यहाँ प्रस्तुत विधि एक स्केलेबल और अच्छा विनिर्माण प्रैक्टिस (जीएमपी) -ready भेदभाव प्रणाली का वर्णन स्टेम कोशिकाओं से मानव hepatocyte तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए। यह बुनियादी और अनुप्रयुक्त अनुसंधान के लिए मानव यकृत मानव hepatocyte तरह कोशिकाओं को उत्पन्न करने के लिए एक लागत प्रभावी और मानकीकृत प्रणाली के रूप में कार्य करता है।
मानव स्टेम कोशिकाओं (hPSCs) जैव चिकित्सा अनुसंधान के लिए महान मूल्य के पास है। hPSCs पहुंचा और सभी प्रकार की कोशिकाओं से मानव शरीर में पाए जाने वाले के लिए भेदभाव किया जा सकता है। मानव hepatocyte कोशिकाओं की तरह (HLCS) को hPSCs के भेदभाव को बड़े पैमाने पर अध्ययन किया गया है, और कुशल भेदभाव प्रोटोकॉल स्थापित किया गया है। बाह्य मैट्रिक्स और वृद्धि कारकों, साइटोकिन्स, और छोटे अणुओं सहित जैविक उत्तेजनाओं, का संयोजन यह संभव HLCS कि प्राथमिक मानव hepatocytes सदृश उत्पन्न करने के लिए बनाया है। हालांकि, प्रक्रियाओं का बहुमत अभी भी अपरिभाषित घटकों को रोजगार, बैच को बैच बदलाव को जन्म दे रही है। इस प्रौद्योगिकी के अनुप्रयोग के लिए एक महत्वपूर्ण बाधा के रूप में कार्य करता है। इस मुद्दे से निपटने के लिए, हम एक सीरम मुक्त भेदभाव प्रक्रिया के साथ संयोजन में कोशिकी matrices के रूप में मानव पुनः संयोजक laminins का उपयोग कर hepatocyte भेदभाव के लिए एक परिभाषित प्रणाली विकसित की है। अत्यधिक कुशल hepatocyte विनिर्देश डी के साथ हासिल की थी,दोनों एचएलसी समारोह और phenotype में सुधार monstrated। महत्वपूर्ण बात है, इस प्रणाली के अनुसंधान और जीएमपी ग्रेड hPSC लाइनों सेल आधारित मॉडलिंग और उपचारों में होनहार अग्रिमों का उपयोग कर पैमाने पर करने के लिए आसान है।
प्राथमिक मानव ऊतक और व्युत्पन्न सेल प्रकार नियमित रूप से इस्तेमाल कर रहे हैं, दोनों सेल आधारित स्क्रीनिंग के लिए और क्लिनिक में। हालांकि, इन कोशिकाओं के लिए उपयोग गंभीर रूप से अपर्याप्त अंग दान और सेल phenotypes के बाद अलगाव 1 की कमी के कारण सीमित है। hPSCs प्राथमिक ऊतक के लिए एक आशाजनक विकल्प का प्रतिनिधित्व करते हैं और आनुवंशिक रूप से परिभाषित किया है और अक्षय मानव दैहिक कोशिकाओं की पीढ़ी की सुविधा। Hepatocyte कोशिकाओं की तरह (HLCS) hPSCs से निकाली गई पहले से ही इस क्षेत्र में वादा दिखाया है। HLCS विभिन्न पहलुओं के बारे में प्राथमिक मानव hepatocytes, सेल आकृति विज्ञान, hepatocyte जीन अभिव्यक्ति, चयापचय समारोह, और संवेदनशीलता दवाओं और वायरस 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 सहित जैसे लगते हैं। इसके अलावा, असीमित प्रसार औरदोनों शोध और जीएमपी ग्रेड hPSCs की आत्म नवीकरण क्षमता उनके आवेदन 9, 10 की सुविधा।
अनुसंधान के एक दशक के दौरान कुशल hepatocyte भेदभाव प्रक्रियाओं 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20 के एक नंबर का उत्पादन किया गया। हालांकि, इन प्रणालियों के सबसे अपरिभाषित घटकों और / या वायरल पारगमन का उपयोग हेपैटोसेलुलर विनिर्देश ड्राइव करने के लिए। बड़े पैमाने पर प्रौद्योगिकी की विश्वसनीयता में सुधार करने के लिए, यह एक मजबूत hepatocyte भेदभाव को विकसित करने के लिए महत्वपूर्ण हैप्रणाली है कि वास्तव में परिभाषित किया, Xeno मुक्त, और जीएमपी-संगत।
Laminins (LNS) महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन है कि कोशिका आसंजन, प्रसार, प्रवास, और भेदभाव को प्रभावित कर सकते हैं। Laminins heterotrimeric एक α, एक β, और एक γ श्रृंखला से बना ग्लाइकोप्रोटीन हैं। हाल ही में, पुनः संयोजक मानव laminins उत्पादन किया है और कोशिका जीव विज्ञान में इस्तेमाल किया गया है। LN-511, hPSCs 21 के रखरखाव का समर्थन करने के लिए दिखाया गया है, जबकि LN-521 और ई cadherin का एक मिश्रण प्रतिरूप व्युत्पत्ति और मानव भ्रूण स्टेम कोशिकाओं 22 के विस्तार की अनुमति देता है। LN-111, दूसरे हाथ पर, hPSCs 23 से निकाली गई hepatoblast कोशिकाओं की तरह के रखरखाव का समर्थन करता है। हालांकि, हमारी रिपोर्ट से पहले, 521 और 111 laminins hPSCs 10 से परिपक्व विशेषताओं के साथ HLCS उत्पन्न करने के लिए उपयोग नहीं किया गया था।
यहाँ, हम विस्तार LN-521 पर hPSCs संवर्धन के लिए प्रक्रियाओंऔर उन पर फर्क तो LN-521 या LN-521 और LN-111 (एल.एन.-521 / LN-111) का एक मिश्रण। हम एकल कोशिका बोने का उपयोग कर कई स्वरूपों में 14 HLCS की एक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य और समरूप monolayer उत्पन्न करने के लिए भेदभाव प्रोटोकॉल अनुकूलित। हम मानते हैं कि हमारे परिभाषित भेदभाव प्रणाली के क्षेत्र में एक महत्वपूर्ण कदम का प्रतिनिधित्व करने, आवेदन के लिए सक्रिय HLCS निर्माण करने के लिए एक सरल और लागत प्रभावी तरीका का प्रतिनिधित्व करता है।
मानव स्टेम सेल अनुसंधान और ट्रांसलेशनल मेडिसीन Xeno मुक्त प्रणाली है कि वर्तमान अच्छा विनिर्माण अभ्यास के दिशा-निर्देशों के लिए आवश्यक हैं के साथ पालन करने के लिए अग्रिम। किसी भी भेदभाव प्रक्रिया के लिए महत्वपूर्ण बाह्य मैट्रिक्स (ईसीएम) है। ईसीएम न केवल सेल लगाव का समर्थन करता है, लेकिन यह भी, कुंजी सिगनल कारकों तक पहुँच प्रदान करता सेल दृढ़ संकल्प और phenotype 25, 26 प्रभावित।
Laminins विवो में multifunctional बाह्य मैट्रिक्स प्रोटीन होते हैं। जिगर में, laminin स्राव एक आंशिक hepatectomy 27 के बाद जिगर के उत्थान के लिए महत्वपूर्ण है और यकृत पूर्वज सेल रखरखाव 28 के लिए आवश्यक है। जिगर के रखरखाव और उत्थान में laminins के महत्व को हमारे hepatocyte भेदभाव प्रणाली में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध पुनः संयोजक मानव laminins के परीक्षण के लिए आधार था।
सुपीरियर वहpatocyte भेदभाव LN-521 और एलएन-521 / LN-111 substrates पर हासिल की थी जब Matrigel की तुलना में। व्युत्पन्न HLCS स्पष्ट रूप से ध्रुवीकरण कर रहे थे और डिश में आयोजन किया है, और जब उनके पतला प्रोटीन मिश्रण समकक्षों की तुलना में उनके सेलुलर समारोह में काफी सुधार हुआ है। इन सुधारों के अंतर्निहित, colon- contaminating के डाउनरेगुलेशन था fibroblast- और laminins पर सेल जुड़े जीन, साथ ही सेल प्रसार और प्रवास से जुड़े जीन अभिव्यक्ति 10 में कमी स्टेम।
अंत में, यहां वर्णित प्रोटोकॉल hepatocyte कोशिकाओं की तरह है कि वयस्क मानव hepatocytes करने के लिए प्रकृति में करीब हैं उत्पन्न करता है। प्रक्रिया, प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य स्वचालन के लिए उत्तरदायी है, और लागत प्रभावी ढंग से आवेदन के लिए बढ़ाया जा सकता है। महत्वपूर्ण बात है, बैच को बैच के परिवर्तन में महत्वपूर्ण तकनीक है कि Matrigel उपयोग करते हैं, इस क्षेत्र में शोधकर्ताओं के लिए एक बेहतर भेदभाव प्रणाली में जिसके परिणामस्वरूप की तुलना में कम हो गया है। </p>
The authors have nothing to disclose.
इस काम के लिए ब्रिटेन पुनर्योजी चिकित्सा मंच से पुरस्कार (एमआरसी एमआर / L022974 / 1 और एमआर / K026666 / 1) और एक चीन छात्रवृत्ति के साथ समर्थन किया था।
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |