में फ्लोरोसेंट प्रोटीन Fusions की पीढ़ी<em> कैंडिडा</em> प्रजाति
Summary
पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन कैंडिडा प्रजाति है, जो दृश्य और खमीर कोशिकाओं और प्रोटीन के quantitation की सुविधा में फ्लोरोसेंट प्रोटीन fusions उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है। इस के साथ साथ, हम कैंडिडा parapsilosis में एक फ्लोरोसेंट प्रोटीन संलयन (Eno1-एफपी) के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करते हैं।
Abstract
कैंडिडा प्रजातियों, आंतों और genitourinary इलाकों की प्रचलित उपनिवेशवादियों, मनुष्यों में आक्रामक फंगल संक्रमण के बहुमत के कारण कर रहे हैं। इस प्रकार, आणविक और आनुवंशिक उपकरणों उनकी रोगजनन तंत्र के अध्ययन की सुविधा के लिए आवश्यक हैं। पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन के लिए एक सरल और त्वरित दृष्टिकोण उनका पता लगाने की सुविधा के लिए मिलान टैग प्रोटीन उत्पन्न करने के लिए है। विशेष रूप से, फ्लोरोसेंट प्रोटीन (एफपी) fusions शक्तिशाली उपकरण है कि प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोपी और immunoblotting क्रमश दृश्य और दोनों खमीर कोशिकाओं और प्रोटीन के quantitation अनुमति देते हैं। एफपी एन्कोडिंग दृश्यों से युक्त, पोषण मार्कर जीन है कि Candida प्रजातियों के परिवर्तन की सुविधा के साथ-साथ plasmids, एफपी निर्माण और कैंडिडा में अभिव्यक्ति के प्रयोजन के लिए उत्पन्न किया गया है। इस के साथ साथ, हम एक Candida प्रजातियों में एक एफपी संलयन के निर्माण के लिए एक रणनीति प्रस्तुत करते हैं। nourseothricin resista युक्त plasmidsnce परिवर्तन मार्कर जीन (NAT1) या तो हरे, पीले, या चेरी एफपीएस (GFP, YFP, mCherry) प्राइमरों है कि एक पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) में जीन विशिष्ट दृश्यों में शामिल हैं के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं एक एफपी कैसेट उत्पन्न करने के लिए दृश्यों के साथ साथ । यह जीन विशिष्ट कैसेट मुताबिक़ पुनर्संयोजन के माध्यम से इसी जीन ठिकाना का 3'अंत में एकीकृत करने की क्षमता है। ब्याज की जीन ठिकाना में एफपी अनुक्रम के सफल में फ्रेम संलयन आनुवंशिक रूप से सत्यापित, माइक्रोस्कोपी और / या इम्युनो-तरीकों का पता लगाने से संलयन प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के बाद है। इसके अलावा, अत्यधिक व्यक्त प्रोटीन के मामले के लिए, सफल fusions मुख्य रूप से के लिए प्रतिदीप्ति इमेजिंग तकनीक के द्वारा जांच की जा सकती है।
Introduction
कैंडिडा प्रजातियों खानेवाला कवक है कि सभी मनुष्यों की आंतों और genitourinary इलाकों उपनिवेश स्थापित कर रहे हैं। ऐसी है कि समय से पहले जन्म या कैंसर के लिए उपचार से immunosuppressive प्रभाव के साथ होते हैं के रूप में इम्यूनो की शर्तों के तहत, कैंडिडा प्रजातियों अवसरवादी रोगजनकों बन सकता है। कैंडिडा प्रजातियों में से, कैंडिडा सफेद सबसे अधिक प्रचलित फंगल उपनिवेशवादी है और आक्रामक फंगल संक्रमण के बहुमत का कारण बनता है। ऐसे सी glabrata, सी parapsilosis, सी tropicalis, और सी के रूप में अन्य कैंडिडा प्रजातियां भी कुछ प्रदर्शन आंतरिक प्रतिरोध के साथ, immunocompromised रोगियों में गंभीर संक्रमण का कारण kruseii सामान्यतः इसलिए इस्तेमाल करने के लिए इस तरह के fluconazole और amphotericin बी के रूप में एंटी-फंगल एंटीबायोटिक दवाओं, इन प्रजातियों में से कुछ के साथ संक्रमण विशेष रूप से रोगियों prophylactically एंटी-फंगल एजेंटों के साथ इलाज किया जा रहा में अधिक बार मनाया जा रहा है। यहाँ तक कि उचित और समय पर एक साथएनटीआई कवक उपचार, आक्रामक कैंडिडा संक्रमण के महत्वपूर्ण रुग्णता और मृत्यु दर 1 के साथ जुड़े होने के लिए जारी है। मानव स्वास्थ्य में Candida प्रजातियों के महत्व की वजह से, आसानी से उपलब्ध आणविक उपकरण है कि अध्ययन और उनके रोगजनन तंत्र की व्याख्या की अनुमति देने के लिए एक की जरूरत है।
एक महत्वपूर्ण उपकरण है कि शोधकर्ताओं ने कल्पना और माइक्रोबियल कोशिकाओं और प्रोटीन है कि वे व्यक्त यों की अनुमति देता है एफपी संलयन प्रौद्योगिकी है। पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर) मध्यस्थता जीन संशोधन, इस पत्र में वर्णित के रूप में, fusions के निर्माण, एफपी दृश्यों और एक Candida प्रोटीन अपने जीनोमिक ठिकाना पर ब्याज के अनुक्रम कोडिंग के बीच की अनुमति देता है। निर्माण के स्थिर एकीकरण प्रोटीन अभिव्यक्ति के विश्लेषण के साथ ही प्रोटीन स्थानीयकरण गतिशीलता की सुविधा। एफपी दृश्यों से युक्त plasmids, कैंडिडा सफेद में अभिव्यक्ति के लिए अनुकूलित और कहा कि पीसीआर की मध्यस्थता ग्राम में इस्तेमाल किया जा सकताएकदा संशोधन रणनीति, पहले 2, 3, 4, 5 निर्माण किया गया है। एक एफपी अनुक्रम एक पोषण मार्कर जीन है कि सी सफेद और सी parapsilosis 2, 3, 4, 5, 6, 7 के परिवर्तन की सुविधा से जोड़ा: प्लास्मिड एफपी परिवर्तन "कैसेट" होते हैं। वर्तमान में उपलब्ध plasmids चयन पोषण मार्कर जीन (URA3, HIS1, ARG4) auxotrophic उपभेदों के परिवर्तन के लिए और साथ ही एक प्रमुख दवा प्रतिरोध मार्कर (NAT1), जो auxotrophies कमी नैदानिक उपभेदों के परिवर्तन की सुविधा की एक किस्म के होते हैं। इसके अलावा, plasmids Yello अप करने के लिए चार अलग-अलग दृश्यों एफपी (हरी [GFP], के लिए विकल्पों में शामिलw [YFP], सियान [सीएफपी], और चेरी [mCherry]) और carboxy टर्मिनस प्रोटीन fusions के निर्माण, या अमीनो टर्मिनस प्रोटीन fusions के निर्माण के लिए एक प्रमोटर अनुक्रम के लिए एक ADH1 समाप्ति अनुक्रम हैं या तो। प्राइमर एफपी कैसेट आसपास के डीएनए को समरूपता के साथ डिजाइन किए हैं। इसके अलावा, प्राइमरों भी ब्याज की खमीर जीन चिह्नित किया है, जो मुताबिक़ पुनर्संयोजन (चित्रा 1) के माध्यम से जीनोमिक ठिकाना में कैसेट के एकीकरण की सुविधा के लिए असर अनुरूपता 5'-विस्तार दृश्यों होते हैं। जीन विशिष्ट एफपी कैसेट पीसीआर द्वारा उत्पन्न कर रहे हैं और उसके बाद लिथियम एसीटेट के साथ इलाज के द्वारा डीएनए के तेज के लिए सक्षम बनाया कैंडिडा कोशिकाओं में तब्दील हो।
चित्रा 1: कैसे एफपी अनुक्रम fusions कैंडिडा प्रजातियों में उत्पन्न कर रहे हैं का आरेख। (ए) प्लास्मिड डीएनए समेततों एक एफपी अनुक्रम और nourseothricin प्रतिरोध (NAT1) एक दृश्य एन्कोडिंग। फॉरवर्ड (अग्रेषित) और रिवर्स (REV) प्राइमरों के सापेक्ष स्थानों प्राइमरों प्लाज्मिड अनुक्रम करने के लिए अनुरूपता के क्षेत्र का संकेत है और बैंगनी रंग के कुछ भागों जीन विशिष्ट अनुरूपता क्षेत्र या प्राइमर विस्तार दर्शाने के काले भागों के साथ दिखाया जाता है। (बी) एफपी कैसेट कैंडिडा में तब्दील कर रहे हैं और मुताबिक़ पुनर्संयोजन (बिंदीदार रेखा) के माध्यम से ENO1 जीनोमिक ठिकाना भीतर एकीकृत। (सी) ENO1 की 3'end पर जिसके परिणामस्वरूप एफपी संलयन अनुक्रम। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
इस के साथ साथ, हम कैंडिडा प्रजातियों में प्रोटीन संलयन (Eno1-एफपी) निर्माण का एक उदाहरण प्रस्तुत करते हैं। हम एन्कोडिंग GFP, YFP दृश्यों के साथ साथ NAT1 परिवर्तन मार्कर जीन युक्त plasmids टैगिंग का उपयोग, याmCherry (चित्रा 2)। ये प्लास्मिड जीन विशिष्ट कैसेट कि ENO1 की 3'अंत एफपीएस के विलय की सुविधा उत्पन्न करने के लिए, Eno1 की अभिव्यक्ति अपनी carboxy टर्मिनस पर एफपीएस के लिए जुड़े हुए है, जिसके परिणामस्वरूप पीसीआर में प्राइमरों के साथ किया जाता है।
