Summary
نقدم نموذجا من أنسجة الرباط التي يتم التعامل مع البنى ثلاثية الأبعاد مع مصل الدم مكيفة ممارسة الإنسان وتحليلها لمحتوى الكولاجين، وظيفة، والكيمياء الحيوية الخلوية.
Abstract
التجارب في المختبر ضرورية لفهم الآليات البيولوجية. ومع ذلك، فإن الفجوة بين زراعة الأنسجة أحادية الطبقة وعلم وظائف الأعضاء البشرية كبيرة، وترجمة النتائج غالبا ما تكون سيئة. وبالتالي، هناك فرصة كبيرة لنهج تجريبية بديلة. هنا نقدم نهجا فيه الخلايا البشرية معزولة عن الإنسان الأمامي الصليبي الأنسجة الرباط المخلفات، توسعت في الثقافة، وتستخدم لتشكيل الأربطة هندستها. ممارسة يغير البيئة البيوكيميائية في الدم بحيث يتم تحسين وظيفة العديد من الأنسجة والأعضاء والعمليات الجسدية. في هذه التجربة، بناء الرباط استكملت وسائل الإعلام الثقافة مع المصل البشري التجريبية التي كانت "مشروطة" من خلال ممارسة الرياضة. وبالتالي فإن التدخل هو أكثر أهمية بيولوجيا منذ يتعرض الأنسجة التجريبية إلى البيوكيميائية الذاتية الذاتية كامل، بما في ذلك البروتينات ملزمة والمركبات التي يمكن أن تتغير جنبا إلى جنب مع نشاطوكيل غير معروف من الفائدة. بعد العلاج، والأربطة هندستها يمكن تحليلها لوظيفة ميكانيكية، ومحتوى الكولاجين، مورفولوجيا، والكيمياء الحيوية الخلوية. وعموما، هناك أربع مزايا رئيسية مقابل الثقافة أحادية الطبقة التقليدية والنماذج الحيوانية، من النموذج الفسيولوجي للأنسجة الرباط الذي يتم عرضه هنا. أولا، يبني الرباط ثلاثي الأبعاد، مما يسمح للخصائص الميكانيكية ( أي وظيفة) مثل الإجهاد الشد النهائي، تحميل الشد القصوى، ومعامل، ليكون كميا. ثانيا، يمكن فحص التداخل، واجهة بين بوني والعناصر سينو بالتفصيل وفي سياق وظيفي. ثالثا، إعداد وسائل الإعلام مع المصل بعد ممارسة يسمح للآثار الناجمة عن البيوكيميائية التي يسببها النشاط، والتي هي المسؤولة عن مجموعة واسعة من الفوائد الصحية من التمارين الرياضية، ليتم التحقيق فيها بطريقة غير منحازة. وأخيرا، فإن هذا النموذج التجريبي يعزز البحث العلمي بطريقة إنسانية وأخلاقية من خلال استبدال استخداموالولاية الأساسية للمعاهد الوطنية للصحة، ومركز مكافحة الأمراض، وإدارة الغذاء والدواء.
Introduction
إصابات الأوتار والرباط شائعة ويمكن أن يكون لها عواقب وخيمة على التنقل الطبيعي ونوعية الحياة. التدخل الجراحي غالبا ما يكون ضروريا ولكن يمكن أن يكون النجاح محدود ومتنوع 4 ، 5 . الفهم الحالي لكيفية تطور الأوتار والأربطة، وتنضج، والاستجابة للإصابة غير مكتملة، وبالتالي هناك حاجة إلى نماذج بحث فعالة لتوفير نظرة ثاقبة على تطوير العلاجات أكثر فعالية 5 . لمعالجة هذه الفجوة المعرفية، يمكن استخدام النماذج الحيوانية ولكن في الدراسات المجراة هي معقدة بطبيعتها مع صعوبة في السيطرة على البيئة واستهداف التدخلات مباشرة إلى الأنسجة المقصودة. في المقابل، يمكن بسهولة السيطرة على البيئة التجريبية ورصدها في المختبر مع ثقافة الخلية أحادي الطبقة التقليدية. ومع ذلك، فإن هذه التقنية قد تبالغ في تبسيط البيئة الكيميائية والميكانيكية، وبالتالي قد لا ريكابيتوفي وقت متأخر من السلوك في الجسم الحي من الخلايا. هندسة الأنسجة قادرة على الزواج من مزايا المجمع في بيئة الجسم الحي في النماذج الحيوانية مع السيطرة على البيئة في المختبر ويوفر أداة إضافية لدراسة علم وظائف الأعضاء. وبالإضافة إلى ذلك، المسلحة مع فهم أفضل للتنمية الرباط، قد هندسة الأنسجة أيضا توفير مصدر من الأنسجة الكسب غير المشروع عندما يتطلب إعادة الإعمار الجراحي 6 . وهكذا، فإن الطريقة الموصوفة هنا يصادق على الأنسجة في المختبر 3D المهندسة التي يمكن استخدامها لدراسة وظيفة الرباط والمورفولوجيا.
وقد تم استخدام وتر ترتكز على الفيبرين أو أرباب الرباط كنموذج في المختبر لدراسة العمليات الفسيولوجية بما في ذلك الكولاجين فيبريلوجينيسيس 7 وتطوير وتر 8 ، فضلا عن التطبيقات متعدية التي تم تقييمها فائدة مثل الأنسجة الكسب غير المشروع في نموذج الأغنام من كروي الأماميالأربطة سييت (أكل) إعادة الإعمار 9 . وقد أنشأت مختبرنا سابقا نموذج الرباط هندسيا 3D تمتد اثنين من براشيت، وهي مادة فوسفات الكالسيوم العظام بديلا، والمراسي الأسمنت. هذا النموذج يمكن أن تخضع لظروف تجريبية مختلفة بكل سهولة ببساطة عن طريق تكملة وسائل الإعلام والثقافة مع العوامل البيولوجية 10 أو تطبيق التحفيز الميكانيكي 11 . الأهم من ذلك، هذا النموذج العظام إلى العظام العظام يسمح للتحليل المتعمق للتخدير، واجهة بين بوني والعناصر سينو، التي هي عرضة للإصابة.
في الدراسة سلط الضوء على 1 هنا لتقديم هذه المنهجية، كنا مهتمين في تأثير التغيرات التي يسببها التمارين في الوسط البيوكيميائي على وظيفة الرباط. ممارسة يحسن الخلوية وظيفة الجهاز في مجموعة متنوعة من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم 2 ، 3 ، 12 ، وهو تأثير يمكن أن يعزى إلى الإفراج عن مختلف المعروفة (على سبيل المثال، إيل-6 13 ، إيل-15 14 ، ميتورين مثل 15 ، إكسوسوميس 16 ، 17 )، وغيرها من العوامل البيوكيميائية غير معروفة صدر في الدورة الدموية النظامية . وعلاوة على ذلك، يتم إثراء البيئة البيوكيميائية بعد ممارسة مع الهرمونات استجابة للتمرين، والإفراج عن هو الذي يحفز من قبل تحفيز الجهاز العصبي متعاطفة من الغدد الإفرازية (على سبيل المثال ، الكورتيزول والكاتيكولامينات من الغدة الكظرية 18 ، وهرمون النمو من الغدة النخامية الأمامية 19 ). ومع ذلك، ط ن فيفو ، فإنه من المستحيل التفريق بين آثار التحفيز الميكانيكي لممارسة التمارين الرياضية من التمارين الرياضية التي يسببها التغيرات البيوكيميائية. في حين اتسمت بعض الدراسات الارتفاع المتوقع لبعض الهرمونات والسيتوكينات المتداولة استجابة لممارسةe كما ذكر أعلاه، هناك عوامل كثيرة جدا، معروفة وغير معروفة، لتلخص بأمانة في المختبر. وهذا يعني أن عزل عدد قليل من العوامل لدراسة في المختبر يعالج بشكل غير كاف تعقيد الاستجابة البيوكيميائية. في هذه الدراسة، قمنا بالتحقيق في كيفية التغيرات في بيئة البيوكيميائية في الدم، التي دفعتها ممارسة، يؤثر على وظيفة الرباط هندسيا. لعزل آثار التغيرات البيوكيميائية، حصلنا على المصل من المشاركين في البشر قبل وبعد نوبة من ممارسة المقاومة واستخدامها علاج الأربطة هندسيا 3D شكلت باستخدام الإنسان الرباط الصليبي الأمامي (أكل) الخلايا الليفية. باستخدام هذا النموذج، يمكننا الحصول على بيانات وظيفية، بما في ذلك الآثار على الخواص الميكانيكية ومحتوى الكولاجين، فضلا عن تحديد الآثار على الإشارات الجزيئية.
Protocol
الإجراءات التالية تلتزم بالبروتوكول الذي تمت الموافقة عليه من قبل مجلس المراجعة المؤسسية من جامعة كاليفورنيا، ديفيس. والتشاور مع مجلس الأخلاقيات المحلية قبل البدء في البحث.
1. عزل الخلايا الليفية الأولية من بقايا أكل الإنسان
ملاحظة: الحفاظ على العقم وتنفيذ جميع الخطوات في مجلس الوزراء السلامة البيولوجية (بسك).
- الحصول على الموافقة من مجلس مراجعة الأخلاقيات المناسب لجمع واستخدام الأنسجة البشرية كما هو موضح أدناه.
- إعداد 5X المضادات الحيوية / أنتيميكوتيك (عبام) الحل عن طريق تمييع الحل المضاد الحيوي 100 / مضاد أنتيميكوتيك في 1X الفوسفات مخزنة المالحة (بس)
- جمع شظايا الأنسجة أكل في 5X حل أبام في أنبوب مخروطي 50 مل، وتخزينها في 4 درجات مئوية حتى خطوة الهضم. قطع الأنسجة إلى شظايا أصغر مع شفرة حلاقة إذا لزم الأمر إلى أقصى حجم 1 × 1 × 1 سم 3 .
تنبيه: الامتثال للوائح البيولوجية المحلية لوالاستخدام السليم للمواد البيولوجية وإزالة التلوث والتخلص من النفايات البيولوجية. - إعداد كمية كافية من حل كولاجيناز لغمر شظايا الأنسجة. حل كولاجيناز من النوع الثاني (1 ملغ / مل) في الجلوكوز الجلوكوز المعدل المعدل النسر دولبيكو (دمم) تحتوي على 1X البنسلين / الستربتومايسين، و 20٪ مصل بقري الجنين (فبس) وتصفية في 0.22 ميكرون.
- شطف أكل الأنسجة 3 مرات في برنامج تلفزيوني.
- هضم الأنسجة. نقل الأنسجة أكل إلى 50 مل أنبوب مخروطي جديد وإضافة كمية كافية من حل كولاجيناز لغمر الأنسجة. احتضان عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها (~ 17 ساعة).
- قبل اكتمال مدة الهضم، وإعداد وسائل الإعلام النمو (غم) عن طريق استكمال دمم وسائل الإعلام عالية الجلوكوز مع 10٪ فبس و 100 U / مل البنسلين.
- 15 دقيقة قبل اكتمال الوقت الهضم، ودوامة لفترة وجيزة الأنسجة التي تحتوي على 50 مل أنبوب 3 مرات كل 5 دقائق.
- باستخدام ماصة 25 مل المصلية، تريتورات الأنسجة هضمها بقوة لكسر تيسوسو أبعد من ذلك وازالة الخلايا.
- أجهزة الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 5 دقائق. نضح طاف و ريسوسبيند بيليه في 10 مل جنرال موتورز.
- كرر الخطوات 1،8-1،9 ثلاث مرات أخرى.
- بعد الطرد المركزي الماضي، ريسوسبيند بيليه في 5-10 مل جنرال موتورز. استخدام عينة صغيرة من تعليق الخلية لأداء عدد الخلايا مع عدادة الكريات وتقييم بقاء الخلية باستخدام تريبان الأزرق.
- لوحة تعليق الخلية على 15 سم لوحات زراعة الأنسجة بكثافة 3-4 × 10 5 خلايا لكل لوحة.
- الثقافة إلى التقاء 70٪ في حاضنة معقمة الحفاظ على 37 درجة مئوية و 5٪ كو 2 ، وتغيير جنرال موتورز كل ثلاثة أيام. استخدام أو تخزين (انظر أدناه) الخلايا في 5 مقاطع.
- تجميد الخلايا لاستخدامها في المستقبل.
- تريبسينيز الخلايا في التقاء 70٪ على النحو التالي. نضح وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني. إضافة ما قبل تحسنت ما قبل (37 درجة مئوية) 0.05٪ التربسين فقط لتغطية الجزء السفلي من لوحات زراعة الأنسجة. لوحات مكان في حضانة الثقافةأتور لمدة 5 دقائق ~ حتى يتم فصل الخلايا (تحقق الخلايا تطفو باستخدام المجهر الضوئي). استخدام ماصة لجمع الخلايا والاستغناء في أنبوب فالكون.
- أجهزة الطرد المركزي لخلايا بيليه، و ريسوسبيند الخلايا في دمم وسائل الإعلام الجلوكوز عالية تحتوي على 20٪ فبس و 10٪ سلفوكسيد ثنائي ميثيل (دمسو). تعليق خلية قسامة في كريوفيالس وباردة في -1 درجة مئوية / دقيقة لمدة 24 ساعة على الأقل. تخزين كريوفيالس المجمدة في النيتروجين السائل.
2. إعداد سيليكون المغلفة لوحات
- إعداد 35 ملم لوحات زراعة الأنسجة: إزالة الأغطية ووضع لوحات مفتوحة على سطح مستو.
- مزيج سيليكون المطاط الصناعي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة.
- استخدام حقنة 10 مل لاستغناء حوالي 2 مل لكل 35 ملم لوحة.
- السماح سيليكون لعلاج في درجة حرارة الغرفة لمدة 2-3 أيام.
3. إعداد مرساة اسمنت بروشيت
- مقدما، إعداد سيليكون عكس قوالب تحتوي أسطواني نحنلس لتثبيت المرساة. ويمكن إجراء قوالب عكسية لمواصفات الشكل والمرساة المطلوبين.
- تحديد الارتفاع المطلوب وقطر المرساة النهائية. يستخدم هذا البروتوكول قالب حسب الطلب شكلت من السيليكون الحرفية في طبق الثقافة الأنسجة 35 مم التي وضعت اسطوانات بلاستيكية من حوالي 3.25 ملم في القطر، مما يسمح لارتفاع العفن النهائي من حوالي 6.5 ملم. أبعاد مرساة النهائي حوالي 3-3.5 مم في الطول وحوالي 3.4 ملم في القطر مع 1.5 ملم دبوس جاحظ من الجزء السفلي من مرساة.
- إضافة السيليكون غير المؤكدة إلى طبق 35 ملم الذي سيتم جعل القالب. ضع الاسطوانات البلاستيكية وفقا لذلك.
ملاحظة: سيحدد حجم الاسطوانات البلاستيكية قطر المراسي النهائية. وضع اسطوانات البلاستيك وكمية من السيليكون المستخدمة يمكن تعديلها لإنتاج المراسي من ارتفاعات مختلفة. سمك بين الجزء السفلي من الآبار في القالب والجزء السفلي من القالب نفسه سوف دإترمين كم من دبوس يمكن أن تبرز من الجزء السفلي من مرساة السماح مثبت في وقت لاحق المرساة بشكل آمن في طبق المغلفة سيليكون. - بعد السماح السيليكون لعلاج، وإزالة الاسطوانات البلاستيكية وإزالة القالب من طبق 35 ملم.
- إعداد 3.5 M أورثوفوسفوريك / 100 ملي محلول حامض الستريك. حل 0.961 ز حامض الستريك في 11.5 مل حمض الفوسفوريك. جلب حجم الحل تصل إلى 50 مل مع ميليق المياه. تخزين الحل في درجة حرارة الغرفة وحماية من الضوء.
- إعداد قوالب: ضع دبوس واحد مينوتيان في وسط كل أسطواني جيدا في القوالب.
- الجمع بين β-تريكالشيوم الفوسفات و أورثوفوسفوريك / محلول حمض الستريك في تركيز 1 غرام / مل في البلاستيك وزن القارب على الجليد.
- خلط الاسمنت بقوة باستخدام مكشطة الخلايا البلاستيكية.
- تستنير الأسمنت لمواصلة الخلط ومزيج خليط في القالب
- الطرد المركزي العفن شغل لمدة 1 دقيقة في 2،250 x ز.
- تسمح المراسي الاسمنت براشيت لتعيين في درجة حرارة الغرفة بين عشية وضحاها.
- إزالة المراسي من القالب وتثبيت اثنين من المراسي 12 ملم وبصرف النظر في كل لوحة سيليكون المغلفة.
- تعقيم لوحات مثبتة عن طريق الرش مع الايثانول 70٪، وملء كل من لوحات والأغطية، ووضعها في بسك. بعد 30 دقيقة على الأقل، لوحات نضح واستبدال الأغطية، وتخزين في بسك حتى الحاجة.
4. الحصول على مصل الإنسان
- ضمان الحصول على موافقة مجلس مراجعة الأخلاق المناسب لهذا البروتوكول.
- ضمان الحصول على موافقة مستنيرة مكتوبة من الأشخاص البشر للمشاركة في تدخل معين (على سبيل المثال ، ممارسة، الغذاء أو المخدرات التدخل) من شأنها أن تؤثر التغييرات المرجوة في المصل. هنا، نحن تصف مجموعة في الراحة و 15 دقيقة بعد ممارسة المقاومة.
- باستخدام فليبوتوميست المدربين، والحصول على عينة الدم يستريح من أحد المشاركين عن طريق الوريد في حاوية إخلاء المناسبة. جمع عينة الدم بعد ممارسة 15 دقيقة بعد أن المشاركين في الانخراط في بروتوكول ممارسة المطلوب. كما هو موضح سابقا 1 ، استخدم بروتوكول ممارسة المقاومة في هذه التجربة لتحفيز استجابة الكيمياء الحيوية الذاتية.
- يكون المشاركين أداء خمس مجموعات من الصحافة الساق مع بقية دقيقة واحدة بين مجموعات. بعد ذلك، يكون المشاركين أداء مجموعة من تمديدات الركبة ومجموعة من تجعيد الشعر في اوتار الركبة على التوالي مع عدم وجود راحة ثم كرر التدريبات من الخلف إلى الخلف ثلاث مرات مع راحة 1 دقيقة بين مجموعات.
- السماح للدم لتجلط قبل الطرد المركزي في 1500 x ج لمدة 10 دقيقة. تحت ظروف معقمة، نقل المصل إلى أنابيب معقمة لمكملات وسائل الإعلام في المستقبل (المصل المخزنة في 4 درجات مئوية) والتحليل البيوكيميائية (قسامة صغيرة من المصل المخزنة في -20 درجة مئوية).
5. شكل الأربطة المهندسة
ملاحظة: مقدما، توسيع الابتدائي فيبروبلاستس وإعداد لوحات سيليكون المغلفة مع مرساة بروشيت مثبتة.
- إعداد الكواشف:
- إعداد الثرومبين. حل الثرومبين البقري في 200 U / مل في دمم وسائل الإعلام عالية الجلوكوز. تصفية في 0.22 ميكرون، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد الفيبرينوجين. حل الفيبرينوجين البقري في 20 ملغ / مل في دمم وسائل الإعلام عالية الجلوكوز. احتضان لمدة 3-4 ساعة في حمام مائي 37 درجة مئوية، ودوامة كل 30 دقيقة للمساعدة في حل. تصفية في 0.22 ميكرون (قد تكون هناك حاجة إلى مرشحات متعددة)، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد أبروتينين. حل أبروتينين في 10 ملغ / مل في الماء. تصفية في 0.22 ميكرون، قسامة، وتخزينها في -20 درجة مئوية.
- إعداد حمض أمينوهيكسانويك. حل حمض أمينوهيكسانويك في 0.1g / مل في الماء. تصفية في 0.22 ميكرون، قسامة، وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد حمض الاسكوربيك. حل حامض الاسكوربيك في دمم عالية الجلوكوز وسائل الإعلام في تركيز 50 ملي. تصفية في 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية. <لي> إعداد L-برولين. حل L- برولين في برنامج تلفزيوني بتركيز 50 ملم. تصفية في 0.22 ميكرون وتخزينها في 4 درجات مئوية.
- إعداد عامل نمو التحول β1 (تغف-β1). إعادة تغف-β1 وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة في تركيز 10 ميكروغرام / مل. قسامة وتخزينها في -20 درجة مئوية.
ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية تحت ظروف معقمة في بسك.
6. اختبار الشد الأربطة المهندسة
ملاحظة: تم إجراء اختبار الشد باستخدام اختبار الشد بنيت خصيصا في حمام بس. والقضبان عكس مصبوب التي يقترن إلى محول قوة عقد مرساة الاسمنت براشيت في المكان أثناء الاختبار.
- تحديد طول وعرض يبني الرباط باستخدام الفرجار الرقمية. حساب منطقة مستعرضة من الأنسجة.
- إزالة تثبيت الرباط من لوحة ووضع المراسي فيعكس السيطرة مصبوب، وضمان غمرت في بناء في برنامج تلفزيوني.
- ضبط المسافة بين السيطرة، وتحديد طول البناء إلى طوله الأولي.
- بدء الاختبار: سلالة بناء على الفشل في معدل سلالة من 0.4 ملم / ثانية (أو ~ 3٪ / ثانية).
- بعد الانتهاء من الاختبار، معالجة بقايا الأنسجة لمحتوى الكولاجين (انظر القسم 7).
- من البيانات الناتجة تشوه الحمل، وحساب البيانات الإجهاد والسلالة وتحديد الخصائص الميكانيكية من الفائدة؛ على سبيل المثال، تحميل الشد الأقصى، قوة الشد النهائي ومعامل ( أي ، مرونة الملكية على منطقة خطية من منحنى الإجهاد والانفعال).
7. الكمي محتوى الكولاجين من الأربطة المهندسة
- إزالة الأربطة هندسيا من المراسي الأسمنت بروشيت وجافة عند 120 درجة مئوية لمدة 25 دقيقة.
- تحديد كتلة الجافة من يبني ووضعها في أنابيب 1.5 مل الفردية. يمكن تخزين البنى الجافة في درجة حرارة الغرفةحتى مزيد من المعالجة.
- لكل بناء، إضافة 200 ميكرولتر 6 M حمض الهيدروكلوريك. يغلي عند 120 درجة مئوية في كتلة التدفئة لمدة 2 ساعة في غطاء الدخان.
تنبيه: حمض الهيدروكلوريك هو تآكل وحمضية للغاية، واستخدام أنابيب يغلي واقية / آمنة قفل أو طريقة أخرى من أنابيب تأمين ينصح. - الطرد المركزي أنابيب لفترة وجيزة لجمع السائل، وتركها غير مختلطة لتتبخر عند 120 درجة مئوية في كتلة التدفئة لمدة 1.5 ساعة في غطاء الدخان.
- ريسوسبيند بيليه الناتجة في 200 ميكرولتر العازلة هيدروكسي. تخزين في -20 درجة مئوية حتى الحاجة.
- إعداد العازلة هيدروكسي برولين. في 300 مل من الماء، إضافة 16.6 غرام حامض الستريك، 4 مل حمض الخليك، 11.4 ز هيدروكسيد الصوديوم ويقلب حتى يذوب. ودرجة الحموضة إلى 6-6.5 وتحقيق حجم يصل إلى 500 مل. إضافة 250 ميكرولتر التولوين كمادة حافظة وتخزينها في 4 درجات مئوية محمية من الضوء.
- إعداد الكواشف.
- إعداد ترانس-4-هيدروكسي-L- برولين. حل في الماء لجعل محلول 4 ملغ / مل. <لي> إعداد الكلورامين- T. حل في الماء لجعل حل 14.1 ملغ / مل.
- إعداد ألدهيد-بيركلورات. حل 1.5 غرام 4-ديميثيلامينوبنزالدهيد في 6 مل 1-بروبانول، 2.6 مل حمض البيركلوريك (تنبيه: أكالة، مؤكسد قوي، واستخدام الاحتياطات المناسبة)، و 0.5 مل من الماء.
ملاحظة: التخفيفات قد تتراوح من 1: 4 إلى 1:50 من العينة: العازلة اعتمادا على محتوى الكولاجين المتوقع للعينة. وبالتالي قد تكون هناك حاجة إلى بعض اختبار التجربة والخطأ لتحديد عامل التخفيف المناسب لمجموعة عينة معينة (أي وضع العينات نحو منتصف منحنى القياسية).
- تحويل قيمة الامتصاصية لكل عينة إلى ميكروغرام من هيدروكسي برولين باستخدام منحنى القياسية هيدروكسيبرولين.
- مضاعفة كل بئر بنسبة 2.5 لحساب كمية هيدروكسي برولين فيالعينة المخففة. أذكر أن 200 فقط من 500 ميكرولتر مجموع الخليط (200 ميكرولتر عينة المخففة + 150 ميكرولتر كلورامين T +150 ميكرولتر أب الحل) يضاف إلى كل عينة بشكل جيد.
- مضاعفة بواسطة عامل التخفيف (القسم 7.7) لحساب كمية هيدروكسي برولين في العينة الأصلية.
- تقسيم بنسبة 0.137 لحساب كمية الكولاجين (يفترض أن الكولاجين يحتوي على هيدروكسي برولين 20.7٪ 20 ).
ملاحظة: وفرة الثدييات هيدروكسي برولين في الكولاجين يختلف قليلا عبر الأنسجة وأنواع الثدييات. على سبيل المثال، الخنازير والأغنام وتر أخيل تحتوي على 13.5 و 13.7٪ (كتلة هيدروكسي / كتلة الأنسجة الجافة)، على التوالي 21 . هنا، استخدم 13.7٪ لتقدير نسبة هيدروكسي برولين في الكولاجين، والذي يستخدم لحساب محتوى الكولاجين من عينة الأنسجة باستخدام المعادلة التالية:
- تقسيم بواسطة كتلة الجافة لحساب الكولاجين فراوتتحول إلى نسبة مئوية.
8. الكمي لنقاط الجزيئية
ملاحظة: بالإضافة إلى النتائج الأولية للاختبار الشد ومحتوى الكولاجين، ويمكن قياس نقاط النهاية الجزيئية على 2D أو 3D الأنسجة لإضافة البصيرة الميكانيكية. ويمكن استخدام المقايسات الحيوية لتحديد نقاط النهاية الجزيئية (انظر القسم التالي أدناه للسياق تأثير وسط المصل بعد التمرين على وظيفة الرباط في المختبر ).
- للنسيج 3D:
- إعداد يبني وفقا للخطوة 5 أعلاه.
- بعد بناء العلاج / التدخل، المفاجئة تجميد يبني في النيتروجين السائل.
- باستخدام هاون ومدقة تبريد على الجليد الجاف، طحن يبني في مسحوق. تابع في الخطوة 8.4 / 5).
- للنسيج 2D:
- ثقافة الخلايا الليفية أكل الإنسان إلى التقاء في واحدأولاير في ستة لوحات جيدا تحتوي على دمم.
- نضح دمم وتطبيق وسائل الإعلام العلاج وفقا لاستراتيجية التجريب الخاص بك (على سبيل المثال ، بالطبع بالطبع أو التجارب استجابة الجرعة).
- نضح وسائل الإعلام وغسل الخلايا مع برنامج تلفزيوني.
- كشط الخلايا لجمع باستخدام العازلة استخراج المناسبة / كاشف (انظر التالي).
- البروتين تحليل التعبير: استخدام المخزن المؤقت استخراج عصاري خلوي (على سبيل المثال ، 250 ملي سكروز، 50 ملي تريس درجة الحموضة 7.4، 5 ملي MgCl2، والبروتياز / كوكتيل فوسفاتيز المانع) للحصول على البروتين لستيس. أداء تركيز البروتين فحص واستمرار تحليل وفقا للإجراءات القياسية لطخة غربية.
- تحليل التعبير الجيني: عزل الحمض النووي الريبي مجموع باستخدام 500 ميكرولتر رنا كاشف العزلة وفقا لتعليمات الشركة الصانعة للحصول على الحمض النووي الريبي ذات جودة عالية. إجراء عكس النسخ في الوقت الحقيقي تحليل الكمي ير وفقا للإجراءات القياسية.
- عزل الحمض النووي: عزل وكمية زالحمض النووي باستخدام كاشف عزل الحمض النووي وفقا لتعليمات الشركة الصانعة. تحديد تركيز الحمض النووي باستخدام مقياس الطيف لقياس امتصاص العينة في 260 نانومتر.
Representative Results
لمحة عامة عن تشكيل الرباط المهندسة والتدخل التجريبي
ويبين الشكل 1 لمحة عامة عن تشكيل الأربطة هندسيا. الاسمنت بروشيت، يتم إعداد مادة بديلة العظام 22 من خلال الجمع بين حمض حمض الفوسفوريك حمض الفوسفوريك / حمض الستريك مع فوسفات β-تريكالسيوم في الآبار أسطوانية. بدلا من ذلك، إذا لم يكن قياس مباشرة وظيفة الميكانيكية للأنسجة، 3-0 خيوط الحرير يمكن أن تستخدم المراسي في تشكيل الأنسجة. هذه هي مثبتة 12 ملم بعيدا في أطباق سيليكون المغلفة 35 ملم وتعقيمها عن طريق تمرغ في الايثانول 70٪. يتم عزل الخلايا الليفية من بقايا الرباط الصليبي الأمامي التي تم الحصول عليها خلال جراحة إعادة البناء أكل. بعد التوسع، يتم تغليف 2.5 × 10 5 خلايا في هلام الليفين شكلت في براشيت الاسمنت مرساة الطبق. بعد تشكيل، الرباط كونستريمكن فحص أوكتس للتغيرات في الخواص الميكانيكية، محتوى الكولاجين، تكاثر الخلايا، التعبير الجيني، مستويات البروتين، مورفولوجيا الأنسجة.
في جميع أنحاء الثقافة، والخلايا عقد هلام الليفين وتشكيل الأنسجة الخطية بين المراسي اثنين ( الشكل 2A ). بعد 1-2 أيام في الثقافة، تعلق الخلايا على هلام الليفين، عمليات الخلايا الموسعة، وبدأت في ممارسة قوات الجر ( الشكل 2B ). كما يتم التعاقد مع هلام الفبرين من قبل قوى الجر وتفكيكها من قبل الانزيمات الخلوية، يتم إنشاء التوتر بين نقطتي مرساة وخلايانا محاذاة موازية لهذا المحور ( الشكل 2B ) والبدء في إيداع الكولاجين. بعد 4-5 أيام، وقد تعاقدت البنيات حول المراسي تشكيل الأنسجة أسطوانية الخطية ( الشكل 2A ، وعند هذه النقطة يمكن تطبيق المحفزات الخارجية للنظام (إنتيرفإنتيون في هذا الوقت يتجنب تعطيل عملية تشكيل الأنسجة الخطية). ويمكن أن تتكون التدخلات من تكملة وسائل الإعلام الثقافية مع مصل الإنسان أو الحيوان بعد تدخل معين، والسيتوكينات الخارجية وعوامل النمو، وتوظيف التحفيز الميكانيكي، أو تغيير العوامل البيئية الأخرى مثل توتر الأوكسجين. باستخدام وسائل الإعلام النمو (دمم مع 10٪ فبس و 100 U / مل البنسلين) تستكمل مع 200 ميكرومتر حمض الاسكوربيك، 50 ميكرومتر L- البرولين، و 5 نانوغرام / مل تغف-β1، قررنا أن تكاثر الخلايا يستمر طوال ثقافة 2 أسبوع ( الشكل 2C ) وبالفعل، المجهر الضوئي يكشف عن الأنسجة الكثيفة التي تحتوي على خلايا الانحياز للغاية في 14 يوما من الثقافة ( الشكل 2B ).
تقييم الأربطة المهندسة
في نهاية فترة الثقافة، ويمكن تقييم الأربطة هندسية في مجموعة متنوعةy من الطرق. وهناك ميزة رئيسية لهذا النظام هو القدرة على تحديد التغييرات الوظيفية على الأنسجة عن طريق الاختبار الميكانيكي، وهو تقييم حيوي نظرا للدور الميكانيكي للرباط الأصلي. اختبار الشد أحادي المحور يمكن أن تستخدم لقياس الخواص الميكانيكية بما في ذلك الحمل إلى الفشل، قوة الشد في نهاية المطاف، ومعامل يونغ. ويمكن أيضا قياس الخصائص اللزجة مع الاسترخاء الإجهاد واختبارات الزحف. الشكل 3A يصور الرباط هندسيا عقد في القبضات مصبوب العكسي في اختبار الشد أحادية المحور بنيت خصيصا. يتم إرفاق قبضة الحق إلى محول قوة لقياس الحمل في جميع أنحاء الرباط كما يتم توتر الأنسجة إلى الفشل. ويبين الشكل 3B مؤامرة التوتر الإجهاد ممثل للاختبار إلى الفشل. بعد إجراء الاختبار الميكانيكي، ويمكن تجفيف نفس البنيات ومعالجتها لفحص هيدروكسي برولين 23 لتقييم إجمالي محتوى الكولاجين وكذلك بيوش أخرىميكال المقايسات. مع وجود عدد كاف من العينات الإضافية لكل حالة، يمكن إجراء فحص شامل للتدخل التجريبي، بما في ذلك آثاره على تكاثر الخلايا، والتعبير الجيني والبروتيني، والتشكل النسيجي. في حين أن 14 يوما هو نقطة نهاية نموذجية لدراساتنا، والأربطة هندسيا تستمر في تحسين في الخواص الميكانيكية ومحتوى الكولاجين من خلال 28 يوما من الثقافة كما هو مبين في الشكل 3C ويمكن البقاء على قيد الحياة لمدة 3 أشهر على الأقل في الثقافة 24 .
تقلب المانحين هو اعتبار مهم للتكرار التجريبي. ويبين الشكل 4 تجربة تمثيلية أبلغ عنها لي وآخرون. 25 مقارنة 7 متبرعين أكل مختلفة (ن = 3 ذكور و ن = 4 أنثى) مما يدل على خصائص الشد نموذجية ومحتوى الكولاجين بعد ثقافة لمدة أسبوعين في وصفها سابقا تكمل وسائل الإعلام النمو. باستخدام الخلايا من مجموعات أكل مماثلة، سن المانحين، والوقت بعد الإصابة، والجنس، وما إلى ذلك، والأربطة هندسيا تظهر تباين منخفض بين المانحين وخصائص مماثلة بين المانحين الذكور والإناث باستثناء الفرق في جزء الكولاجين. في الدراسة المذكورة أعلاه، تم استخدام الأربطة المهندسة كنموذج في المختبر للتحقيق لماذا المرأة لديها خطر أكبر بكثير من إصابة أكل من الرجال، وأظهرت أن الخلايا الليفية أكل معزولة من المتبرعين الإناث لا تشكل بطبيعتها الأضعف وأقل الأربطة هندسية الكولاجين 25 .
تأثير بيئة ما بعد ممارسة المصل على وظيفة الرباط في المختبر
لقد أثبتنا سابقا قدرة الأربطة هندسيا لاستخدامها في التحقيق في العمليات الفسيولوجية 1 ،سس = "كريف"> 25. في التجربة التمثيلية التالية كما ذكرت من قبل الغرب وآخرون. 1 ، حددنا الآثار البيوكيميائية من ممارسة على الرباط وظيفة وتسليط الضوء على المنهجية والنتائج هنا. شكلنا الأربطة هندسيا باستخدام خلايا أكل الإنسان وتطبيق تدخل، في يوم 7 من الثقافة، وتتكون من وسائل الإعلام ثقافة مكيفة مع مصل الإنسان التي تم جمعها قبل أو بعد ممارسة الرياضة. باختصار، قمنا بتجنيد المشاركين الشباب الأصحاء الذكور وجمع عينات الدم قبل وبعد نوبة حادة من ممارسة المقاومة التي تزيد من تعميم الهرمونات والسيتوكينات بما في ذلك هرمون النمو البشري (غ). تم عزل مصل الدم البشري من عينات الدم قبل وبعد التمرين واستخدامها بدلا من مصل بقري الجنين في وسائل الإعلام والثقافة للأسبوع الثاني من ثقافة الرباط المهندسة ( الشكل 5A ). تم تحليل عينات مصل الدم قبل وبعد التمرين باستخدام إليسا من أجل التغيرات في عامل النمو الشبيه بالأنزيمولين الغازي والانسولين 1 (إيغف-1)، وتركيز والتي يمكن تغييرها من خلال ممارسة ( الشكل 5B ). تم استخدام هذه المعلومات لربط آثار المصل على الأربطة هندسيا مع التغيرات في المصل ردا على ممارسة الرياضة. بعد فترة الثقافة 14 يوم، تم تقييم يبني الرباط باستخدام الاختبار الميكانيكي وتحديد هيدروكسي برولين من محتوى الكولاجين وأظهرت زيادة كبيرة في كل من الحمل الشد القصوى ومحتوى الكولاجين ردا على مصل ما بعد التمرين. في محاولة لتقييم ما إذا كان هذا التأثير يتعلق بالإطلاقات التي يسببها النشاط من غ أو إيغف-1، تم تشكيل الأربطة هندسية في تجربة منفصلة وتعامل مع استجابة جرعة من غ الإنسان المؤتلف أو إيغف-1. ومن المثير للاهتمام، في حين أن زيادة غ المصل في الدم ( الشكل 5B -i)، وزيادة تدريجيا تركيز المؤتلف هرمون النمو في وسائل الإعلام والثقافة لم يزيد محتوى الكولاجين ( الشكل 5D -i) أو الميكانيكيةخصائص (لا تظهر البيانات) في الأربطة هندسيا. في المقابل، لم مستويات إيغف-1 المصل لم تزيد بعد ممارسة الرياضة، ولكن كشفت تجربة الجرعة والاستجابة أن مستويات متزايدة في وسائل الإعلام والثقافة تحسين محتوى الكولاجين من يبني الرباط ( الشكل 4D -ii). وهكذا، في حين أن ممارسة الرياضة يؤدي إلى زيادات قوية في غ بعد ممارسة، وتجربة الجرعة والاستجابة باستخدام رغ يثير شك حول ما إذا كان غ مسؤولة مباشرة عن تعزيز المظهري للأربطة هندستها (على الأقل، فإن إسوفورم 22 كيلو دالتون وحدها لا يبدو أنها مسؤولة). على العكس من ذلك، في حين لم يتم تغيير المصل إيغف-1 في 15 دقيقة بعد التمرين، واختبار ريجف-1 على مجموعة واسعة من تركيزات كشفت أن إيغف-1 قادر على تحسين محتوى الكولاجين. ومع ذلك، تجدر الإشارة إلى أن زيادة ركف-1 تركيزات من خلال مجموعة أن مستويات الفسيولوجية المقدرة لم تزيد بشكل كبير من محتوى الكولاجين. وهكذا، فريدة من نوعها بعد ممارسة المصل الداخليةكان نمت مهمة لتحسين الميكانيكا والكولاجين من الأربطة هندسيا.
في الدراسة التي سلط الضوء عليها هنا 1 ، كان حجم المصل التجريبي محدودا بسبب الاعتبارات الأخلاقية؛ لذلك، تم استخدام الاختبارات البيولوجية ثنائية المدى على المدى القصير، والتي كانت أقل مطالب المصل، لمواصلة التحقيق في الآليات الجزيئية المسؤولة عن زيادة الكولاجين التي لوحظت. تم تربيتها الخلايا الليفية أكل إلى التقاء في لوحات 6 جيدا وعالج لمدة 1 ساعة مع بقية أو بعد ممارسة المصل، ومقارنة مع ردود جرعة من المؤتلف غ، إيغف-1، تغف-β1 وتفعيل الأهداف في PI3K / mTORC1 ، ERK1 / 2، ومسارات إشارات سماد. في وجود مصل بعد ممارسة الرياضة، وأظهر مسار PI3K / mTORC1 و ERK1 / 2 المزيد من التنشيط كما تقييمها من قبل الفسفرة من S6K ( الشكل 5D -I) و ERK1 / 2 ( الشكل 5D -ii)، على التوالي.مقارنة مع هرمون والاستجابات جرعة السيتوكين، في حين كان غ تأثير إيجابي صغير على إشارة متور ( الشكل 5D -I) و إيغف-1 أظهرت تأثير إيجابي في أقل جرعة، والعلاجات الثلاث من غ، إيغف-1، و تغف - β1 لا تمثل الزيادة في إشارات PI3K / mTORC1 و ERK1 / 2. جنبا إلى جنب، لدينا نموذج 3D هندسيا الرباط و 2D البيانات الحيوية تشير إلى أن بيئة المصل بعد ممارسة قادرة على تحسين وظيفة الرباط المهندسة ومحتوى الكولاجين من خلال تفعيل مسارات PI3K / mTORC1 و ERK1 / 2.
باختصار، باستخدام نموذج الرباط هندسيا جنبا إلى جنب مع مصل مكيفة مكيفة الهواء، وكنا قادرين على ط) التحقيق في تأثير بيئة المصل بعد ممارسة على وظيفة الرباط المهندسة والكولاجين، ب) ربط التغيرات في النمط الظاهري الرباط مع تغيير تركيز هرمون المصل، وذلك بهدف تحديد التغيرات التي طرأت على المصل أدت إلى التغييرفي الأربطة المهندسة، و 3) زيادة نطاق العمل باستخدام المقايسات البيولوجية 2D للتحقيق في الأهداف الجزيئية للمحيط البيوكيميائية المصل لتحديد الآليات الجزيئية التي يتم تنشيطها من قبل مصل الدم بعد ممارسة التي تؤدي إلى تحسينات في وظيفة الرباط.
الشكل 1: نظرة عامة على تشكيل واستخدام الأربطة هندسيا. يتم تصنيع مرساة الاسمنت بروشيت ومعلقة في لوحات المغلفة سيليكون. يتم عزل الخلايا الليفية الأولية وتوسيعها من بقايا أكل. يتم تشكيل الأربطة هندسيا من قبل الخلايا الليفية تغليف في هلام الليفين حول اثنين من مرساة الاسمنت براشيت. يتم استزراع الأربطة المهندسة ومعالجتها بأيهما محددة كيميائية أو ميكانيكية (على سبيل المثال ، عن طريق مفاعل حيوي) المحفزات المطلوبة. عند نقطة النهاية المرغوبة، يمكن جمع الأربطة الهندسية وتقييمها للميكانيكاخصائص ل، التعبير الجيني، محتوى الكولاجين، التعبير البروتين، والأنسجة. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. الخلايا الليفية الرباط الأساسي تشكل الرباط القائم على الليفين العظام العظام التي تمتد على اثنين من المراسي الأسمنت براشيت. ( A ) مع مرور الوقت، والألياف الليفية عقد هلام الليفين حول مرساة الاسمنت بروشيت تشكيل الأنسجة الخطية. ( B ) في الأيام الثلاثة الأولى، تعلق الخلايا على هلام الليفين وممارسة قوى الجر، محاذاة الخلايا مع محور طويل من البناء. أكثر من 14 يوما، تشكل الخلايا الأنسجة محاذاة للغاية. شريط مقياس = 160 ميكرون. ( C ) محتوى الحمض النووي من الأربطة هندسيا يستمر في الزيادة سفي 14 يوما في الثقافة كما تتكاثر الخلايا. يتم عرض البيانات كما يعني ± سد مع ن = 3-4 يبني لكل مجموعة. المجموعات. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: المهندسة الرباط الخصائص الميكانيكية ومحتوى الكولاجين تتحسن مع مرور الوقت. ( A ) يبني الرباط هي الشد أحادي المحور اختبار لتحديد تأثير تدخل معين على وظيفة الرباط. كما هو مبين، اثنين من عكس مصبوب، القبضات 3D المطبوعة عقد المراسي شكل بالمثل التي يتم سدها من قبل هندو سينو. يقترن المراسي لمحرك السائر وقوة محول لتوليد منحنيات الإجهاد / سلالة من الأنسجة اختبارها، مما يسمح للخصائص الميكانيكية يمكن تحديدها. ( B </ سترونغ>) ممثل منحنى الإجهاد من سلالة من الرباط هندسيا توترت إلى الفشل. على مدى 28 يوما، ( C ) في نهاية المطاف قوة الشد (أوتس)، ( D ) تحميل الشد القصوى (متل)، ( E ) معامل يونغ، و ( F ) جزء الكولاجين تستمر في التحسن. يتم عرض البيانات كما يعني ± سد مع ن = 5 يبني لكل مجموعة. * يشير إلى اختلاف كبير بين جميع المجموعات الأخرى. الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: الأربطة المهندسة يمكن تقييمها من أجل الوظيفة والمحتوى البيوكيميائي، وعرض تباين المانحين منخفضة. شكلت الأربطة المهندسة 7 مانحين مختلفين (ن = 3 ذكور، ن = 4 أنثى). بعد 2 أسابيع o( A ) الحد الأقصى لحمل الشد، ( B ) قوة الشد النهائية (أوتس)، ( C ) معامل يونغ، ( D ) منطقة مستعرضة (سسا)، ( E ) محتوى الكولاجين الكلي لكل وبناء، و ( F ) الكولاجين ككسر من الكتلة الجافة. يتم عرض البيانات على النحو يعني ± سد والأهمية الإحصائية كان مع اختبار t للطلاب. * يشير إلى اختلاف كبير بين المجموعات الأخرى (p <0.05). الشكل مقتبس من لي وآخرون. 25 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 5. الأربطة المهندسة تظهر التغييرات الميكانيكية والبيوكيميائية ردا على بيولوالتدخلات الجنيسة. ( A ) تم عزل مصل الدم من سحب الدم التي تم جمعها من المواضيع قبل (ريستتكس) وبعد ممارسة (إكستكس) وتستخدم لعلاج الأربطة هندسيا خلال الأسبوع الثاني من الثقافة. ( ب ) '1' هرمون النمو البشري (غ) و (ب) مستويات نمو مثل الأنسولين (إيغف) -1 في بقية وممارسة التمارين الرياضية تم قياسها من خلال إليسا. ( C ) أظهرت الأربطة المهندسة تعامل مع إكسست تحسين (ط) محتوى الكولاجين و (إي) تحميل الشد القصوى. تم تحليل الدلالة الإحصائية للمقارنات المقترنة (ريستكس و إكستكس) بواسطة اختبار t مع مستوى دلالة عند p <0.05. ( D ) تم استخدام جرعة استجابة من (1) غ و (إي) إيغف-1 لتحديد المساهمات الممكنة من هذه العوامل للتغيرات في محتوى الكولاجين بسبب إكسست. ه) استخدمت المقايسات الحيوية 2D لمقارنة تأثيرات الجرعات المتزايدة من غ، ريستكس، و إكستكس على أهداف الإشارات الجزيئية مثل الفسفرة من (ط) S6K THr389 و (2) ERK1 / 2 Thr202 / Tyr204 . وأجريت المقارنة الإحصائية لأكثر من مجموعتين تجريبية باستخدام أنوفا و هسد توكي. وتعرض البيانات على النحو المعطى كمتوسط ± سد. * يشير إلى وجود فرق كبير عن السيطرة (p <0.05) و § يشير إلى فرق كبير من 150 نانوغرام / مل و 300 نانوغرام / مل إيغف-1. الشكل تكييفها من الغرب وآخرون. 1 الرجاء انقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
Discussion
تصف المخطوطة الحالية نموذجا من نسيج الرباط الذي هو منصة تجريبية مفيدة للمحققين مع مجموعة واسعة من المواضيع البحثية، من تطوير الأنسجة إلى متعدية / الأسئلة السريرية. ويستند نموذج الرباط هندسيا وصفها هنا على بروتوكول تنوعا التي يمكن تكييفها في نقاط مختلفة في جميع أنحاء سير العمل ( الشكل 1 وقسم المناقشة ). وعلاوة على ذلك، الطبيعة التقصيرية بطبيعتها للبيئة في المختبر يمكن أن تقترب من المجال الفسيولوجي عن طريق استكمال وسائل الإعلام تغذية مع مصل بشر الإنسان أو الحيوان مكيفة.
يمكن تشكيلها باستخدام الخلايا الليفية من مجموعة متنوعة من المصادر
في حين أن المنهجية والنتائج التمثيلية المعروضة هنا تستند إلى استخدام الخلايا الليفية أكل الأولية، ويمكن تعديل بروتوكول عزل الخلية لجمع أنواع أخرى من الخلايا الليفية الأولية. كما وصفتفي الشكل 4 ، والأربطة هندسية شكلت مع الخلايا الأولية معزولة من المانحين الإنسان الشباب تظهر انخفاض تباين المانحين. الخلايا الأولية محدودة بسبب العزل الأولي وتقييد مرور. واستخدام خطوط الخلايا قد يحسن استنساخ التجارب. استخدام أنواع الخلايا الأخرى قد تتطلب تعديلات في وسائل الإعلام ثقافة الخلية وصياغة هلام الليفين. على سبيل المثال، لاحظنا أن الخلايا الجذعية الوسيطة الإنسان (مسس) ليست قادرة على تشكيل الأنسجة الخطية بين المراسي الأسمنت بروشيت على مدى 2 أسابيع في حين الخيول متفوقة الخلايا الليفية الرقمية المرن وتر، خلايا الفخذ نخاع العظم الفصلي، فرخ الخلايا الليفية الأوتار الجنينية ، والفئران C3H10T1 / 2 مسس بسرعة العقد وهضم هلام الليفين لتشكيل الأنسجة الخطية (ملاحظات غير منشورة). هذا التباين قد يكون نتيجة الاختلافات في انقباض الخلية، وانتشار، وإنتاج انزيم الفيبرين.
تطبيق الكيميائيةوالتحفيز الميكانيكي
في الطريقة الموصوفة هنا، الأنسجة القائمة على الفيبرين أشكال حول مرساة الاسمنت براشيت، مما يسمح لتطبيق التحفيز الميكانيكي عن طريق المفاعل الحيوي تمتد 11 ، وكذلك لاختبار الشد نقطة النهاية. وجود بروشيت الأسمنت لينة واجهة الأنسجة (التخدير) كما يقدم فرصة لمزيد من التحقيق والتحسين 22 ، 26 (انظر قسم التطبيقات السريرية أدناه). في هذه البيئة في المختبر ، مساهمة العوامل الكيميائية والميكانيكية يمكن تحديدها بسهولة أكبر؛ مثال على ذلك هو مبين في الشكل 5 ، حيث تم فصل تأثير بيئة ما بعد ممارسة المصل من المحفزات الميكانيكية من التمارين الرياضية. قد تكون هناك حاجة إلى دراسات رائدة لتحديد الإطار الزمني للتدخلات التجريبية، وتكوين العلاجات، ونقاط النهاية المناسبة للتوقع حدوث تغيير ملحوظ. فوعلى سبيل المثال، في دراسة ما بعد التمرين في مصل الدم 1 ، كان طول العلاج التجريبي مقيدا بتوريد المصل المستخدم لتكملة الوسائط، التي تم تغذية البنايات كل يوم ثان. وعلاوة على ذلك، خلال الأسبوع الثاني من الثقافة، واستكملت وسائل الإعلام الثقافة مع بقية أو مصل بعد ممارسة مع حمض الاسكوربيك و L- البرولين حافظت بينما تم إزالة تغف-β1. تغف-β1 هو عامل نمو الموالية للتليف المعروف الذي يزيد في المصل بعد ممارسة 27 . لذلك، لتجنب تحجب آثار تغف-β1 ذات الصلة من مصل ما بعد ممارسة، لم يتم الحفاظ على هذا السيتوكين في وسائل الإعلام والثقافة.
هذا النموذج هندسيا الرباط يمكن أيضا أن تستخدم لاختبار تأثير تمتد الميكانيكية. عن طريق الهندسة عكسها السيطرة على غرار لعقد نهايات مرساة الاسمنت بروشيت (على غرار اختبار الشد أحادي المحور هو مبين في الشكل 1 )، ويمكن تصميم المفاعلات الحيوية تمتد لاستيعاب المهندس الأربطة. وقد استخدم مختبرنا سابقا هذا النموذج للتحقيق في استجابة الإشارات الجزيئية للأربطة هندسية إلى الشد أحادية المحور تمتد في المفاعل الحيوي 11 حسب الطلب التي من شأنها أن توفر فهم أفضل للتصميم العقلاني للنموذج تمتد في المختبر أو حتى، من المحتمل، في الجسم الحي تمتد / النشاط / التطبيقات العلاجية.
تقييم الأربطة المهندسة
كما هو الحال مع الثقافة أحادي الطبقة التقليدية، يمكن أن يبنى 3D يبني لتعبير الجينات / البروتين. بالإضافة إلى ذلك، توفر التشكل 3D أيضا فرصة لتقييم التغيرات الوظيفية والصرفية والبنيات يمكن الحفاظ عليها في الثقافة لدراسات طويلة الأجل ( الشكل 3 ). في حين أن الأربطة المهندسة لا تعادل الأربطة الأصلية، الناضجة، فإنها تحمل التشابه مع الأوتار النامية / الأربطة وتتصرف على نحو مماثل للأنسجة الأصلية في استجابة للمواد المغذية"> 26، عوامل النمو 10 والهرمونات 25 ، وممارسة 11 ، 28. وبالتالي، في حين أن هناك ما يبرر الحذر قبل إجراء تعميمات واسعة من أي نموذج في المختبر ، والنتائج من اختبار بناء الرباط قد تكشف أو إبلاغ آلية فسيولوجية معينة قد تكون خلاف ذلك من المستحيل التحقيق في الجسم الحي.
إضافة وسائل الإعلام تغذية مع المصل مكيفة لنموذج مرنة وديناميكية مع تطبيقات واسعة
إن الميتابولوم البشري في الدم هو وسط 4،500 مركبة، بما في ذلك، على سبيل المثال لا الحصر، البروتينات السكرية، البروتينات الدهنية، مشتقات الدهون، ركائز الطاقة، الأيض، الفيتامينات، الإنزيمات، الهرمونات، الناقلات العصبية، وعدد كبير من اللبنات / الوسيطة. 29 مزيد من التفتيش على ميتابولوم المصل البشري وفقا لفئات مجمع 29 يكشف أديتيفوائد أونال من دمج المصل التجريبي في التجارب في المختبر. وهذا هو، فإن غالبية المركبات ~ 4500 في المصل هي مسعور أو الدهون المستمدة، مما يؤكد على أهمية بروتينات ملزمة للنقل / الانحلال. ويترتب على ذلك أن التجميع تجريبيا ديناميات النقل المركب الداخلي، وبالتالي التوافر البيولوجي والتفاعلات المركب الهدف، سيكون من المستحيل تقريبا. وبالتالي، المصل التجريبي هو فعال بشكل خاص لدراسة المركبات التي من المعروف أن تعتمد على جزيئات التبعي للذوبان والنقل، وملزم الهدف، وآلية العمل.
مختبرنا لديه مصلحة طويلة الأمد في الفوائد الصحية من ممارسة الرياضة. التمرين يحسن وظيفة الخلوية والأعضاء في مجموعة متنوعة من الأنسجة في جميع أنحاء الجسم 12 ، وهو تأثير يمكن أن يعزى إلى مجموعة متنوعة من العوامل (على سبيل المثال، إيل-6 13 ، إيل-15 14 ، ميتورين مثل 15 ،إكسوسوميس 16 ، 17 ) التي يتم إطلاقها في الدورة الدموية النظامية. وتعكس البيئة البيوكيميائية بعد التمرين العوامل التي تم إصدارها سواء من التعاقد مع الهرمونات المستجيبة للتمرين العضلي والعوامل التي يتم إصدارها نتيجة لتحفيز الجهاز العصبي الودي للغدد الإفرازية (على سبيل المثال ، الكورتيزول والكاتيكولامينات من الغدة الكظرية 18 ، والنمو هرمون من الغدة النخامية الأمامية 19 ). استخدمنا مؤخرا نموذجا لمصل ما قبل وبعد ممارسة التحقيق في آثار البيوكيميائية الناجم عن ممارسة النشاط على الأنسجة المهندسة. 1 وفي حين لا تزال هناك العديد من المسائل المهمة المتعلقة بالبحث، إلا أن النموذج ليس محدودا بهذه الطريقة. على سبيل المثال، يمكن الحصول على المصل، سواء من مصادر حيوانية أو بشرية، بعد التدخلات الغذائية أو الدوائية، أو من مختلف الفئات العمرية أو السكان السريريةs 30 . وبهذه الطريقة، فإن المركبات الخارجية أو الذاتية ذات الاهتمام ستكون موجودة في وسائل الإعلام المصل والعلاج، بكميات بيولوجية، وسوف تتفاعل مع الأنسجة المستهدفة بالتنسيق مع البيئة الذاتية ( أي ، في سياق أكثر الفسيولوجية). هذا النهج دينامي نظرا لأنه من المرجح جدا أن تدخل معين سوف تمارس تأثير متعدد الأعضاء (ومتعدد المركب)، وبالتالي سيتم تعديلها في بيئة فسيولوجية. في حين أن هذا النهج يعرض بعض التحديات، حيث يتم تغيير العديد من المتغيرات البيوكيميائية النظامية في وقت واحد، بل هو النهج الذي قد يساعد على التغلب على عيوب المنهجية التجريبية التخفيضية بحتة 31 ، 32 . مجتمعة، وتنفيذ المصل مكيفة جنبا إلى جنب مع الأنسجة المهندسة ( في المختبر بيوميمتيك ) الأنسجة يمكن أن تستخدم كأداة لعلم وظائف الأعضاء والتغذية والبحوث السريرية الأسئلة.
وقد استخدم مختبرنا مؤخرا هذا النموذج هندسة الأنسجة 25 </ سوب> لنموذج آخر للسكان، الرياضيين الإناث، الذين هم في خطر للإصابات النسيج الضام: الإصابة إصابة أكل ما يقرب من خمسة أضعاف من نظرائهم الذكور 35 . تم التحقيق في الآليات المحتملة التي يقوم عليها هذا التفاوت القائم على الجنس في الإصابة عن طريق معالجة بنايات الرباط مع تركيزات الفسيولوجية للهرمون الجنس للإناث، هرمون الاستروجين، في تركيزات التي تحاكي مراحل دورة الطمث. ومن المثير للاهتمام، تركيزات عالية من هرمون الاستروجين تثبيط التعبير الجيني والنشاط من أوكسيديز ليسل، والانزيم الأساسي المسؤول عن إنشاء ليسين يسين الروابط عبر في مصفوفة الكولاجين من الأربطة والأوتار. الأهم من ذلك، 48 ساعة من هرمون الاستروجين عالية (لمحاكاة المرحلة الجريبي) انخفض الرباط بناء صلابة دون تغيير كثافة الكولاجين من يبني. من وجهة النظر الفسيولوجية، وهذا يشير إلى أن الزيادات في التراخي الرباط في الإناث قد يكون راجعا، على الأقل جزئيا، إلى انخفاضعبر الارتباط تشكيل. من وجهة نظر تجريبية، هذه النتائج 25 تسليط الضوء على فائدة نموذج بناء 3D، مما يسمح النشاط عبر ربط وظيفية لفحصها. من وجهة نظر سريرية، ويمكن الآن أن تستخدم هذا النموذج لتظهر بسرعة للتدخلات التي يمكن أن تمنع الآثار السلبية لهرمون الاستروجين من وظيفة الرباط.
ملاحظات ختامية
هنا قدمنا منهجية مفصلة لتشكيل الأربطة هندسيا وفائدتها باعتبارها 3D في نموذج الأنسجة المختبرية. هذا النموذج قابل للتكيف إلى حد كبير مع مجموعة واسعة من الأهداف، وتوفير المرونة في نوع الخلية، والتدخلات، وقياس نتائج الفائدة. تكمل وسائل الإعلام تغذية مع مصل مكيفة يضيف السياق الفسيولوجية التي لا يمكن أن يتحقق في البيئة التقليدية في المختبر ، وتحسين النمذجة في علم وظائف الأعضاء الجسم الحي . وباختصار، نعتقد أن هذا هو وضع قابل للتطبيق على نطاق واسعلتر مع آثار مثيرة لتعزيز كل من مجالات علم وظائف الأعضاء وهندسة الأنسجة.
Disclosures
ويعلن المؤلفون أنه ليس لديهم مصالح مالية متنافسة.
Acknowledgments
وأيد هذا العمل من قبل زمالة ما بعد الدكتوراه نسيرك (دودو)، والمنح الدراسية جمعية الهلال الأحمر الأفغاني (آل)، و أوك ديفيس كلية العلوم البيولوجية منحة (كب).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors |
| β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors |
| o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors |
| Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
| Falcon 35 mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
| Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
| 1x Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
| 100x antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
| Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
| 100x penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
| Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
| DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
| Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
| Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 - 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
| CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 mm x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
| Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
| Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
| Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
| BD Vacutainer Red Plastic 10 mL | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
| Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22 G x 1 inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
| Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20 °C. |
| 6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4 °C. |
| L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4 °C. |
| Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20 °C. |
| Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
| Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6 M |
| 4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
| Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
| trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
| 1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
| Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
| Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
| Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
| Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
| Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |
References
- West, D. W., et al. The exercise-induced biochemical milieu enhances collagen content and tensile strength of engineered ligaments. J Physiol. 593 (20), 4665-4675 (2015).
- Booth, F. W., Laye, M. J. Lack of adequate appreciation of physical exercise's complexities can pre-empt appropriate design and interpretation in scientific discovery. J Physiol. 587 (Pt 23), 5527-5539 (2009).
- Booth, F. W., Hargreaves, M. Understanding multi-organ pathology from insufficient exercise. J Appl Physiol (1985). 111 (4), 1199-1200 (2011).
- Shearn, J. T., et al. Tendon tissue engineering: progress, challenges, and translation to the clinic. J Musculoskelet Neuronal Interact. 11 (2), 163-173 (2011).
- Liu, C. F., et al. What we should know before using tissue engineering techniques to repair injured tendons: a developmental biology perspective. Tissue Eng Part B Rev. 17 (3), 165-176 (2011).
- Vunjak-Novakovic, G., Altman, G., Horan, R., Kaplan, D. L. Tissue engineering of ligaments. Annu Rev Biomed Eng. 6, 131-156 (2004).
- Bayer, M. L., et al. The initiation of embryonic-like collagen fibrillogenesis by adult human tendon fibroblasts when cultured under tension. Biomaterials. 31 (18), 4889-4897 (2010).
- Guerquin, M. J., et al. Transcription factor EGR1 directs tendon differentiation and promotes tendon repair. J Clin Invest. 123 (8), 3564-3576 (2013).
- Ma, J., et al. Three-dimensional engineered bone-ligament-bone constructs for anterior cruciate ligament replacement. Tissue Eng Part A. 18 (1-2), 103-116 (2012).
- Hagerty, P., et al. The effect of growth factors on both collagen synthesis and tensile strength of engineered human ligaments. Biomaterials. 33 (27), 6355-6361 (2012).
- Paxton, J. Z., Hagerty, P., Andrick, J. J., Baar, K. Optimizing an intermittent stretch paradigm using ERK1/2 phosphorylation results in increased collagen synthesis in engineered ligaments. Tissue Eng Part A. 18 (3-4), 277-284 (2012).
- Safdar, A., et al. Endurance exercise rescues progeroid aging and induces systemic mitochondrial rejuvenation in mtDNA mutator mice. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (10), 4135-4140 (2011).
- Pedersen, B. K., Febbraio, M. A. Muscles, exercise and obesity: skeletal muscle as a secretory organ. Nat Rev Endocrinol. 8 (8), 457-465 (2012).
- Crane, J. D., et al. Exercise-stimulated interleukin-15 is controlled by AMPK and regulates skin metabolism and aging. Aging Cell. 14 (4), 625-634 (2015).
- Rao, R. R., et al. Meteorin-like is a hormone that regulates immune-adipose interactions to increase beige fat thermogenesis. Cell. 157 (6), 1279-1291 (2014).
- Aswad, H., et al. Exosomes participate in the alteration of muscle homeostasis during lipid-induced insulin resistance in mice. Diabetologia. 57 (10), 2155-2164 (2014).
- Safdar, A., Saleem, A., Tarnopolsky, M. A. The potential of endurance exercise-derived exosomes to treat metabolic diseases. Nat Rev Endocrinol. 12 (9), advance online publication 504-517 (2016).
- Maling, H. M., Stern, D. N., Altland, P. D., Highman, B., Brodie, B. B. The physiologic role of the sympathetic nervous system in exercise. J Pharmacol Exp Ther. 154 (1), 35-45 (1966).
- Pritzlaff, C. J., et al. Impact of acute exercise intensity on pulsatile growth hormone release in men. J Appl Physiol (1985). 87 (2), 498-504 (1999).
- Creemers, L. B., Jansen, D. C., van Veen-Reurings, A., van den Bos, T., Everts, V. Microassay for the assessment of low levels of hydroxyproline. Biotechniques. 22 (4), 656-658 (1997).
- Neuman, R. E., Logan, M. A. The determination of hydroxyproline. J Biol Chem. 184 (1), 299-306 (1950).
- Paxton, J. Z., Donnelly, K., Keatch, R. P., Baar, K., Grover, L. M. Factors affecting the longevity and strength in an in vitro model of the bone-ligament interface. Ann Biomed Eng. 38 (6), 2155-2166 (2010).
- Woessner, J. F. Jr The determination of hydroxyproline in tissue and protein samples containing small proportions of this imino acid. Arch Biochem Biophys. 93, 440-447 (1961).
- Paxton, J. Z., Wudebwe, U. N., Wang, A., Woods, D., Grover, L. M. Monitoring sinew contraction during formation of tissue-engineered fibrin-based ligament constructs. Tissue Eng Part A. 18 (15-16), 1596-1607 (2012).
- Lee, C. A., et al. Estrogen inhibits lysyl oxidase and decreases mechanical function in engineered ligaments. J Appl Physiol (1985). 118 (10), 1250-1257 (2015).
- Paxton, J. Z., Grover, L. M., Baar, K. Engineering an in vitro model of a functional ligament from bone to bone. Tissue Eng Part A. 16 (11), 3515-3525 (2010).
- Heinemeier, K., Langberg, H., Kjaer, M. Exercise-induced changes in circulating levels of transforming growth factor-beta-1 in humans: methodological considerations. Eur J Appl Physiol. 90 (1-2), 171-177 (2003).
- Mackey, A. L., Heinemeier, K. M., Koskinen, S. O., Kjaer, M. Dynamic adaptation of tendon and muscle connective tissue to mechanical loading. Connect Tissue Res. 49 (3), 165-168 (2008).
- Psychogios, N., et al. The human serum metabolome. PLoS One. 6 (2), e16957 (2011).
- Nguyen, T., et al. The effects of resting and exercise serum from children with cystic fibrosis on C2C12 myoblast proliferation in vitro. Physiol Rep. 2 (6), e12042 (2014).
- Joyner, M. J., Pedersen, B. K. Ten questions about systems biology. J Physiol. 589 (Pt 5), 1017-1030 (2011).
- Joyner, M. J. Giant sucking sound: can physiology fill the intellectual void left by the reductionists? J Appl Physiol (1985). 111 (2), 335-342 (2011).
- Benjamin, M., et al. Where tendons and ligaments meet bone: attachment sites ('entheses') in relation to exercise and/or mechanical load. J Anat. 208 (4), 471-490 (2006).
- Arruda, E. M., Calve, S., Dennis, R. G., Mundy, K., Baar, K. Regional variation of tibialis anterior tendon mechanics is lost following denervation. J Appl Physiol (1985). 101 (4), 1113-1117 (1985).
- Arendt, E., Dick, R. Knee injury patterns among men and women in collegiate basketball and soccer. NCAA data and review of literature. Am J Sports Med. 23 (6), 694-701 (1995).
