Vi præsenterer en model af ligamentvæv, hvor tredimensionelle konstruktioner behandles med det menneskelige træningskonditionerede serum og analyseres for kollagenindhold, funktion og cellulær biokemi.
In vitro eksperimenter er essentielle for at forstå biologiske mekanismer; Imidlertid er kløften mellem monolagsvævskultur og humanfysiologi stor, og oversættelse af resultater er ofte dårlig. Således er der rig mulighed for alternative eksperimentelle tilgange. Her præsenterer vi en fremgangsmåde, hvor humane celler isoleres fra menneskelige forreste korsbåndsvævrester, udvides i kultur og bruges til at danne manipulerede ledbånd. Øvelse ændrer det biokemiske miljø i blodet, således at funktionen af mange væv, organer og kropslige processer forbedres. I dette eksperiment blev ligamentkonstruktionskulturmedier suppleret med eksperimentelt humant serum, der er blevet "konditioneret" ved motion. Interventionen er således mere biologisk relevant, da et eksperimentelt væv udsættes for det fulde endogene biokemiske miljø, herunder bindingsproteiner og hjælpestoffer, der kan ændres i tandem med aktiviteten af enUkendt agent af interesse. Efter behandling kan manipulerede ledbånd analyseres for mekanisk funktion, kollagenindhold, morfologi og cellulær biokemi. Samlet set er der fire store fordele i forhold til traditionelle monolagskulturer og dyremodeller, af den fysiologiske model af ligamentvæv, der præsenteres her. For det første er ligamentkonstruktioner tredimensionelle, hvilket giver mulighed for mekaniske egenskaber ( dvs. funktion) som ultimativ trækspænding, maksimal trækbelastning og modul, der skal kvantificeres. For det andet kan entesheden, grænsefladen mellem boney og sengeelementer, undersøges i detaljer og inden for funktionel sammenhæng. For det tredje gør forberedelsen af medier med efter-motion-serum mulighed for at undersøge virkningerne af det øvelsesinducerede biokemiske miljø, som er ansvarligt for den brede vifte af sundhedsfordele ved motion, på en upartisk måde. Endelig fremmer denne eksperimentelle model videnskabelig forskning på en human og etisk måde ved at erstatte brugen afDyr, et kernemandat for de nationale institutter for sundhed, Center for sygdomsbekæmpelse, og Food and Drug Administration.
Tendon og ledbåndskader er almindelige og kan have svækkende konsekvenser for normal mobilitet og livskvalitet. Kirurgisk indgreb er ofte nødvendig, men kan have begrænset og varieret succes 4 , 5 . Den nuværende forståelse af hvordan sener og ledbånd udvikler sig, modnes og reagerer på skade er ufuldstændige, og der er derfor behov for effektive forskningsmodeller for at give indsigt i udviklingen af mere effektive behandlinger 5 . For at imødegå dette vidensforskel kan dyremodeller anvendes, men in vivo undersøgelser er i sagens natur komplekse med vanskeligheder med at kontrollere miljøet og direkte målrette indgreb til det tilsigtede væv. I modsætning hertil kan det eksperimentelle miljø let styres og overvåges in vitro med traditionel monolagscellekultur. Denne teknik kan imidlertid oversimplificere det kemiske og mekaniske miljø og kan derfor ikke genopbyggeSen in vivo opførsel af cellerne. Vævsteknik er i stand til at gifte sig med fordelene ved det komplekse in vivo miljø i dyremodeller med kontrol af in vitro- miljøet og giver et ekstra værktøj til at studere fysiologi. Derudover bevæbnet med en bedre forståelse af ligamentudvikling kan vævsteknik også give en kilde til graftvæv, når kirurgisk genopbygning er påkrævet 6 . Således validerer den her beskrevne metode et in vitro 3D-konstrueret væv, som kan anvendes til at studere ligamentfunktion og morfologi.
Fibrinbaserede sener eller ligamentkonstruktioner er blevet anvendt som en in vitro- model til at studere fysiologiske processer, herunder kollagenfibrillogenese 7 og senudvikling 8 såvel som translationelle anvendelser, hvor deres anvendelighed som transplantatvæv er blevet evalueret i en fårmodel af anterior cruCiate ligament (ACL) rekonstruktion 9 . Vores laboratorium har tidligere etableret en 3D-konstrueret ligamentmodel, der spænder over to børster, et calciumphosphatben-substitutionsmateriale, cementankre. Denne model kan med lethed underkastes forskellige eksperimentelle betingelser ved blot at supplere kulturmediet med biologiske faktorer 10 eller anvende mekanisk stimulering 11 . Det er vigtigt, at denne ben-til-ben-ligamentmodel giver mulighed for en dybdegående analyse af entesheden, grænsefladen mellem boney og sinuselementer, som er udsat for skade.
