Grunnen til circadian avhengighet av in vitro oocytmodningen metoden er ikke forstått, men sannsynlig reflekterer de underliggende cirkadianske skjevheter i in vivo-modning egg som involverer sykling-genekspresjon i løpet av oogenesen 21. En vanlig årsak til oocytter unnlate å gjennomgå vellykket in vitro modning til tross for riktig eggcelle staging er at DHP er utgått. DHP hormon generelt utløper etter et år, og for å sikre effektive modning, bør arbeids batch erstattes innen 9 måneders bruk.
Injeksjonen av oocytter er et kritisk trinn når formålet med denne metode er den funksjonelle manipulering av maternelle produkter. Denne prosedyren har krav som avviker fra dem for standard injeksjoner i det befruktede egget på 0-30 MPF. En viktig faktor i oocytt-injeksjon er det nødvendig å utføre injeksjonene under betingelser som ikke fører til for tidlig aktivering egg, slik som i Leibovitz L-15 medium 22, 23. Fordi de er innebygd i eggstokkene, modning oocytter også byr på spesielle utfordringer for injeksjon. Protokollen over antyder første dissosiering oocytter fra ovariene og deretter holder hver dissosiert oocytt separat med pinsett mens den injiseres. Denne teknikken har fungert godt og tillater forhåndssortering oocytter på det passende trinn med minimal håndtering. Alternative metoder kan også benyttes, for eksempelsom: i) plassering av oocytter til standard sprøyte agarose renner 15, hvor de vertikale vegger av trauet støtte oocytt under injeksjon (i denne alternative fremgangsmåten blir oocyttene må overføres til injeksjons plater mens det holdes i in vitro modning medium) og ii ) slik at oocyttene til å forbli festet til ovarian masse, som kan holdes med pinsetter under injeksjonen for å unngå kontakt med den injiserte oocyte (i denne tilnærmingen, oocyttene skulle være dissosiert etter injeksjonen for å både lette DHP eksponering og for å tillate deres defolliculation , selv avgjørende for IVF). Til tross for denne spesifikke utfordring, kan stadium IV oocytter lett kan gjennomtrenges med en injeksjonsnål, sannsynligvis fordi chorion membranen på dette stadium ikke er fullt utviklet 9.
En begrensning av den aktuelle modningsprotokollen er at in vitro modning betingelser som fremmer riktig oocytt utviklingkan ikke opprettes når oocytmodningen startes ved etapper tidligere enn stadium IV. Oocytter blir i stand til å svare på DHP ved gjennomgår modning når de når en diameter på 520 um, noe som skjer i løpet av fase III (vitellogenesis, svarende til en kapasitet på 340 til-690-pm området) 9. Imidlertid kulturen fra trinn III oocytter resulterer i oocytter som ikke er kompetente for befruktning 3. Oocytter bare hvis in vitro dyrking blir initiert ved trinn IV (figur 2B) kan utvikle seg til modne, trinnet V-oocytter (figur 2C og D). Dette kan henge sammen med det faktum at stadium III er en forutsetning for vitellogenesis og oocyte vekst 9. Således in vitro oocytmodningen fremgangsmåten presentert i denne artikkelen bør bare brukes sammen med en utgangspopulasjon av Stadium IV oocytter (B), og ikke med oocytter på tidligere stadier (stadiene I – III; Figur e <strong> 2A). Av samme grunn er denne fremgangsmåten begrenset til gener som blir uttrykt på et trinn IV eller senere. Den funksjonelle manipulering av gener hvis produkter er uttrykt tidligere, kan i stedet være avhengig av genetiske metoder (se nedenfor). Forbedringer av in vitro dyrking modningsmetoder kan i fremtiden tillate initiering av egg dyrking ved tidligere stadier, og dermed utvide kraften av in vitro-modning tilnærming.
En annen begrensning i den presenterte fremgangsmåten er at defolliculation, noe som er viktig for de etterfølgende trinn som involverer befruktning, er for tiden et hastighetsbegrensende trinn i prosedyren. Follikulær Membranen er et gjennomsiktig lag som omgir den utviklende oocyte, og fjerningen kan være kjedelig. Hvis denne membranen ikke er fullstendig fjernet, vil egg ikke blir fullt aktivert og gjødslet. Dette blir tydeliggjort ved svikt i chorion å ekspandere og utvikling av uregelmessig plassert, fure lignende structures (pseudocleavages), som er karakteristiske for Ledd embryoer 11. Enzymatiske defolliculation metoder, slik som kollagenase, som anvendt i Xenopus, har vært forsøkt. Men i våre hender, denne teknikken ikke har vært vellykket, og vi er avhengige derfor på manuell defolliculation. Fordi manuell defolliculation er arbeidskrevende og tidkrevende, er det vanskelig å få store grupper av befruktede egg etter in vitro oocytmodningen. På grunn av tidsmessige begrensning pålagt av manuell defolliculation som vi gjødsle noen defolliculated, modne egg om gangen, i små grupper på 5-10 egg. Innlemmelsen av enzymatisk defolliculation med denne prosedyren vil trolig øke sin avkastning og generell brukervennlighet.
Selv embryoer produsert etter befruktning av in vitro -matured ubefruktede egg kan bli levedyktig voksne, ser vi at etter in vitro fertilisering, en brøkdel av embryoer gjøre ikke deles på vanlig måte eller i tide. Vi er for tiden å velge for linjer hvis forplantnings omfatter runder med in vitro oocytmodningen, noe som kan resultere i mer robuste mønstre av utvikling i embryoer avledet gjennom denne metoden.
Fremgangsmåten har gjort det mulig for den klare redning eller visualisering av protein lokalisering for en rekke mutasjoner 24, 25. Imidlertid, for noen gener, kan regulering av produktet uttrykk være avgjørende, så produktene uttrykt ved injisert mRNA kan føre til varierende resultater 26. Det er også viktig å være oppmerksom på alle kontrollene (f.eks fostre som er injisert med reagenser som har lignende egenskaper som dem som anvendes i forsøket ennå er anslått å ikke produsere en effekt, slik som kontroll MOS eller RNA som koder for inerte proteiner bare, slik som GFP), som underliggende variabilitet kan føre til feilaktige konklusjoner.
nt "> Et forsøk som omfatter in vitro-manipulasjon, etterfulgt av befruktning er spesielt nyttig når det gjelder moderlig avsatte produkter, hvor den standard metode for å injisere RNA, MOS, eller protein inn i det befruktede egget kan ikke effektivt reduserer produkter som allerede er akkumulert i egget. andre nylig utviklede metoder, slik som CRISPR-mutant generasjon, er også effektive til å generere mutante betingelser for maternale uttrykte gener 26. imidlertid krever denne metoden veksten av flere generasjoner av fisk. in vitro oocytmodningen teknikken gjør det mulig for hurtig funksjonell manipulasjon for å studere funksjonen av matern uttrykte gener, inkludert redning og phenocopy av mors-effekt mutasjoner, så vel som ekspresjon av RNA og proteiner i tidlig embryo.The authors have nothing to disclose.
Vi ønsker å takke medlemmene av Pelegri lab og fisk anlegget ledelses ansatte, som var instrumental i å tilrettelegge dette prosjektet. Støtte for dette prosjektet ble gitt av NIH R56 GM065303 og NIH 2 T32 GM007133 til ELW, NIH 5 F31 GM108449-02 og NIH 2 T32 GM007133 til CCE, og NIH RO1 GM065303 til FP
Zebrafish mating boxes | Aqua Schwarz | SpawningBox1 | |
NaCl | Sigma | S5886 | |
KCl | Sigma | P5405 | |
Na2HPO4 | Sigma | S3264 | |
KH2PO4 | Sigma | P9791 | |
CaCl2 | Sigma | C7902 | |
MgSO4-7H2O | Sigma | 63138 | |
NaHCO3 | Sigma | S5761 | |
Tricaine | Western Chemical | Tricaine-D (MS 222) | FDA approved (ANADA 200-226) |
Tris base | Sigma | 77-86-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
HCl | Sigma | 920-1 | to prepare 1 M Tris pH 9.0 |
Fish net (fine mesh) (4-5 in) | PennPlax | (ThatFishThatPlace # 212370) | available in ThatFishThatPlace |
Plastic spoon | available in most standard stores | ||
Dissecting scissors | Fine Science Tools | 14091-09 | |
Dissecting forceps | Dumont | SS | available from Fine Science Tools |
Dissecting stereoscope (with transmitted light source) | Nikon | SMZ645 | or equivalent |
Reflective light source (LED arms) | Fostec | KL1600 LED | or equivalent |
Petri plates 10 cm diameter | any maker | ||
Eppendorf tubes 1.5 ml | any maker | ||
Ice bucket | any maker | ||
Narrow spatula | Fisher | 14-374 | |
Depression glass plate | Corning Inc | 722085 (Fisher cat. No 13-748B) | available from Fisher Scientific |
Paper towels | any maker | ||
Kimwipes | Kimberly-Clark | 06-666-11 | available from Fisher Scientific |
Timer stop watch | any maker | ||
Wash bottle | Thermo Scientific | 24020500 | available from Fisher Scientific |
beakers, 250 ml (2) | Corning Inc. | 1000250 | available from Fisher Scientific |
Leibovitz'z L-15 medium | Thermofisher | 11415064 | |
NaOH | Sigma | 221465 | for pH'ing |
BSA | Sigma | A2058 | |
17alph-20beta-dihyroxy-4-pregnen-3-one (DHP) | Sigma | P6285 | |
gentamicin | Sigma | G1272 | |
Injection Apparatus | Eppendorf | FemtoJet | or equivalent |
Capillary Tubing for injection needles | FHC | 30-30-1 | or equivalent, Borosil 1.0 mm OD x 0.5 mm ID with fiber, 100 mm |
Needle puller | Sutter Instruments | Model P-87 | any maker |
Micropipetor (1-20 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (20 – 200 µl range) with tips | any maker | ||
Micropipetor (100 – 1000 µl range) with tips | any maker | ||
Conical tubes 15ml | any maker | ||
Conical tubes 50ml | any maker | ||
plastic pipette 10 ml with bulb | any maker | ||
plastic pipette 20 ml with bulb | any maker | ||
Microscope stage Calibration Slide 0.01 mm | AmScope | MR095 | or equivalent |
Reagents for fish water: | |||
Instant Ocean Salt | Drs. Foster & Smith | CD-116528 | |
Sodium bicarbonate (cell culture tested) | Sigma | S5761-1KG | |
Reagents for E3 medium: | |||
NaCl | Sigma | S5886-1KG | |
KCl | Sigma | P5405-500G | |
CaCl2, dihydrate | Sigma | C7902-500G | |
MgSO4, heptahydrate | Sigma | 63138-250G | |
Methylene Blue | Sigma | M9140-25G | |
Fish Food: | |||
Frozen brine shrimp | Brine Shrimp Direct | FBSFKG50 | |
Tetramin Flakes | Drs. Foster & Smith | 16623 |