Dannelse af fluorescerende protein-fusioner i<em> Candida</em> Arter

Summary

PCR-medieret gen modifikation kan anvendes til at danne fluorescerende protein fusioner i Candida arter, hvilket letter visualisering og kvantificering af gærceller og proteiner. Heri præsenterer vi en strategi for at konstruere en fluorescerende protein fusion (Eno1-FP) i Candida parapsilosis.

Abstract

Candida-arter, fremherskende kolonisatorer af intestinale og urogenitale kanaler, er årsag til hovedparten af invasive svampeinfektioner hos mennesker. Således er der behov molekylære og genetiske værktøjer til at lette undersøgelsen af ​​deres sygdomsfremkaldende mekanismer. PCR-medieret gen modifikation er en enkel og hurtig fremgangsmåde til at generere epitopmærkede proteiner for at lette deres detektion. Navnlig fluorescerende protein (FP) fusioner er kraftfulde værktøjer, der giver visualisering og kvantificering af både gærceller og proteiner ved fluorescensmikroskopi og immunoblotting hhv. Plasmider indeholdende FP-kodende sekvenser, sammen med ernæringsmæssige markørgener, som letter omdannelsen af Candida arter, der er blevet genereret i forbindelse med FP konstruktion og ekspression i Candida. Heri præsenterer vi en strategi til at konstruere en FP fusion i en Candida-arter. Plasmider indeholdende nourseothricin Resistance transformation markørgen (Nat1) sammen med sekvenser for enten grøn, gul eller kirsebær RP'er (GFP, YFP, mCherry) anvendes sammen med primere, der omfatter genspecifikke sekvenser i en polymerasekædereaktion (PCR) til at generere en FP kassette . Dette gen-specifik kassette har evnen til at blive integreret i 3'-enden af ​​det tilsvarende gen locus ved homolog rekombination. Vellykket i ramme fusion af FP-sekvensen i genet locus af interesse er verificeret genetisk, efterfulgt af analyse af fusionsprotein-ekspression ved mikroskopi og / eller immuno-detektionsmetoder. Endvidere i tilfælde af højt udtrykte proteiner, succesrige fusioner kan screenes for primært ved fluorescens billeddannelsesteknikker.

Introduction

Candida-arter er kommensale svampe, der koloniserer tarmen og urogenitale kanaler for alle mennesker. Under forhold med immundefekt, såsom at forekomme med for tidlig fødsel eller immunosuppressive virkninger fra behandlinger for kræft, kan Candida arter blive opportunistiske patogener. De Candida arter, Candida albicans er den mest udbredte svampe colonizer og forårsager størstedelen af invasive svampeinfektioner. Andre Candida arter såsom C. glabrata, C. parapsilosis, C. tropicalis og C. kruseii også forårsage alvorlige infektioner hos immunkompromitterede patienter, med nogle udstiller iboende modstand mod almindeligt anvendte anti-svampe antibiotika såsom fluconazol og amphotericin B. Derfor infektioner med nogle af disse arter er ved at blive hyppigere, især hos patienter, der behandles profylaktisk med anti-svampe agenter. Selv med passende og rettidig enNTI-fungal behandling, invasive Candida-infektioner fortsat forbundet med betydelig morbiditet og mortalitet ^1. På grund af betydningen af Candida-arter i menneskers sundhed, er der behov for let tilgængelige molekylære værktøjer, der giver undersøgelse og belysning af deres sygdomsfremkaldende mekanismer.

Et vigtigt værktøj, der giver forskerne at visualisere og kvantificere mikrobielle celler, og de proteiner, som de udtrykker er FP fusionsteknologi. Polymerasekædereaktion (PCR) -medieret genetiske modifikation, som beskrevet i dette dokument, muliggør konstruktionen af fusioner mellem FP-sekvenser og en Candida-protein kodende sekvens af interesse ved dens genomiske locus. Stabil integration af konstruktionen letter analyse af proteinekspression samt proteinlokalisering dynamik. Plasmider indeholdende FP-sekvenser, der er optimeret til ekspression i Candida albicans, og som kan anvendes i PCR-medieret gene modifikation strategi, er tidligere blevet konstrueret ^{2, 3, 4, 5.} Plasmider indeholder FP transformation "kassetter": en FP-sekvens bundet til en ernæringsmæssig markør-gen, der letter omdannelse af C. albicans og C. parapsilosis ^{2, 3, 4, 5, 6, 7.} Øjeblikket tilgængelige plasmider indeholde forskellige selekterbare ernæringsmæssige markørgener (URA3, His1, ARG4) til transformation af auxotrofe stammer samt en dominerende lægemiddelresistensmarkør (Nat1), hvilket letter omdannelsen af kliniske stammer mangler auxotrofier. Hertil kommer, plasmider indeholder muligheder for op til fire forskellige FP sekvenser (grøn [GFP] yellow [YFP], cyan [FFP], og kirsebær [mCherry]) og enten en ADH1 termineringssekvens til konstruktion af carboxyterminus proteinfusioner, eller en promotorsekvens til konstruktion af aminoterminal proteinfusioner. Primere er designet med homologi til plasmid-DNA'et omkring FP kassetten. Desuden primerne indeholder også 5'-forlængelse sekvenser bærer homologi med gær genet af interesse, der skal mærkes, hvilket letter integration af kassetten i det genomiske locus via homolog rekombination (figur 1). Genspecifikke FP kassetter genereres ved PCR og derefter transformeret ind i Candida celler gjort kompetente til optagelse af DNA ved behandling med lithiumacetat.

Figur 1: Diagram over hvordan FP sekvens-fusioner genereres i Candida-arter. (A) Plasmid DNA herundes en FP og en sekvens, der koder nourseothricin resistens (Nat1). Relative placeringer af Forward (FWD) og reverse (REV) primere er vist, med sorte dele af primerne angiver regionen af ​​homologi til plasmidet sekvensen og den lilla dele der angiver genspecifikke homologi region eller primerforlængelse. (B) FP kassetter omdannes til Candida og integrere i ENO1 genomiske locus via homolog rekombination (stiplede linjer). (C) Resulterende FP fusion sekvens i 3'-enden af ENO1. Klik her for at se en større version af dette tal.

Heri præsenterer vi et eksempel på protein fusion (Eno1-FP) konstruktioner i Candida arter. Vi bruger tagging plasmider indeholdende Nat1 transformation markørgenet sammen med sekvenser, der koder GFP, YFP, ellermCherry (figur 2). Disse plasmider anvendes sammen med primere i PCR til at generere genspecifikke kassetter, der letter fusion af rammeprogrammerne til 3'-enden af ENO1, hvilket resulterer i ekspression af Eno1 fusioneret til fps ved dets carboxyterminal.

Figur 2: Kort over FP kassette-holdige plasmider. Forward (F) og reverse (R) primere anvendt til generering af kassetterne fra plasmiderne er indikeret sammen med den relative placering af deres homologi med plasmiderne. Primersekvenser er som opregnet i tabel 1. F1 og R1 blev også anvendt til at generere pYFP- Nat1 kassetten. Plasmidet indeholdende YFP- Nat1 kassetten (pMG2263) er identisk med pMG2120 med undtagelse af YFP i stedet for GFP-sekvensen. Kassette størrelser: GFP-Nat1, 3,7 kbp; mCherry- Nat1, 3,2 kb; YFP- Nat1, 3.7 kb. Dette tal har været ændret siden Gerami-Nejad, et al. ⁴ Klik her for at se en større version af dette tal.

Protocol

1. Isoler Template plasmider fra E. coli Grow E. coli indeholdende skabelonen plasmidet natten over i 10 ml lysogeni bouillon (LB) + 200 mg / l ampicillin (AMP) ved 37 ° C under omrystning. Harvest celler ved centrifugering ved 6.000 xg i 2 min. Dekanteres væske, isolere og oprense DNA fra E. coli-celler ved en standard fremgangsmåde som tidligere beskrevet i Ausubel et al. 8. Resuspender DNA i Tris-EDTA (TE; 10 mM Tr…

Representative Results

Som et eksempel har vi benyttet forskrift ovenfor beskrevet for at konstruere GFP og mCherry fusioner til Eno1 i en C. parapsilosis laboratoriestamme. Hver formodet transformant blev oprindeligt genudstrøget for vækst. I dette eksempel, eftersom det resulterende fusionsprotein udtrykkes kraftigt (enolase) og rammeprogrammerne er lyse, kunne vi screene transformanter ved fluorescensmikroskopi forud for udførelse diagnostisk PCR (figur 3) 6.</…

Discussion

Konstruktion af epitop-tagget sekvenser i Candida-arter ved hjælp af PCR-medieret gen modifikation er beskrevet ovenfor kan sammenfattes som en tre-trins proces. Først en kassette fremstillet ved PCR, der koder både den ønskede for integration og regioner homolog til stedet for indsættelse i gærgenomet sekvens. For det andet er gærcellerne skal transformeres foretages kemisk kompetente med lithiumacetat og co-inkuberet med kassetten. Tredje cellerne udpladet på selektive medier for at inddrive transform…

Materials

100W mercury lamp	CHIU Technical Corporation	M-100T
95% Ethanol	Any	NA
Adenine	Any	NA
Ampicillin	Any	NA
Carrier DNA	Ambion	AM9680	Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml
CCD Camera	Photometrics	CoolSNAP HQ
Conical Tube	Corning	430828	50ml
Culture Tube Rotator	New Brunswick	2013923	TC-8, or Any Culture Tube Rotator
Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade	Any	NA
Eppendorf Tubes	Eppendorf	022363719, 022363212	0.5ml, 1.5ml
Erlenmeyer Flask	Fisher Scientific	7250089	125ml
Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)	Any	NA
Freezer (-80 °C )	Thermo Electron Corporation	ULT-1386-9-V	Revco Ultima II
GFP, YFP and Texas Red Filter Sets	Chroma Technology Corporation	49002, 86004v2, 49008
Glass culture tubes	Fisher Scientific	1496126	75mm
HRP goat anti-mouse antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2005
HRP goat anti-rabbit antibody	Santa Cruz Biotechnology	SC-2301
Incubator (30 °C )	Any	NA
Lithium Acetate	Any	NA
Lysogeny Broth (LB) Media	Any	NA
Magnesium Chloride	Any	NA
Microcentrifuge	Eppendorf	5415 D
Microscope	Nikon	E600	Nikon Eclipse E600
Microscope Image Analysis Software	Universal Imaging Corporation	6.3r7	MetaMorph Software Series 6.3r7
Mouse anti-GFP antibody	Roche	11814460001
Nourseothricin	Fisher Scientific	50997939
PCR Thermocycler	Applied Biosystems	9700	GeneAmp PCR System
PCR tubes	BioExpress, GeneMate	T-3035-1	0.2ml
Polyethylene Glycol 3350	Any	NA
Potassium Chloride	Any	NA
Rabbit anti-mCherry antibody	BioVision	5993-100
Refrigerator (4°C)	Any	NA
Sodium Acetate	Any	NA
Stereomicroscope	Nikon	SMZ1500
Table Top Centrifuge	Labnet	Z 400	Hermle Z 400
Taq DNA Polymerase	Any	NA
Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris)	Any	NA
Vortex Mixer	Scientific Industries	SI-0236	Vortex Genie 2
Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media	Any	NA