चित्रा 2: एफपी कैसेट युक्त plasmids के मानचित्र। फॉरवर्ड (एफ) और रिवर्स (आर) plasmids से कैसेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया प्राइमरों plasmids के लिए उनकी अनुरूपता के रिश्तेदार स्थान के साथ संकेत कर रहे हैं। प्राइमर दृश्यों 1 टेबल में सूचीबद्ध के रूप में कर रहे हैं। F1 और R1 भी pYFP- NAT1 कैसेट उत्पन्न करने के लिए इस्तेमाल किया गया। प्लाज्मिड YFP- NAT1 कैसेट (pMG2263) युक्त GFP अनुक्रम के स्थान पर YFP के अपवाद के साथ pMG2120 के समान है। कैसेट आकार: GFP-NAT1, 3.7 KBP; mCherry- NAT1, 3.2 KBP; YFP- NAT1, 3।7 KBP। यह आंकड़ा Gerami-नेजाद, एट अल से संशोधित किया गया है। 4 यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
मिलान के निर्माण में टैग पीसीआर की मध्यस्थता जीन संशोधन रणनीति ऊपर वर्णित का उपयोग कर कैंडिडा प्रजातियों में दृश्यों एक तीन कदम प्रक्रिया के रूप में संक्षेप किया जा सकता है। सबसे पहले, एक कैसेट पी?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
हम मूल mCherry एफपी अनुक्रम प्रदान करने के लिए एन डीन धन्यवाद, एम Gerami-नेजाद plasmids के निर्माण के लिए, इस परियोजना के विकास के दौरान उपयोगी सलाह के लिए तकनीकी सहायता के लिए बी लार्सन, और टी Heisel। जेबी यूरोपीय अनुसंधान परिषद उन्नत पुरस्कार 340087 (RAPLODAPT) द्वारा समर्थित किया गया। माइक्रोस्कोपी और इमेजिंग सिस्टम मिनेसोटा बाल रोग फाउंडेशन के विश्वविद्यालय और मिनेसोटा इमेजिंग सेंटर के विश्वविद्यालय द्वारा प्रदान किया गया।
Materials
| 100W mercury lamp | CHIU Technical Corporation | M-100T | |
| 95% Ethanol | Any | NA | |
| Adenine | Any | NA | |
| Ampicillin | Any | NA | |
| Carrier DNA | Ambion | AM9680 | Sheared Salmon Sperm DNA 10 mg/ml |
| CCD Camera | Photometrics | CoolSNAP HQ | |
| Conical Tube | Corning | 430828 | 50ml |
| Culture Tube Rotator | New Brunswick | 2013923 | TC-8, or Any Culture Tube Rotator |
| Deoxynucleotides (dNTP) PCR Grade | Any | NA | |
| Eppendorf Tubes | Eppendorf | 022363719, 022363212 | 0.5ml, 1.5ml |
| Erlenmeyer Flask | Fisher Scientific | 7250089 | 125ml |
| Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) | Any | NA | |
| Freezer (-80 °C ) | Thermo Electron Corporation | ULT-1386-9-V | Revco Ultima II |
| GFP, YFP and Texas Red Filter Sets | Chroma Technology Corporation | 49002, 86004v2, 49008 | |
| Glass culture tubes | Fisher Scientific | 1496126 | 75mm |
| HRP goat anti-mouse antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2005 | |
| HRP goat anti-rabbit antibody | Santa Cruz Biotechnology | SC-2301 | |
| Incubator (30 °C ) | Any | NA | |
| Lithium Acetate | Any | NA | |
| Lysogeny Broth (LB) Media | Any | NA | |
| Magnesium Chloride | Any | NA | |
| Microcentrifuge | Eppendorf | 5415 D | |
| Microscope | Nikon | E600 | Nikon Eclipse E600 |
| Microscope Image Analysis Software | Universal Imaging Corporation | 6.3r7 | MetaMorph Software Series 6.3r7 |
| Mouse anti-GFP antibody | Roche | 11814460001 | |
| Nourseothricin | Fisher Scientific | 50997939 | |
| PCR Thermocycler | Applied Biosystems | 9700 | GeneAmp PCR System |
| PCR tubes | BioExpress, GeneMate | T-3035-1 | 0.2ml |
| Polyethylene Glycol 3350 | Any | NA | |
| Potassium Chloride | Any | NA | |
| Rabbit anti-mCherry antibody | BioVision | 5993-100 | |
| Refrigerator (4°C) | Any | NA | |
| Sodium Acetate | Any | NA | |
| Stereomicroscope | Nikon | SMZ1500 | |
| Table Top Centrifuge | Labnet | Z 400 | Hermle Z 400 |
| Taq DNA Polymerase | Any | NA | |
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane (Tris) | Any | NA | |
| Vortex Mixer | Scientific Industries | SI-0236 | Vortex Genie 2 |
| Yeast Extract Peptone Dextrose (YPD) Media | Any | NA |
References
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