여기에 제시된 방법은 다 능성 줄기 세포로부터 인간 간세포 – 유사 세포를 생성하기 위해 확장 및 우수 제조 기준 (GMP) 레디 분화 시스템을 설명한다. 이것은 기초 및 응용 연구 인간 간 인간 간세포 – 유사 세포를 생성하기위한 비용 효과적이고 표준화 된 시스템으로서 작용한다.
인간 만능 줄기 세포 (hPSCs)는 생물 의학 연구에 큰 가치를 가지고있다. hPSCs는 스케일링과 인간의 몸에있는 모든 세포 유형으로 분화 될 수있다. 인간 간세포 – 유사 세포 (HLCs)에 hPSCs의 분화는 광범위하게 연구되었고, 효과적인 분화 프로토콜이 확립되었다. 세포 외 기질 및 성장 인자, 사이토 카인, 및 작은 분자를 포함한 생물학적 자극의 조합이 가능 차 인간 간세포를 닮아 HLCs를 생성하도록 만들었다. 그러나, 절차의 대부분은 여전히 뱃치 변화로 초래하는, 정의 구성 요소를 채용한다. 이 기술의 응용에 큰 장벽으로 작용한다. 이 문제를 해결하기 위해 무 혈청 분화 과정과 함께 외 기질 재조합 인간 라미닌을 이용한 간세포 분화에 대해 정의 된 시스템을 개발 하였다. 고효율 간세포 사양 드으로 이루어졌다HLC 기능과 표현형 모두 개선 monstrated. 중요한 것은,이 시스템은 연구 및 GMP 수준의 hPSC 라인을 셀 기반 모델링 및 치료에 유망한 발전을 사용하여 확장이 용이하다.
차 인체 조직 및 세포 유형 유도체 정기적 세포 기반 스크리닝 및 클리닉 모두 사용된다. 그러나, 이러한 세포에 대한 액세스 권한이 심각하게 부족으로 인해 장기 기증 및 사후 분리 한 세포 표현형의 손실로 제한됩니다. hPSCs 차 조직 유망한 대안을 나타내는 유전 정의 재생 인간 체세포의 생성을 촉진한다. hPSCs에서 유래 간세포와 같은 셀 (HLCs)는 이미이 분야에서 가능성을 보여 주었다. HLCs 약물 바이러스 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8 세포 형태, 간세포 유전자 발현, 대사 기능, 감도 등 다양한 측면에서 차 인간 간세포를 닮아. 또한, 무한 증식모두 Researcher 섹션 및 GMP 수준의 hPSCs의자가 재생 능력은 그들의 응용 프로그램 9, 10 용이하게한다.
연구 십년 효과적인 간세포 분화 절차 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20의 숫자를 제작했다. 그러나, 이러한 시스템은 대부분 간세포 사양을 정의 구동 요소 및 / 또는 바이러스 전달을 사용한다. 규모 기술의 신뢰성을 향상하기 위해서는 강력한 간세포 분화를 개발하는 것이 중요이종없는 진정한 정의 시스템 및 GMP 호환.
라미닌 (림프절)는 세포 부착, 증식, 이동 및 분화에 영향을 미칠 수있는 중요한 세포 외 기질 단백질이다. 라미닌은 α 한 번 β 및 γ 한 체인으로 이루어지는 이종삼 당 단백질이다. 최근에, 재조합 인간 라미닌 생산 및 세포 생물학에서 사용되어왔다. LN-521, E-cadherin의 혼합물이 유도 클론 인간 배아 줄기 세포 (22)의 팽창을 허용하면서 LN-511 hPSCs (21)의 유지를 지원하기 위해 보여왔다. LN-111, 반면에, hPSCs (23)로부터 유래 hepatoblast 유사 세포의 유지 보수를 지원한다. 그러나, 우리의 보고서 전에 521 라미닌 및 111 hPSCs 10에서 성숙 특성을 가진 HLCs를 생성하는 데 사용되지 않았다.
여기에, LN-521에 hPSCs을 배양 우리 세부 절차그리고 그들을 차별화 중 하나 LN-521 또는 LN-521 및 LN-111 (LN-521 / LN-111)의 조화. 우리는 많은 형식 14 HLCs의 높은 재현성과 균일 한 단일 층을 생성하는 단일 셀 시드를 사용하여 분화 프로토콜을 최적화. 우리는 우리의 정의 분화 시스템 분야에서 순방향 중요한 단계를 나타내는 어플리케이션 활성 HLCs를 제조하는 간단하고 비용 효율적인 방법을 나타낸다고 믿는다.
현재 좋은 제조 관행 가이드 라인이 필요 준수 인간 다 능성 줄기 세포 연구 및 병진 의학, 이종없는 시스템을 진행합니다. 임의의 분화 과정을 키는 세포 외 기질 (ECM)이다. 전자 재료뿐만 세포 부착을 지원뿐만 아니라, 세포의 결정 및 표현형 25, 26에 영향을 미치는 주요 신호 요소에 대한 액세스를 제공합니다.
라미닌 생체 다기능 세포 외 기질 단백질이다. 간에서, 라미닌 분비 부분 절제 후 27 일 간 재생에 중요한이며 간 전구 세포 유지 28에 요구한다. 간 유지 및 재생에 라미닌의 중요성은 우리 간세포 분화 시스템에서 시판되는 재조합 인간 라미닌을 테스트하기위한 기초이다.
페리 그마트 리겔에 비해 patocyte 차별화는 LN-521 및 LN-521 / LN-111 기판 상에 달성되었다. 파생 HLCs 명확 편광 및 접시 조직 및 젤라틴 단백질 혼합물 상대 비교할 때 그 세포 기능이 크게 향상되었다 하였다. 이러한 개선 밑바탕 fibroblast-, 결장 오염의 하향 조절했고 세포 연관된 라미닌의 유전자뿐만 아니라, 세포의 증식 및 이동과 연관된 유전자 발현 감소 10 줄기.
결론적으로, 여기에 설명 된 프로토콜은 성인 인간 간세포 본질적 가까운 간세포 – 유사 세포를 생성한다. 이 프로세스는 자동화, 재현 의무이며, 비용 효율적으로 응용 프로그램에 대한 확장 할 수 있습니다. 중요한 뱃치 변화가 현저이 필드 내 연구를위한 개선 된 시스템의 분화의 결과 마트 리겔을 사용 기술에 비해 감소되었다. </P>
The authors have nothing to disclose.
이 작품은 영국의 재생 의학 플랫폼에서 상 (MRC MR / L022974 / 1, MR / K026666 / 1) 중국 장학금으로 지원되었다.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |