O método aqui apresentado descreve um sistema de diferenciação -Ready escalável e boas práticas de fabrico (BPF) para gerar células de hepatócitos-like humanos a partir de células-tronco pluripotentes. Ele serve como um sistema eficaz e padronizado para gerar células de hepatócitos-like humanos para a pesquisa básica e aplicada fígado humano.
células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) possuem grande valor para a investigação biomédica. hPSCs pode ser dimensionado e diferenciada a todos os tipos de células encontradas no corpo humano. A diferenciação das células para hPSCs de hepatócitos humanos (como-HLCS) tem sido extensivamente estudado, e protocolos de diferenciação eficientes foram estabelecidas. A combinação de matriz extracelular e os estímulos biológicos, incluindo factores de crescimento, citoquinas, e as moléculas pequenas, tornaram possível para gerar HLCS que se assemelham a hepatócitos humanos primários. No entanto, a maioria dos procedimentos ainda empregam componentes indefinidos, dando origem a variações de lote para lote. Este serve como uma barreira significativa para a aplicação da tecnologia. Para resolver esta questão, desenvolvemos um sistema definido para a diferenciação de hepatócitos usando lamininas recombinantes humanos como matrizes extracelulares, em combinação com um processo de diferenciação sem soro. Altamente especificação hepatócito eficiente foi alcançada, com detrado melhorias tanto na função HLC e fenótipo. Importante, este sistema é fácil de escalar usando pesquisa e GMP-grade HPSC linhas avanços promissores na modelagem e terapias à base de células.
tecido humano primário e os tipos de células derivados são usados regularmente, tanto para a triagem baseada em células e na clínica. No entanto, o acesso a essas células é severamente limitada devido à insuficiente doação de órgãos e perda de fenótipos celulares pós-isolamento 1. hPSCs representam uma alternativa promissora para o tecido primária e facilitar a geração de células somáticas humanas geneticamente definidas e renováveis. células de hepatócitos-like (HLCS) derivadas de hPSCs já mostraram promessa neste campo. HLCS assemelhar-se hepatócitos primários humanos em vários aspectos, incluindo a morfologia celular, a expressão do gene do hepatócito, a função metabólica e sensibilidade a drogas e vírus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Além disso, a proliferação ilimitada ecapacidade de auto-renovação de ambos os hPSCs pesquisadores e GMP-grade facilita a sua aplicação 9, 10.
Mais de uma década de pesquisa tem produzido um número de hepatócitos eficiente procedimentos de diferenciação 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. No entanto, a maioria destes sistemas utilizam componentes indefinidos e / ou a transdução virai para conduzir especificação hepatocelular. Para melhorar a fiabilidade da tecnologia em escala, é importante desenvolver uma diferenciação de hepatócitos robustasistema que é verdadeiramente definido e livre de xeno, e GMP-compatível.
As lamininas (LNs) são importantes proteínas da matriz extracelular que podem influenciar a adesão celular, proliferação, migração, e diferenciação. As lamininas são glicoproteínas heterotriméricas compostas de um α, um β, e uma cadeia γ. Recentemente, lamininas humanos recombinantes foram produzidos e utilizados em biologia celular. LN-511 foi mostrada para apoiar a manutenção da hPSCs 21, enquanto uma mistura de LN-521 e E-caderina permite derivação clonal e a expansão de células estaminais embrionárias humanas 22. LN-111, por outro lado, suporta a manutenção de células-hepatoblast como derivados de hPSCs 23. No entanto, antes do nosso relatório, lamininas 521 e 111 não tinham sido utilizados para gerar HLCS com características maduras a partir hPSCs 10.
Aqui, os procedimentos detalhados para a cultura hPSCs no LN-521e diferenciando-as em ambos os LN-521 ou uma mistura de LN-521 e LN-111 (LN-521 / LN-111). Nós otimizamos o protocolo de diferenciação usando semeadura de uma única célula para gerar uma monocamada altamente reprodutível e homogénea de HLCS em vários formatos 14. Acreditamos que o nosso sistema de diferenciação definido representa um método simples e de baixo custo para a fabricação de HLCS ativas para aplicação, o que representa um avanço significativo no campo.
Para avançar a pesquisa humana de células-tronco pluripotentes e medicina translacional, sistemas livres de xeno que cumprem com as actuais orientações de boas práticas de fabricação são necessários. Chave para qualquer processo de diferenciação é a matriz extracelular (ECM). O ECM não só apoia a fixação das células, mas também permite o acesso a factores-chave de sinalização, influenciando a determinação celular e fenótipo 25, 26.
As lamininas são proteínas multifuncionais da matriz extracelular in vivo. No fígado, secreção de laminina é crucial para a regeneração do fígado após hepatectomia parcial 27 e é necessária para a manutenção de células progenitoras hepáticas 28. A importância da lamininas em manutenção fígado e regeneração foi a base para testar comercialmente disponíveis lamininas humanos recombinantes em nosso sistema de diferenciação de hepatócitos.
ele Superiorpatocyte diferenciação foi conseguida em LN-521 e LN-521 / LN-111 substratos quando comparado com Matrigel. HLCS derivados foram claramente polarizado e organizado no prato, e sua função celular foi significativamente melhorada quando comparado com os seus homólogos mistura de proteína gelatinosos. Subjacente a estas melhorias foi a regulação negativa dos contaminantes Colon-, a fibroblastos e haste genes associados a células sobre as lamininas, bem como uma diminuição na proliferação de células e expressão de genes associada à migração 10.
Em conclusão, o protocolo aqui descrito gera células de hepatócitos, como que estão mais próximos na natureza para hepatócitos humanos adultos. O processo é reprodutível, passível de automação, e pode ser escalado para aplicação de forma rentável. Importante, a variação lote-a-lote foi significativamente diminuída em comparação com as técnicas que utilizam Matrigel, resultando em um sistema de diferenciação melhorada para os investigadores neste campo. </p>
The authors have nothing to disclose.
Este trabalho foi apoiado com prêmios do Reino Unido Regenerative Medicine Platform (MRC MR / L022974 / 1 e MR / K026666 / 1) e uma bolsa de estudos China.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |