Live-celle bildebehandling er et kraftig verktøy for å visualisere dynamisk prosesser. Undersøkelse av fast celler inneholder bare statiske bilder, som kan føre til feiltolkning og forvirring om prosessen. Dette arbeidet gir en metode for å studere opptak, narkotika utgivelsen og intracellulær lokalisering av liposomal nanopartikler i levende celler.
Konvensjonelle Bildeteknikker kan gi detaljert informasjon om cellulære prosesser. Men denne informasjonen er basert på statiske bilder i en ellers dynamisk system, og etterfølgende produksjonsfaser er lett oversett eller misforstått. Live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi, der levende celler kan følges for timer eller dager i en mer eller mindre sammenhengende måte, er derfor meget informativ. Protokollen beskrevet her gir etterforskningen av skjebnen til chemotherapeutic nanopartikler etter levering av doksorubicin (dox) i levende celler. Dox er en intercalating agent som må bli løst fra sin nanocarrier å bli biologisk aktive. Til tross for sin kliniske registrering for mer enn to tiår, er sine opptak, sammenbrudd og narkotika utgivelsen fortsatt ikke fullt ut forstått. Denne artikkelen Utforsker hypotesen at lipid-baserte nanopartikler tas av kreftceller og sakte er degradert. Utgitt dox er deretter translocated til kjernen. For å hindre fiksering gjenstander, kan live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi, beskrevet i denne eksperimentelle prosedyren brukes.
Muligheten til å følge en biologisk prosess, for eksempel celle-celle interaksjoner, inter- og intracellulær transport, cytotoksiske sammensatte opptak og protein-protein samspill enkelt molekyler i levende celler og vev, har fått stor interesse siste tiår, som det gir den ekstra dimensjonen i “sanntid.” I dette manuskriptet er en metode å følge intracellulær skjebnen til gratis dox og dox i nanopartikler (Dox-NP) beskrevet.
Nanopartikler har blitt brukt i flere tiår til å behandle visse kreftformer. Dox-NP er godkjent for behandling av AIDS-relaterte Kaposis sarkom avansert eggstokkene og bryst kreft, og multippel myelom1. Det var en av de første liposomal nanopartikler utviklet og introdusert i klinisk setting. Den frie form, dox, tømmes langt fra blodsirkulasjonen, begrenser kapasiteten på svulst nettstedet i tilstrekkelige mengder. Videre er behandling ledsaget av alvorlige og dose begrensende bivirkninger, som stomatitt og hjertesvikt. Når innkapslet i pegylert liposomal nanopartikler øker sirkulasjon tiden fra minutter til dager2. Denne typen kolesterol inneholder liposome er ganske stabil og stabilitet bestemmer farmakokinetikken av innkapslede narkotika.
Dette stivhet har imidlertid en ulempe. Cytotoksiske evnen til et stoff mot kreftceller er første evaluert i vitro, og det har vist at dox er mer potent enn Dox-NP i cytotoksiske søk3,4. Var hypotesen at stabiliteten av transportøren hindrer utgivelsen og mobilnettet opptak av stoffet, og det er verdt å undersøke dette fenomenet ytterligere. De iboende liposomal egenskapene, bygget for aggressiv elementer i blodet og på svulst nettstedet intakt, resulterte i svekket biotilgjengeligheten av cytotoksiske komponenten (dvs. dox) på webområdet (dvs. svulst cellekjernen). Selv om Dox-NP hardily bedret svaret sammenlignet med den frie form, var det fortsatt av klinisk verdi, som innkapsling betydelig redusert cardiotoxic effekter5. I årene etter var andre forbindelser innkapslet i nano-bærere6. Også endre bærere resulterte i utløste narkotika utgivelsen (dvs. på svulst området) men opprettholdt stabilitet i blod sirkulasjon7,8. Til tross for år med etterforskning og klinisk bruk er intratumoral skjebnen til nanocarriers som Dox-NP fortsatt ikke helt klart. I en fersk publikasjon, ble det vist at hydrogenion er tatt opp som en helhet mens dox er fanget i lysosomer9.
Mobilnettet opptak av en hydrogenion og narkotika utgivelse er dynamisk prosesser som kan best bli overvåket med live-celle imaging. Videre klassisk histology, i hvilke celler er ruges og deretter fast, kan gi falske resultater hvis fiksering ødelegger liposomal bærer og introduserer gjenstander. Det viktigste kravet for live-celle imaging er visualisering, fortrinnsvis med fluorescens, av ønsket prosessen. Visse stoffer, som dox, har en iboende røde fluorescens. Også fluorescerende markører kan bli introdusert i transportøren, og cellen organeller kan visualiseres ved hjelp av live-celle markører. På denne måten kan en rekke parametre, som opptak av transportør, narkotika utgivelsen og mobilnettet lokalisering av operatør og narkotika, fotografert og analyseres. Her er en metode beskrevet som etterfølges intercellulære skjebnen til dox og Dox-NP i flere kreftceller i sanntid. Også denne metoden kan være enkelt tilpasses til å skape de ideelle forholdene for målrettet (f.eks belastet nanopartikler10) og utløst (f.eks hypertermi7) stoffet utgivelsen.
Som observert i siste, fiksering kan ødelegge liposomal nanocarriers nesten umiddelbart og DXR utgitt form disse ødelagt liposomer fortsatt hadde tid til å angi kjernen, gjør tolkningen av data svært vanskelig og selv misvisende. Med justeringer mikroskopiske kan chemotherapeutic skjebne i levende celler og vev bli rutinemessig undersøkt for å bekrefte eller styrte histologiske observasjoner. En fersk papir viste opptak, release, og lokalisering av DXR-cellene behandlet med gratis og innkapslet dox bruker live-celle time-lapse tenkelig9. Dette verket beskriver oppsettet av eksperimentelle nærmere. Bruker denne modellen, er det mulig å visualisere umiddelbar transport av dox til kjernen, hvor det kontinuerlig akkumuleres inntil cellen til slutt dør. I kontrast, når Dox-NP, finnes bare små mengder av utgitt dox i kjernen. Selv om kontinuerlig eksponering resulterer i kontinuerlig DXR buildup, fluorescerende signalet er mye lavere i Dox-NP-kontra dox-behandlet celler, som indikerer en forskjell i mobilnettet konsentrasjon og påfølgende cytotoksisitet. Videre bruker live-celle markører, ble det vist at når utsette cellene Dox-NP, DXR og nanocarrier ligger i lysosome. Dette angir at fullstendig liposome er tatt opp av cellen og demonstrerer involvering av en endocytic veien under opptaket av disse nanopartikler. DXR i kjernen er tydelig fra utgitt dox. Imidlertid er bruker denne metoden, som både DXR og bærer co lokalisere og synes å være fanget i lysosomer, det fortsatt usikker om dette er innkapslet eller utgitt dox. Det er mulig at indre stabilitet i hydrogenion hindrer dox utgivelsen når lokalisert i lysosome.
I denne protokollen, er live-celle imaging vist med en bestemt mikroskopiske oppsett, med en skreddersydd scenen holder (spesifikasjonene kan gis på forespørsel). Men tilbyr mest AC confocal mikroskop produserer en rekke inkubatorer som utfører live-celle bildebehandling. Bevare celle oppdrettsforholdene (dvs. temperatur, CO2, pH, fuktighet og sterilitet) er Hovedkriteriet for disse inkubatorer og krever noen foreløpige tester for å finne de riktige forholdene, som er nærmere forklart. Automatisert oppkjøpet programmer kan også leveres av samme produserer. En “Multi” alternativet gjør det mulig å image flere posisjoner i samme kammeret, raffinering statistisk analyse. Dette alternativet i makroen nevnt i dette manuskriptet krever imidlertid fast XYZ posisjoner, som muligheten til å korrigere Z-drift er tapt. Skanning Z-dimensjonen kan inkluderes i denne makroen og bruker fokus flyet for analyse. Dette krever imidlertid ekstra skanning, øker muligheten for phototoxicity og bleking.
Som med alle fluorescerende målinger, er overeksponering et problem, spesielt når man sammenligner to forbindelser med en annen mobilnettet opptak. Fluorescerende intensiteten er ikke bare avhengig på iboende signalet av sammensatt, men også på frekvensen av opptak, konsentrasjonen og narkotika eksponeringstid. Som vist i figur 3, er kjernefysiske DXR innholdet av dox-behandlet celler allerede synlige, mens noe signal er sett i Dox-NP-behandlet celler. Bare ved å øke gevinsten kan DXR i Dox-NP-behandlet celler visualiseres, fører til overeksponering i dox-behandlet celler. Dessuten, selv intracellulært Dox-NP heterogeneously distribueres, noe som kan resultere i uunngåelig under- eller overeksponering. Spesielt når undersøke mobilnettet DXR entrapment, redusert gevinst betydelig skille personlige organeller (tall 5B og 5 C). Dermed må målingene representert ved pikseltetthet ledsages av representant bildene for riktig tolkning av resultatene.
Phototoksisitet, bleking og en lav signal-til-støy-forhold er også viktige saker i fluorescerende mikroskopi, og et kompromiss mellom kvaliteten på bildet og det bilde må opprettes. Imidlertid selv når mikroskopet er optimal, avhenger bildekvaliteten også i stor grad av kvaliteten på cellene og ekstra sammensatte. DXR gir et kraftig signal og, med de riktige forholdsreglene, bleking ble ikke observert, selv etter lengre perioder (opptil 72 h). Imidlertid kan reduksjon av fluorescerende signalet også være et resultat av middelklasseinnbyggere. Middelklasseinnbyggere er et viktig fenomen i stoffet motstand15 og oppstår når cellene pumpe ut stoffet intracellulær området av handlingen. En nedgang på fluorescerende signalet over tid kan derfor også være et resultat av dox middelklasseinnbyggere9. Sammenligne fluorescerende signalet fra en ikke-skannet plassering på slutten av eksperimentet med det siste bildet fra time-lapse serien vil demonstrere bleking (dvs. signalet vil være høyere i den ikke-skannet plasseringen) eller middelklasseinnbyggere (dvs. begge signalene blir identiske). Flere kriminalomsorgen alternativer (f.eks bakgrunn, drift, bleking, etc.) er tilgjengelige i programmer som ImageJ16. Også som fluorescerende intensiteten øker over tid, kan konfigurasjonen innfatningene være pre evaluert i et pilotprosjekt å minimere overeksponering på slutten av det time-lapse (trinnet 3,21). Alternativt kan en tenkelig kammer med celler allerede utsatt for stoffet for den ønskede tidsperioden brukes til å initialisere innstillingene. Endelig for denne typen analyse, giftige stoffet konsentrasjoner (trinn 3,22) bør unngås og pre opprettet ved hjelp av konvensjonelle bio-analyser.
Celler er kontinuerlig kultivert og vedlikeholdes i medium uten fenol red. Fenol rødt fluoresces i den røde delen av spekteret og kan observeres i mobilnettet organeller, mest sannsynlig lysosomer, presentere falske positive informasjon (trinn 1.2). For å tillate overvåking av enkelte cellene, bør cellen samløpet ikke overstige 70% (trinn 3.1.). CO2 flyt-hastigheten (trinn 3,5) må reguleres en validering eksperiment når utstyret kjøpes eller vedlikehold. Når hastigheten er for høy, vil middels fordampe. Når hastigheten er for lav, øker pH i medium, som kan påvirke cellevekst. Mediet er uten fenol red pH indikator endringer i pH kan observeres og er derfor lett oversett. Når CO2 flyten er validert, brukes disse innstillingene i alle senere eksperimenter.
Med metoden beskrevet her kan skjebnen til nanopartikler lett undersøkes med live-celle bildebehandling og time-lapse mikroskopi. I denne fremgangsmåten ble kommersielt tilgjengelig nanopartikler brukt. Men skjebnen til thermosensitive17, kationisk liposomer10; liposomer beriket med kort-kjeden shingolipids18; og nanopartikler innkapsle andre rusmidler8,19 ble også undersøkt på denne måten i svulsten og normale celler.
The authors have nothing to disclose.
Mikroskopi fasilitetene brukes er en del av Erasmus optisk Imaging Center, og vi ønsker å takke ansatte på OIC for sine tjenester.
DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
Petri dish | Greiner | 664160 | |
Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |