Изложенный здесь метод описывает масштабируемой и надлежащей производственной практики (GMP) -Ready система дифференциации для создания человеческих гепатоцитов-подобных клеток из плюрипотентных стволовых клеток. Она служит в качестве экономически эффективной и стандартизированной системы для создания гепатоцитов-подобных клеток человека для фундаментальных и прикладных исследований печени человека.
Человеческие плюрипотентные стволовые клетки (hPSCs) обладают большое значение для медико-биологических исследований. hPSCs можно масштабировать и дифференцированными для всех типов клеток в человеческом организме. Дифференциация hPSCs до гепатоцитов-подобных клеток человека (HLCS) была тщательно изучена, и эффективные протоколы дифференцировки были установлены. Сочетание внеклеточного матрикса и биологических раздражителей, в том числе факторы роста, цитокины и малых молекул, которые позволили произвести HLCS, напоминающих первичные гепатоциты человека. Тем не менее, большинство процедур до сих пор используют неопределенные компоненты, что приводит к изменению от партии к партии. Это служит существенным барьером на пути применения технологии. Чтобы решить эту проблему, мы разработали определенную систему для дифференцировки гепатоцитов с использованием рекомбинантных ламинины человека в качестве внеклеточного матрикса в сочетании с процессом дифференциации без сыворотки. Высокоэффективный спецификация гепатоцитов была достигнута, с деmonstrated улучшения как HLC функции и фенотипа. Важно отметить, что эта система легко масштабируется с использованием научно-исследовательских и GMP-Grade HPSC линий перспективные достижения в области клеточной терапии и моделирования.
Первичная человеческих тканей, и производные типы клеток регулярно используются, как для клеток на основе скрининга и в клинике. Однако доступ к этим клеткам сильно ограничены из – за недостаточной донорства органов и потеря клеточных фенотипов после изоляции 1. hPSCs представляют собой многообещающую альтернативу для первичной ткани и облегчают создание генетически определенных и возобновляемых соматических клеток человека. Гепатоцитов-подобные клетки (HLCS), полученные из hPSCs уже показали обещание в этой области. Напоминают первичные КГ гепатоциты человека в различных аспектах, в том числе морфологии клеток, экспрессию генов гепатоцитов, метаболические функции, а также чувствительность к лекарствам и вирусов 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8. Кроме того, неограниченное распространение исамообновлению мощность обоих и GMP исследователями класса hPSCs облегчает их применение 9, 10.
В течение десяти лет исследований подготовил ряд процедур дифференцировки гепатоцитов эффективность 2, 3, 5, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20. Тем не менее, большинство из этих систем используют неопределенные компоненты и / или вирусной трансдукции для привода гепатоцеллюлярной спецификации. Для повышения надежности технологии в масштабе, важно разработать надежную дифференцировку гепатоцитовсистема, которая действительно определена, ксено-свободный, и GMP-совместимый.
Ламининами (LNS) являются важными белки внеклеточного матрикса, которые могут влиять на клеточную адгезию, пролиферацию, миграцию и дифференциацию. Ламининами являются гетеротримерные гликопротеины, состоящие из одного альфа, бета, один и один гамма цепи. В последнее время рекомбинантные человеческие ламинины были получены и использованы в клеточной биологии. LN-511 было показано , чтобы поддержать содержание hPSCs 21, в то время как смесь LN-521 и Е-кадгерина позволяет клонального деривация и расширение человеческих эмбриональных стволовых клеток 22. LN-111, с другой стороны, поддерживает содержание hepatoblast-подобных клеток , полученных из hPSCs 23. Тем не менее, до нашего доклада, ламининами 521 и 111 не были использованы для создания HLCS с созревшими характеристиками из hPSCs 10.
Здесь мы подробно процедуры для культивирования hPSCs на LN-521и дифференцировать их на либо LN-521 или смесь LN-521 и LN-111 (LN-521 / LN-111). Мы оптимизировали протокол дифференцировки с использованием одноклеточного высев для создания высоко воспроизводимую и однородный монослой во многих КГ форматов 14. Мы считаем, что наша определенная система дифференциации представляет собой простой и экономически эффективный метод для производства активных HLCS для применения, что представляет собой значительный шаг вперед в этой области.
Для продвижения исследований человеческого плюрипотентных стволовых клеток и трансляционной медицины, Xeno свободных систем, которые в соответствии с действующими хорошие принципы производства практики необходимы. Ключ к любому процессу дифференциации является внеклеточный матрикс (ECM). ECM не только поддерживает прикрепление клеток, но также обеспечивает доступ к ключевым факторам сигнализации, влияющие на определение клеток и фенотипа 25, 26.
Ламининами многофункциональные белки внеклеточного матрикса в естественных условиях. В печени, секрецию ламинин имеет решающее значение для регенерации печени после частичной гепатэктомии 27 и необходим для поддержания функции печени клеток – предшественников 28. Важность ламининами в поддержании печени и регенерации послужила основой для тестирования коммерчески доступных рекомбинантных человеческих ламинины в нашей системе дифференцировки гепатоцитов.
Улучшенный онpatocyte дифференциация была достигнута на LN-521 и LN-521 / LN-111 субстратов по сравнению с Матригель. Походные были четко КГ поляризованы и организованы в блюдо, а их клеточная функция была значительно улучшена по сравнению с их аналогами желатиновых смеси белков. В основе этих усовершенствований была понижающая регуляция загрязняя двоеточием, fibroblast- и стволовых клеток-ассоциированных генов на ламининами, а также уменьшение в пролиферации клеток и экспрессии генов миграции ассоциированных 10.
В заключение, протокол, описанный здесь, генерирует гепатоцитов-подобных клеток, которые ближе по своей природе для взрослых гепатоцитов человека. Процесс воспроизводима, поддается автоматизации, и может быть экономически эффективно масштабируется для применения. Важно отметить, что от партии к партии изменчивость значительно снизилась по сравнению с методами, которые используют Матригель, что приводит к улучшенной системе дифференцировки для исследователей в пределах этой области. </р>
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана награды от Великобритании регенеративной медицины платформы (MRC MR / L022974 / 1 и MR / K026666 / 1) и стипендия Китая.
Human Recombinant Laminin 521 | BioLamina | LN521-02 |
Human Recombinant Laminin 111 | BioLamina | LN111-02 |
Recombinant mouse Wnt3a | R&D Systems | 1324-WN-500/CF |
Human Activin A | Peprotech | 120-14E |
Human Hepatocyte Growth Factor | Peprotech | 100-39 |
Human Oncostatin M | Peprotech | 300-10 |
Rho-associated kinase (ROCK) inhibitor Y27632 | Sigma-Aldrich | Y0503-1MG |
Hydrocortisone 21-hemisuccinate sodium salt | Sigma-Aldrich | H4881 |
DMSO | Sigma-Aldrich | D5879 |
mTeSR1 medium | STEMCELL Technologies | 05850 |
RPMI 1640 | Life Technologies | 21875 |
Knockout DMEM | Life Technologies | 10829 |
HepatoZYME | Life Technologies | 17705 |
B27 supplement | Life Technologies | 12587-010 |
Knockout Serum Replacement | Life Technologies | 10828 |
GlutaMax | Life Technologies | 35050 |
Non-essential amino acids | Life Technologies | 11140 |
2-mercaptoethanol | Life Technologies | 31350 |
Accutase | Millipore | SCR005 |
DPBS with Calcium and Magnesium | ThermoFisher | 14040133 |