I undersøgelsen fremhævet 1 her for at præsentere denne metode var vi interesserede i effekten af træningsfremkaldte ændringer i det biokemiske miljø på ligamentfunktionen. Øvelse forbedrer cellulær og organfunktion i en række forskellige væv i hele kroppen 2 , 3 , </suP> 12 , en virkning, der kan tilskrives frigivelsen af forskellige kendte (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-lignende 15 , exosomer 16 , 17 ) og andre ukendte, biokemiske faktorer frigivet til systemisk cirkulation . Desuden er det biokemiske miljø efter træning beriget med træningsfølsomme hormoner, hvis frigivelse stimuleres af sympatisk nervesystemstimulering af sekretoriske kirtler ( f.eks . Cortisol og catecholaminer fra binyren 18 og væksthormon fra den forreste hypofyse 19 ). Imidlertid er det ikke muligt at differentiere virkningerne af den mekaniske stimulus af motion fra træningsfremkaldte biokemiske ændringer. Mens nogle undersøgelser har karakteriseret den forventede stigning i visse cirkulerende hormoner og cytokiner som reaktion på exercisE som nævnt ovenfor, er der for mange faktorer, både kendte og ukendte, til trofast at rekapitulere in vitro. Det vil sige at isolere nogle få faktorer til en in vitro- undersøgelse tager ikke tilstrækkeligt hensyn til kompleksiteten af det biokemiske respons. I denne undersøgelse undersøgte vi, hvordan ændringer i det serum biokemiske miljø, som følge af motion, påvirker manipuleret ligamentfunktion. For at isolere virkningerne af de biokemiske forandringer opnåede vi serum fra menneskelige deltagere før og efter en kamp mod modstandsdygtighed og brugte den til at behandle 3D-manipulerede ledbånd dannet ved hjælp af human-anterior-korsbånds fibrometre. Ved hjælp af denne model kan vi opnå funktionelle data, herunder effekter på mekaniske egenskaber og kollagenindhold, samt kvantificere effekter på molekylær signalering.
Det nuværende manuskript beskriver en model af ligamentvæv, som er en nyttig forsøgsplatform for efterforskere med et bredt spektrum af forskningsemner, fra vævsudvikling til translationelle / kliniske spørgsmål. Den konstruerede ligamentmodel, der beskrives her, er baseret på en alsidig protokol, som kan tilpasses på forskellige punkter i hele arbejdsprocessen ( Figur 1 og Diskussionsafdeling ). Endvidere kan den iboende reduktionstype af in vitro- miljøet bringes nærmere til det fysiologiske område ved at supplere fodermedier med konditioneret humant eller dyre serum.
Konstruktioner kan dannes under anvendelse af fibroblaster fra en række forskellige kilder
Mens de metodologier og repræsentative resultater, der er vist her, er baseret på anvendelsen af primære ACL-fibroblaster, kan celleisoleringsprotokollen justeres til indsamling af andre typer af primære fibroblaster. Som beskrevetI figur 4 viser manipulerede ledbånd dannet med primære celler isoleret fra unge humane donorer lav donorvariabilitet. Primære celler er begrænset af indledende isolering og passagebegrænsning; Brugen af cellelinier kan forbedre reproducerbarheden af forsøgene. Anvendelsen af andre celletyper kan kræve modifikationer i cellekulturmedier og fibringelformulering. For eksempel har vi observeret, at humane mesenkymale stamceller (MSC'er) ikke er i stand til at danne lineære væv mellem pensitcementcementankrene i løbet af 2 uger, mens heste overlegen digitale flexor tendon fibroblaster, hestbenmargstromaceller, kyllingembryonale senebenfibblaster , Og murine C3H10T1 / 2 MSC'er kontraherer hurtigt og fordøjer fibringelen til dannelse af et lineært væv (upublicerede observationer). Denne kontrast kan være en konsekvens af forskelle i cellekontraktilitet, proliferation og fibrinolytisk enzymproduktion.
Anvendelse af kemikalierOg mekanisk stimulering
I den her beskrevne fremgangsmåde danner fibrinbaseret væv omkring borstelitcementankre, hvilket tillader anvendelse af mekanisk stimulering via en strækbioreaktor 11 såvel som til endepunktstræksprøvning. Tilstedeværelsen af brushite cement-blødt vævsinterface (enthesis) giver også mulighed for yderligere undersøgelse og forbedring 22 , 26 (se afsnittet Kliniske applikationer nedenfor). I dette in vitro- miljø kan bidraget fra kemiske og mekaniske faktorer lettere identificeres; Et eksempel på dette er vist i figur 5 , hvorved effekten af det post-øvende serummiljø blev skilt fra de mekaniske stimuli af motion. Pilotundersøgelser kan være nødvendige for at bestemme tidsrammen for forsøgsinterventioner, sammensætning af behandlinger og passende endepunkter for at forvente en observerbar ændring. foFor eksempel i undersøgelsen efter udøvelse af serum 1 blev længden af forsøgsbehandling begrænset af forsyningen af serum anvendt til at supplere medier, hvorfra konstruktioner blev fodret hver anden dag. I løbet af den anden kulturuge blev der desuden suppleret dyrkningsmedier med hvile eller efterøvelse serum med ascorbinsyre og L-prolin bibeholdt, mens TGF-β1 blev fjernet. TGF-β1 er en kendt profibrotisk vækstfaktor, som øges i serum efter øvelse 27 . For at undgå at forhindre TGF-β1-relaterede virkninger af post-motion-serumet blev dette cytokin ikke bibeholdt i dyrkningsmediet.
Denne konstruerede ligamentmodel kan også bruges til at teste effekten af mekanisk strækning. Ved at konstruere omvendt modellerede greb til at holde penselt cement ankerendene (svarende til den uniaxiale trækstester, der er vist i figur 1 ), kan strækbioreaktorer være designet til at rumme eng Inerede ledbånd. Vores laboratorium har tidligere brugt denne model til at undersøge det molekylære signalrespons af manipulerede ledbånd til uniaxial trækspænding i en skræddersyet bioreaktor 11, som vil give en bedre forståelse for det rationelle design af et in vitro strækparadigme eller endog potentielt in vivo Stretch / aktivitet / terapeutiske applikationer.
Vurdering af konstruerede ledbånd
Som med traditionel monolagskultur kan 3D-konstruktioner analyseres for gen / proteinekspression; Desuden giver deres 3D-morfologi mulighed for at vurdere funktionelle og morfologiske ændringer, og konstruktioner kan opretholdes i kultur til langsigtede studier ( figur 3 ). Mens manipulerede ledbånd ikke er ækvivalente med native, modne ledbånd, har de lighed med at udvikle sener / ledbånd og opfører sig på samme måde som nativt væv som reaktion på næringsstoffer"> 26, vækstfaktorer 10 , hormoner 25 og øvelse 11 , 28. Selvom forsigtighed er berettiget, inden der foretages brede generaliseringer fra en hvilken som helst in vitro model, kan resultater fra ligamentkonstruktionstest muligvis afsløre eller oplyse en bestemt fysiologisk mekanisme, som ellers kunne være Umuligt at undersøge in vivo.
Suppler fodermedier med konditioneret serum til en fleksibel og dynamisk model med brede anvendelser
Det humane serummetabolom er et miljø med ~ 4.500 forbindelser, herunder, men ikke begrænset til, glycoproteiner, lipoproteiner, lipidderivater, energisubstrater, metabolitter, vitaminer, enzymer, hormoner, neurotransmittere og en overflod af byggesten / mellemprodukter. 29 Yderligere undersøgelse af det humane serummetabolom ifølge forbindelsesklasser 29 afslører additiOnal fordele ved at integrere eksperimentelt serum i in vitro eksperimenter. Det vil sige, at størstedelen af de ~ 4500 forbindelser i serum er hydrofobe eller lipidafledte, hvilket understreger vigtigheden af bindende proteiner til transport / solubilisering. Det følger heraf, at eksperimentelt rekapitulerende endogene forbindelser transportdynamik, og dermed biotilgængelighed og sammensatte mål-interaktioner, ville være næsten umulige. Eksperimentelt serum er således særligt effektivt til undersøgelse af forbindelser, som er kendt for at afhænge af tilbehørsmolekyler til opløselighed, transport, målbinding og virkningsmekanisme.
Vores laboratorium har en langvarig interesse for de sundhedsmæssige fordele ved motion. Øvelse forbedrer cellulær og organfunktion i en række forskellige væv i hele kroppen 12 , en virkning, som kan tilskrives en række faktorer (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-lignende 15 ,Exosomer 16 , 17 ), der frigives til systemisk cirkulation. Det biokemiske miljø efter træning afspejler faktorer, der frigives både fra kontraherende skelettmuskulære træningsresponsive hormoner samt faktorer, der frigives som følge af sympatisk nervesystemstimulering af sekretoriske kirtler ( f.eks . Cortcholaminer og catecholaminer fra binyren 18 og vækst Hormon fra den forreste hypofyse 19 ). Vi har for nylig brugt en model af præ- og post-motion serum til at undersøge virkningerne af det motion-inducerede biokemiske miljø på manipuleret væv. 1 Mens mange vigtige øvelsesrelaterede forskningsspørgsmål forbliver, er modellen på ingen måde begrænset på denne måde. For eksempel kan serum opnås enten fra dyr eller mennesker, efter diæt eller farmakologisk intervention eller fra forskellige aldersgrupper eller klinisk populationS 30 . På denne måde vil eksogene eller endogene forbindelser af interesse være til stede i serum og behandlingsmedier i biotilgængelige mængder og vil interagere med målvævet i samspil med det endogene miljø ( dvs. i en mere fysiologisk sammenhæng). Denne fremgangsmåde er dynamisk, da det er højst sandsynligt, at en given intervention vil udøve en multi-organ (og multi-compound) effekt, og således vil det fysiologiske miljø blive co-modificeret. Selvom denne tilgang præsenterer visse udfordringer, da flere systemiske biokemiske variable ændres samtidigt, er det en fremgangsmåde, der kan hjælpe med at overvinde ulemperne ved rent reduktionsistisk eksperimentel metode 31 , 32 . Tværtimod kan implementering af konditioneret serum sammen med et vævsmonteret ( in vitro biomimetisk ) væv anvendes som et redskab til fysiologi, ernæring og kliniske forskningsspørgsmål.
<stronG> Kliniske applikationer er talrige
Den tissue engineering model, der præsenteres her, kan bruges til at undersøge anatomiske og kliniske forsknings spørgsmål, som traditionelle in vitro modeller ikke kan. Et ligament eller en senge in vivo indeholder en soft-to-hard tissue-overgangsregion kaldet enthesis. Induktionen, som er sårbar over for mekanisk stressrelateret skade 33 , kan studeres i tværsnit via histokemiske og elektronmikroskopiteknikker 22 , 26 . Denne unikke grænseflade er dobbelt vigtig for dem med lav eller begrænset mobilitet, da fysisk inaktivitet vanskeliggør bindevævets evne til at overføre belastning til regioner med lav til høj overensstemmelse 34 , hvilket resulterer i et generelt fald i vævsoverensstemmelse og øget risiko for skade.
Vores laboratorium har for nylig brugt denne tissue engineering model 25 </ Sup> at modelere en anden befolkning, kvindelige atleter, der er i fare for bindevævskader: forekomsten af ACL-skade er cirka fem gange større end deres mandlige modparter 35 . Potentielle mekanismer, der understøtter denne kønsbestemte forskel i skade, blev undersøgt ved behandling af ligamentkonstruktioner med fysiologiske koncentrationer af det kvindelige kønshormon, østrogen, i koncentrationer, der efterlignede stadier af menstruationscyklussen. Interessant hæmmede høje koncentrationer af østrogen genekspression og aktivitet af lysloxidase, det primære enzym, der var ansvarlig for dannelse af lysin-lysin-tværbindinger i collagenmatrixen af ledbånd og sener. Det er vigtigt, at 48 h høj østrogen (til simulering af follikelfasen) nedsatte ligamentkonstruktiviteten uden at ændre kollagendensiteten af konstruktionerne. Ud fra et fysiologisk perspektiv antyder dette, at stigninger i ligamentlaksighed hos kvinder kan skyldes, i det mindste delvist, at formindskesTværbindingsdannelse. Fra et eksperimentelt perspektiv fremhæver disse fund 25 brugen af 3D-konstruktormodellen, hvilket tillod funktionel tværbinderaktivitet, der skal undersøges. Fra et klinisk synspunkt kan denne model nu bruges til hurtigt at skærmme for interventioner, som kan forhindre de negative virkninger af ligamentfunktion østrogen.
Afsluttende bemærkninger
Her har vi præsenteret en detaljeret metode til dannelse af manipulerede ledbånd og deres anvendelighed som en 3D in vitro vævsmodel. Modellen er yderst tilpasselig til en bred vifte af målsætninger, der giver fleksibilitet i celletype, interventioner og udfaldsmålinger af interesse. Supplerende fodermedier med konditioneret serum tilføjer en fysiologisk kontekst, der ikke kan opnås i et traditionelt in vitro- miljø, hvilket forbedrer modelleringen af in vivo- fysiologi. Kort sagt mener vi, at dette er en bredt anvendelig tilstandL med spændende konsekvenser for at fremme både fysiologi og vævsteknologi.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet af et NSERC postdoktoralt stipendium (DWDW), et ARCS Foundation Scholarship (AL) og en UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |