Vi presenterer en modell av ligamentvev, hvor tredimensjonale konstruksjoner behandles med det menneskelige treningsconditionerte serum og analyseres for kollageninnhold, funksjon og cellulær biokjemi.
In vitro- eksperimenter er avgjørende for å forstå biologiske mekanismer; Imidlertid er gapet mellom monolags vevskultur og menneskelig fysiologi stor, og oversettelsen av funn er ofte dårlig. Dermed er det god mulighet for alternative eksperimentelle tilnærminger. Her presenterer vi en tilnærming hvor menneskelige celler isoleres fra menneskelige fremre korsbåndsvevrester, utvidet i kultur, og brukes til å danne manipulerte ledbånd. Øvelse endrer det biokjemiske miljøet i blodet slik at funksjonen til mange vev, organer og kroppslige prosesser blir bedre. I dette forsøket ble ligamentkonstruksjonskulturmedier supplert med eksperimentelt humant serum som har blitt "kondisjonert" ved trening. Dermed er intervensjonen mer biologisk relevant siden et eksperimentelt vev utsettes for det fullstendig endogene biokjemiske miljøet, inkludert bindingsproteiner og tilleggsforbindelser som kan forandres i takt med aktiviteten til enUkjent agent av interesse. Etter behandling kan manipulerte ledbånd analyseres for mekanisk funksjon, kollageninnhold, morfologi og cellulær biokjemi. Samlet sett er det fire store fordeler i forhold til tradisjonelle monolagskultur og dyremodeller, av den fysiologiske modellen av ligamentvev som presenteres her. Først er ligamentkonstruksjoner tredimensjonale, slik at mekaniske egenskaper ( dvs. funksjon) som maksimal strekkspenning, maksimal strekkbelastning og modul, kan kvantifiseres. For det andre kan entesis, grensesnittet mellom boney og sengeelementer, undersøkes i detalj og innenfor funksjonell sammenheng. For det tredje, forbereder media med etterøvelsesserum effektene av det treningsinducerte biokjemiske miljøet, som er ansvarlig for det brede spekteret av helsemessige fordeler av trening, som skal undersøkes på en upartisk måte. Endelig fremmer denne eksperimentelle modellen vitenskapelig forskning på en human og etisk måte ved å erstatte bruken avDyr, et kjernemandat av National Institutes of Health, Senter for sykdomskontroll, og Food and Drug Administration.
Tendon- og ligamentskader er vanlige og kan ha forstyrrende konsekvenser for normal mobilitet og livskvalitet. Kirurgisk inngrep er ofte nødvendig, men kan ha begrenset og variert suksess 4 , 5 . Den nåværende forståelsen av hvordan sener og leddbånd utvikler, modnes og reagerer på skade er ufullstendige, og dermed er det behov for effektive forskningsmodeller for å gi innsikt i utviklingen av mer effektive behandlinger 5 . For å løse dette kunnskapsgapet kan dyremodeller brukes, men in vivo- studier er iboende komplekse med vanskeligheter med å kontrollere miljøet og rettet mot inngrep til det tilsiktede vevet. I motsetning kan det eksperimentelle miljøet enkelt styres og overvåkes in vitro med tradisjonell monolagcellekultur. Denne teknikken kan imidlertid oversimplisere det kjemiske og mekaniske miljøet og kan derfor ikke rekapituereSen in vivo oppførsel av cellene. Vevsteknologi er i stand til å gifte seg med fordelene med det komplekse in vivo miljøet i dyremodeller med kontroll av in vitro- miljøet og gir et ekstra verktøy for å studere fysiologi. I tillegg, bevæpnet med en bedre forståelse av ligamentutvikling, kan vevsteknikk også gi en kilde til graftvev når kirurgisk rekonstruksjon kreves 6 . Således validerer fremgangsmåten beskrevet heri et in vitro 3D-konstruert vev som kan brukes til å studere ligamentfunksjon og morfologi.
Fibrinbaserte sener eller ligamentkonstruksjoner har blitt anvendt som en in vitro- modell for å studere fysiologiske prosesser, inkludert kollagenfibrillogenese 7 og senerutvikling 8 , samt translasjonsapplikasjoner hvor deres brukbarhet som graftvev har blitt evaluert i en fårmodell av fremre crudeCiate ligament (ACL) rekonstruksjon 9 . Vårt laboratorium har tidligere etablert en 3D-konstruert ligamentmodell som spenner over to pensitt, et kalsiumfosfatbein-erstatningsmateriale, sementankre. Denne modellen kan enkelt underkastes forskjellige eksperimentelle forhold ved å supplere kulturmediene med biologiske faktorer 10 eller anvende mekanisk stimulering 11 . Det er viktig at denne ben-til-ben-ligamentmodellen muliggjør en grundig analyse av enthesis, grensesnittet mellom boney og sengeelementer, som er utsatt for skade.
I studien uthevet 1 her for å presentere denne metoden, var vi interessert i effekten av treningsinducerte endringer i det biokjemiske miljøet på ligamentfunksjonen. Øvelse forbedrer mobil- og orgelfunksjonen i en rekke vev gjennom hele kroppen 2 , 3 , </suP> 12 , en effekt som kan tilskrives frigjøring av forskjellige kjente (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , meteorinlignende 15 , exosomer 16 , 17 ) og andre ukjente, biokjemiske faktorer frigjort i systemisk sirkulasjon . Videre er det biokjemiske miljøet etter øvelsen beriket med treningsresponsive hormoner, hvor frigjøringen stimuleres av sympatisk nervesystemstimulering av sekretoriske kjertler ( f.eks . Kortisol og katekolaminer fra binyrene 18 og veksthormon fra den fremre hypofysen 19 ). Imidlertid er det ikke mulig å skille mellom effektene av den mekaniske stimulansen til trening fra treningsinducerte biokjemiske endringer. Mens noen studier har preget den forventede økningen av visse sirkulerende hormoner og cytokiner som respons på exercisE som nevnt ovenfor, er det for mange faktorer, både kjente og ukjente, å trofaste rekapulere in vitro. Det vil si at isolering av noen få faktorer for en in vitro- studie tar ufullstendig hensyn til kompleksiteten av den biokjemiske responsen. I denne studien undersøkte vi hvordan endringer i det serologiske biokjemiske miljøet som følge av trening, påvirker konstruert ligamentfunksjon. For å isolere effektene av de biokjemiske endringene, oppnådde vi serum fra menneskelige deltakere før og etter en kamp mot motstandsøvelse og brukte den til å behandle 3D-konstruerte ligamenter dannet ved hjelp av human-anterior cruciate ligament (ACL) fibroblaster. Ved hjelp av denne modellen kan vi få funksjonelle data, inkludert effekter på mekaniske egenskaper og kollageninnhold, samt kvantifisere effekter på molekylær signalering.
Nåværende manuskript beskriver en modell av ligamentvev som er en nyttig eksperimentell plattform for etterforskere med et bredt spekter av forskningsemner, fra vevsutvikling til oversettelse / kliniske spørsmål. Den konstruerte ligamentmodellen beskrevet her er basert på en allsidig protokoll som kan tilpasses på ulike punkter gjennom arbeidsflyten ( Figur 1 og Diskusjonsseksjon ). Videre kan den iboende reduksjonstype av in vitro- miljøet bringes nærmere til det fysiologiske rike ved å supplere fodermedium med konditionert humant eller dyre serum.
Konstruksjoner kan dannes ved bruk av fibroblaster fra en rekke kilder
Mens metodologien og de representative resultatene vist her er basert på bruk av primære ACL-fibroblaster, kan cellisolasjonsprotokollen justeres for å samle andre typer primære fibroblaster. Som beskrevetI figur 4 viser konstruerte ligamenter dannet med primære celler isolert fra unge humane donorer lav donorvariabilitet. Primærceller er begrenset av innledende isolasjon og passasjerbegrensning; Bruken av cellelinjer kan forbedre reproduserbarheten av forsøkene. Bruken av andre celletyper kan kreve modifikasjoner i cellekulturmedium og fibringelformulering. For eksempel har vi observert at menneskelige mesenkymale stamceller (MSCs) ikke er i stand til å danne lineære vev mellom pensitt sementankre i løpet av 2 uker, mens equine overlegen digitale flexor tendon fibroblaster, equine benmarg stromal celler, kylling embryonale sene fibroblaster , Og murine C3H10T1 / 2 MSCs kontraherer raskt og fordøyer fibringelen for å danne et lineært vev (ikke offentliggjorte observasjoner). Denne kontrasten kan være en konsekvens av forskjeller i cellekontraktilitet, proliferasjon og fibrinolytisk enzymproduksjon.
Påføring av kjemikalierOg mekanisk stimulering
I fremgangsmåten beskrevet heri danner fibrinbasert vev rundt borstitt sementankre, som tillater påføring av mekanisk stimulering via en strekkbioreaktor 11 , samt for sluttpunktstesting. Tilstedeværelsen av borstet sement-mykt vev-grensesnitt (enthesis) gir også mulighet for videre undersøkelse og forbedring 22 , 26 (se avsnittet Klinisk bruk nedenfor). I dette in vitro- miljøet kan bidraget av kjemiske og mekaniske faktorer lettere identifiseres; Et eksempel på dette er vist i figur 5 , hvorved effekten av serummiljøet etter utøvelsen ble separert fra de mekaniske stimuli av trening. Pilotstudier kan være nødvendig for å bestemme tidsrammen for eksperimentelle inngrep, sammensetning av behandlinger og passende sluttpunkter for å forvente en observerbar forandring. foEksempelvis ble det i serumstudie 1 etter utøving begrenset av lengden av eksperimentell behandling ved tilførsel av serum som ble brukt til å supplere media, hvorfra konstruksjoner ble gitt hver annen dag. Videre ble kulturmediet i løpet av den andre uken av kulturen supplert med hvile eller etterøvelsesserum med ascorbinsyre og L-prolin opprettholdt mens TGF-β1 ble fjernet. TGF-β1 er en kjent profibrotisk vekstfaktor som øker i serum etter trening 27 . For å unngå å skjule TGF-β1-relaterte effekter av etterøvelsesserumet ble dette cytokinet ikke opprettholdt i kulturmediet.
Denne konstruerte ligamentmodellen kan også brukes til å teste effekten av mekanisk strekk. Ved å konstruere omvendte modellerte grep for å holde pensel sementankerendene (ligner den uniaxial strekkprøven som er vist i figur 1 ), kan strekke bioreaktorer være utformet for å imøtekomme eng Ineered ledbånd. Vårt laboratorium har tidligere brukt denne modellen til å undersøke molekylær signalrespons av konstruerte ledbånd til uniaxial strekkstreng i en skreddersydd bioreaktor 11 som vil gi en bedre forståelse for den rasjonelle utformingen av et in vitro- sträckeparadigma eller til og med potensielt in vivo Strekk / aktivitet / terapeutiske applikasjoner.
Vurdering av konstruerte ledbånd
Som med tradisjonell monolagskultur kan 3D-konstruksjoner analyseres for gen / proteinuttrykk; I tillegg gir deres 3D-morfologi muligheten til å vurdere funksjonelle og morfologiske endringer, og konstruksjoner kan opprettholdes i kultur for langsiktige studier ( Figur 3 ). Mens konstruerte ledbånd ikke er ekvivalente med native, modne leddbånd, bærer de likhet med å utvikle sener / ledbånd og oppfører seg på samme måte som nativt vev som svar på næringsstoffer"> 26, vekstfaktorer 10 , hormoner 25 og øvelse 11 , 28. Således, mens forsiktighet er berettiget før det gjøres brede generaliseringer fra en hvilken som helst in vitro- modell, kan resultater fra ligamentkonstruksjonstesting avsløre eller informere en bestemt fysiologisk mekanisme som ellers kan være Umulig å undersøke in vivo.
Tilleggsmedier med kondisjonert serum for en fleksibel og dynamisk modell med brede anvendelser
Det humane serummetabolom er et miljø med ~ 4500 forbindelser, inkludert, men ikke begrenset til, glykoproteiner, lipoproteiner, lipidderivater, energisubstrater, metabolitter, vitaminer, enzymer, hormoner, nevrotransmittere og en mengde byggeblokker / mellomprodukter. 29 Ytterligere inspeksjon av det humane serummetabolom ifølge forbindelsesklasser 29 avslører additiOnal fordeler ved å integrere eksperimentelt serum i in vitro eksperimenter. Det vil si at flertallet av de ~ 4500 forbindelsene i serum er hydrofobe eller lipid-avledet, understreker betydningen av bindende proteiner for transport / oppløseliggjøring. Det følger at eksperimentelt rekapitulerende endogen sammensatt transportdynamikk, og dermed biotilgjengelighet og sammensatte mål-interaksjoner, ville være nesten umulig. Således er eksperimentelt serum spesielt effektivt for studiet av forbindelser som er kjent for å avhenge av tilsetningsmolekyler for oppløsning, transport, målbinding og virkningsmekanisme.
Vårt laboratorium har langvarig interesse for helsemessige fordeler av trening. Øvelse forbedrer mobil- og orgelfunksjonen i en rekke vev gjennom hele kroppen 12 , en effekt som kan tilskrives en rekke faktorer (f.eks. IL-6 13 , IL-15 14 , Meteorin-like 15 ,Eksosomer 16 , 17 ) som frigjøres i systemisk sirkulasjon. Det biokjemiske miljøet etter øvelsen reflekterer faktorer som frigjøres både fra kontraherende skjelettmuskulære treningsresponsive hormoner, samt faktorer som frigjøres som følge av sympatisk nervesystemstimulering av sekretoriske kirtler ( f.eks . Kortisol og katekolaminer fra binyrene 18 og vekst Hormon fra den fremre hypofysen 19 ). Vi har nylig brukt en modell av pre- og post-øvelses serum for å undersøke effekten av det treningsinducerte biokjemiske miljøet på manipulert vev. 1 Mens mange viktige oppgavespørsmål forblir, er modellen på ingen måte begrenset på denne måten. For eksempel kan serum oppnås, enten fra dyr eller mennesker, etter diett eller farmakologisk inngrep, eller fra forskjellige aldersgrupper eller klinisk populasjonS 30 . På denne måten vil eksogene eller endogene forbindelser av interesse være tilstede i serum og behandlingsmedier i biotilgjengelige mengder og vil samhandle med målvevet i samspill med det endogene miljøet ( dvs. i en mer fysiologisk sammenheng). Denne tilnærmingen er dynamisk siden det er høyst sannsynlig at en gitt intervensjon vil utøve en multi-organ (og multi-sammensatt) effekt, og dermed vil det fysiologiske miljøet bli kodifisert. Mens denne tilnærmingen gir visse utfordringer, siden flere systemiske biokjemiske variabler endres samtidig, er det en tilnærming som kan bidra til å overvinne ulemper med rent reduktivistisk eksperimentell metode 31 , 32 . Tillsammans kan implementering av betinget serum sammen med et vev-konstruert ( in vitro biomimetisk ) vev, brukes som et verktøy for fysiologi, ernæring og kliniske undersøkelsesspørsmål.
<stronG> Kliniske applikasjoner er mange
Vevsteknikkmodellen som presenteres her, kan brukes til å undersøke anatomiske og kliniske forskningsspørsmål som tradisjonelle in vitro- modeller ikke kan. Et ligament eller en senge in vivo inneholder en myk-til-hard vevsovergangsområde kalt enthesis. Innsatsen, som er sårbar for mekanisk stressrelatert skade 33 , kan studeres i tverrsnitt via histokemiske og elektronmikroskopiteknikker 22 , 26 . Dette unike grensesnittet er dobbelt viktig for de med lav eller begrenset mobilitet, siden fysisk inaktivitet forringer bindevevets evne til å overføre belastning til regioner med lav til høy overensstemmelse 34 , noe som resulterer i en generell reduksjon i vevsoverensstemmelse og økt skaderisiko.
Vårt laboratorium har nylig brukt denne vevsteknikkmodellen 25 </ Sup> å modellere en annen befolkning, kvinnelige idrettsutøvere, som er i fare for bindevevskader: forekomsten av ACL-skade er omtrent fem ganger større enn sine mannlige kolleger 35 . Potensielle mekanismer som ligger til grund for denne kjønnsbaserte ulempen ved skade ble undersøkt ved å behandle ligamentkonstruksjoner med fysiologiske konsentrasjoner av det kvinnelige kjønnshormonet, østrogen, i konsentrasjoner som etterliknet stadier av menstruasjonssyklusen. Interessant hindret høye konsentrasjoner av østrogen genuttrykk og aktivitet av lysloksidase, det primære enzymet som var ansvarlig for å skape lysin-lysin-kryssbindinger i kollagenmatrisen av ledbånd og sener. Det er viktig at 48 h høy østrogen (for å simulere follikulærfasen) reduserte ligamentkonstruksstivheten uten å endre kollagen tetthet av konstruksjonene. Fra et fysiologisk perspektiv antyder dette at økningen i ligamentslaksighet hos kvinner kan skyldes, i det minste delvis, å reduseresTverrbindingsdannelse. Fra et eksperimentelt perspektiv markerer disse funnene 25 nytten av 3D-konstruksjonsmodellen, som tillot funksjonell tverrbindingsaktivitet som skal undersøkes. Fra et klinisk perspektiv kan denne modellen nå brukes til å raskt skjerme for inngrep som kan forhindre de negative effektene av østrogen av ligamentfunksjon.
Avsluttende bemerkninger
Her har vi presentert en detaljert metodikk for dannelsen av konstruerte ledbånd og deres brukervennlighet som en 3D in vitro vevsmodell. Modellen er svært tilpassbar til et bredt spekter av mål, som gir fleksibilitet i celletype, intervensjoner og utfallsmålinger av interesse. Tilfylling av matemedia med kondisjonert serum legger til en fysiologisk kontekst som ikke kan oppnås i et tradisjonelt in vitro- miljø, og forbedrer modelleringen av in vivo fysiologi. Kort sagt, vi tror dette er en bredt anvendelig modusL med spennende implikasjoner for å fremme både fysiologi og vevsteknikk.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av et NSERC postdoktoralt fellesskap (DWDW), en ARCS Foundation Scholarship (AL), og en UC Davis College of Biological Sciences grant (KB).
Austerlitz Insect pins, minutien stainless steel, size 0.20 | Entomoravia | N/A | For brushite cement anchors; include info on multiple sources and alternative products |
β-tricalcium phosphate | Plasma Biotal Ltd (Derbyshire, UK) | N/A | For brushite cement anchors; include whether it's hazardous /toxic |
o-phosphoric acid, 85% (w/w) | EMD Millipore | PX0995 | For brushite cement anchors; include info on preparation |
Citric acid | Sigma-Aldrich | 251275-500g | For brushite cement anchors |
Falcon 35mm tissue culture dishes | Fisher Scientific | 08-772A | For silicone-coated plates |
Sylgard 184 silicone elastomer kit | Ellsworth Adhesives | 4019862 | For silicone-coated plates |
1X Phosphate-buffered saline (PBS) | Fisher Scientific | SH3002802 | For cell isolation and expansion |
100X antibiotic/antimycotic solution | VWR | 45000-616 | For cell isolation |
Type II collagenase | Thermo Fisher Scientific | 17101015 | For cell isolation |
100X penicillin/streptomycin solution | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | For cell isolation |
Steriflip-GP, 0.22 µm pore, polyethersulfone, gamma irradiated | EMD Millipore | SCGP00525 | For reagent sterilization |
DMEM high glucose with sodium pyruvate and L-glutamine | VWR | 10-013-CV | For cell and tissue culture |
Fetal bovine serum | BioSera | FBS2000 | Component of tissue digestion media and growth media |
Penicillin G Potassium Salt | MP Biomedicals | 0219453680 – 100 MU | Component of growth media. Dissolve in water to 100,000 U/mL, filter sterilize, aliquot, and store at -20°C. |
CELLSTAR polystyrene tissue culture dishes (145 x 20 mm) | VWR | 82050-598 | For cell culture |
Trypan blue | Thermo Fisher Scientific | T10282 | For cell isolation |
Trypsin-EDTA (0.25%) | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | For cell culture. Dilute to 0.05% in PBS |
Dimethyl sulfoxide | Sigma-Aldrich | 472301 | For cell freezing media |
Nalgene Mr. Frosty Cryogenic Freezing Container | Thermo Fisher Scientific | 5100-0001 | For cell freezing |
BD Vacutainer Red Plastic 10 ml | Fisher Scientific | 367820 | For human serum collection |
Bound Tree Insyte Autoguard IV Catheters, 22ga x 1inch Needle | Fisher Scientific | 354221 | For human serum collection |
Thrombin, bovine origin | Sigma-Aldrich | T4648-1KU | For engineered ligament formation. Dissolve at 200 U/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Fibrinogen, bovine origin | Sigma-Aldrich | F8630-5G | For engineered ligament formation. Dissolve at 20 mg/mL in DMEM high glucose media. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
Aprotinin from bovine lung | Sigma-Aldrich | A3428 | For engineered ligament formation. Dissolve at 10 mg/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at -20°C. |
6-Aminohexanoic acid | Sigma-Aldrich | 07260-100g | For engineered ligament formation. Dissolve at 0.1g/mL in water. Filter at 0.22 μm, aliquot, and store at 4°C. |
L-Ascorbic acid 2-phosphate sesquimagnesium salt hydrate | Sigma-Aldrich | A8960-5G | Component of feed media. Dissolve in DMEM high glucose media at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
L-proline | Sigma-Aldrich | P5607-25G | Component of feed media. Dissolve in PBS at a concentration of 50 mM. Filter at 0.22 μm and store at 4°C. |
Transforming growth factor-β1 | Peprotech | 100-21 | Component of feed media. Reconsistute according to manufacturer's instructions at a concentration of 10 μg/mL. Aliquot and store at -20°C. |
Stericup-GP, 0.22 µm, polyethersulfone, 250 mL, radio-sterilized | EMD Millipore | SCGPU02RE | For reagent sterilization |
Hydrochloric acid | Fisher Scientific | A144-212 | Dilute in water to 6M |
4-Dimethylaminobenzaldehyde | Sigma-Aldrich | 39070-50g | For hydroxyproline assay |
Chloramine-T trihydrate | Sigma-Aldrich | 402869-100g | For hydroxyproline assay |
trans-4-Hydroxy-L-proline | Sigma-Aldrich | H54409-100g | For hydroxyproline assay |
1-propanol | Sigma-Aldrich | 279544-1L | For hydroxyproline assay |
Perchloric acid | Sigma-Aldrich | 311421-250ml | For hydroxyproline assay |
Acetic acid, glacial | EMD Millipore | AX0073-9 | For hydroxyproline assay |
Sodium hydroxide | Fisher Scientific | S318-500 | For hydroxyproline assay |
Toluene, anhydrous | Sigma-Aldrich | 244511-1L | For hydroxyproline assay |
Corning Costar Clear Polystyrene 96-Well Plates | Fisher Scientific | 07-200-656 | For hydroxyproline assay |