Metoden præsenteres her beskriver en skalerbar og god fremstillingspraksis (GMP) også egnet differentiering system til at generere human hepatocyt-lignende celler fra pluripotente stamceller. Det tjener som en omkostningseffektiv og standardiseret system til at generere human hepatocyt-lignende celler til grundforskning og anvendt human lever forskning.
Humane pluripotente stamceller (hPSCs) besidder stor værdi for biomedicinsk forskning. hPSCs kan skaleres og differentieret til alle celletyper fundet i menneskekroppen. Differentieringen af hPSCs til human hepatocyt-lignende celler (HLCs) er blevet grundigt undersøgt, og effektive differentiering protokoller er blevet etableret. Kombinationen af ekstracellulær matrix og biologiske stimuli, herunder vækstfaktorer, cytokiner og små molekyler, har gjort det muligt at generere HLCs der ligner primære humane hepatocytter. Men de fleste af procedurer stadig ansætte udefinerede komponenter, der giver anledning til batch-til-batch variation. Dette tjener som en væsentlig barriere for anvendelsen af teknologien. For at løse dette problem, har vi udviklet et defineret system til hepatocyt differentiering ved hjælp af humane rekombinante lamininer som ekstracellulære matricer i kombination med et serum-frit differentiering proces. Meget effektiv hepatocyt specifikation blev opnået, med depaavist forbedringer i både HLC funktion og fænotype. Vigtigt er det, dette system er let at skalere op ved hjælp forsknings- og GMP-grade hPSC linjer lovende fremskridt i cellebaserede modellering og terapier.
Primære humane væv og de afledte celletyper anvendes regelmæssigt, både for cellebaseret screening og i klinikken. Imidlertid er adgangen til disse celler alvorligt begrænset på grund af utilstrækkelig organdonation og tab af celle fænotyper post-isolation 1. hPSCs repræsenterer et lovende alternativ til primært væv og letter frembringelsen af genetisk definerede og vedvarende humane somatiske celler. Hepatocyt-lignende celler (HLCs) afledt af hPSCs har allerede vist sig lovende på dette område. HLCs ligne primære humane hepatocytter i forskellige aspekter, herunder cellemorfologi, hepatocyt genekspression, metaboliske funktion, og følsomhed over for lægemidler og virus 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Derudover ubegrænset proliferation ogselvfornyelse kapacitet af både forsknings- og GMP-grade hPSCs letter deres anvendelse 9, 10.
Over et årti med forskning har produceret en række effektiv hepatocyt differentiering procedurer 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Men de fleste af disse systemer anvender udefinerede komponenter og / eller viral transduktion til drev hepatocellulær specifikation. For at forbedre pålideligheden af teknologien på skalaen, er det vigtigt at udvikle en robust hepatocyt differentieringsystem, der er virkelig defineret, xenotransplantation-fri, og GMP-kompatible.
Lamininer (LMS) er vigtige ekstracellulære matrixproteiner, der kan påvirke celleadhæsion, proliferation, migration og differentiering. Lamininer er heterotrimere glycoproteiner sammensat af en α, β én og én γ-kæde. For nylig har rekombinante humane lamininer blevet produceret og anvendt i cellebiologi. LN-511 har vist sig at støtte opretholdelsen af hPSCs 21, mens en blanding af LN-521 og E-cadherin tillader klonal afledning og udvidelse af humane embryonale stamceller 22. LN-111, på den anden side, støtter opretholdelsen af hepatoblast-lignende celler afledt af hPSCs 23. Men før vores rapport, lamininer 521, og 111 ikke var blevet udnyttet til at generere HLCs med modne egenskaber fra hPSCs 10.
Her har vi detaljerede procedurer for dyrkning hPSCs på LN-521og differentiere dem på enten LN-521 eller en blanding af LN-521 og LN-111 (LN-521 / LN-111). Vi optimeret differentieringen protokol anvendes enkelt-celle podning til at generere en meget reproducerbar og ensartet monolag af HLCs i mange formater 14. Vi mener, at vores definerede differentiering systemet udgør en enkel og omkostningseffektiv metode til at fremstille aktive HLCs for ansøgning, der repræsenterer et vigtigt skridt fremad i feltet.
For at fremme menneskelig pluripotente stamceller og translationel medicin, xeno-fri systemer, overholder kræves gældende retningslinjer for god fremstillingspraksis. Nøglen til enhver differentiering proces er den ekstracellulære matrix (ECM). ECM ikke kun understøtter celle vedhæftet fil, men giver også adgang til vigtige signalsystemer faktorer, der påvirker celle beslutsomhed og fænotype 25, 26.
Lamininer er multifunktionelle ekstracellulære matrixproteiner in vivo. I leveren, laminin sekretion er afgørende for leverregenerering efter en partiel hepatektomi 27 og er nødvendig for hepatisk progenitorceller vedligeholdelse 28. Betydningen af lamininer i lever vedligeholdelse og regenerering var grundlaget for afprøvning af kommercielt tilgængelige rekombinante humane lamininer i vores hepatocyt differentiering system.
Superior hanpatocyte differentiering blev opnået på LN-521 og LN-521 / LN-111 substrater sammenlignet med Matrigel. Afledte HLCs var klart polariseret og organiseret i skålen, og deres cellulære funktion blev væsentligt forbedret i forhold til deres gelatinøse protein blanding modstykker. Bag disse forbedringer var nedreguleringen af kontaminerende colon-, fibroblast- og stamceller celleassocierede gener på de lamininer, samt et fald i celleproliferation og migration-associeret genekspression 10.
Afslutningsvis den her beskrevne protokol genererer hepatocyt-lignende celler, der er tættere i naturen til voksne humane hepatocytter. Processen er reproducerbar, modtagelig for automatisering, og kan være omkostningseffektivt skaleret til anvendelse. Vigtigere, er batch-til-batch variation blevet væsentligt reduceret i forhold til teknikker, der bruger Matrigel, hvilket resulterer i en forbedret differentiering for forskere inden for dette område. </p>
The authors have nothing to disclose.
Dette arbejde blev støttet med priser fra UK regenerativ medicin Platform (MRC MR / L022974 / 1 og MR / K026666 / 1) og en Kina Scholarship.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |