Formazione immagine della vivere-cella è un potente strumento per la visualizzazione di processi dinamici. L’esame delle cellule fisse fornisce solo immagini statiche, che possono portare a interpretazioni erronee e confusione circa il processo. Questo lavoro presenta un metodo per studiare l’assorbimento, rilascio di farmaci e localizzazione intracellulare di nanoparticelle liposomiale in cellule viventi.
Tecniche di imaging convenzionale possono fornire informazioni dettagliate sui processi cellulari. Tuttavia, queste informazioni sono basate su immagini statiche in un sistema altrimenti dinamico e fasi successive sono facilmente trascurate o male interpretate. Imaging di cellule vive e microscopia time-lapse, in cui le cellule viventi possono essere seguite per ore o persino giorni in maniera più o meno continua, pertanto sono molto ben informativi. Il protocollo qui descritto consente l’indagine del destino delle nanoparticelle chemioterapeutici dopo la consegna della doxorubicina (dox) in cellule viventi. DOX è un agente intercalante che deve essere liberato dalla sua nanocarrier diventare biologicamente attivi. Nonostante la registrazione clinica per più di due decenni, sua l’assorbimento, la ripartizione e il rilascio di farmaci ancora completamente non sono capiti. Questo articolo esplora l’ipotesi che le nanoparticelle basata sui lipidi sono presi dalle cellule del tumore e sono lentamente degradate. Rilasciato dox è quindi trasloca nel nucleo. Per evitare artefatti di fissazione, formazione immagine della vivere-cella e microscopia time-lapse, descritto in questa procedura sperimentale, possono essere applicati.
La capacità di seguire un processo biologico, quali le interazioni cellula-cellula, inter- e trasporto intracellulare, l’assorbimento di composto citotossico e interazione proteina-proteina di singole molecole in cellule viventi e tessuti, ha guadagnato grande interesse negli ultimi decennio, poiché fornisce la dimensione del “tempo reale”. In questo manoscritto, è descritto un metodo per seguire il destino intracellulare di dox gratis e dox incorporato in nanoparticelle (Dox-NP).
Le nanoparticelle sono state utilizzate per decenni per il trattamento di alcuni tumori. DOX-NP è stato approvato per il trattamento del sarcoma di Kaposi correlato all’AIDS, avanzata ovarico e tumore al seno e mieloma multiplo1. È stato uno dei prime nanoparticelle liposomiale sviluppato e introdotto nella regolazione clinica. La forma libera, dox, viene cancellata enormemente la circolazione del sangue, limitando la sua capacità di raggiungere il sito di tumore in quantità sufficiente. Inoltre, il trattamento è accompagnata da effetti collaterali gravi e dose-limitanti, come stomatite e insufficienza cardiaca. Quando incapsulato in nanoparticelle liposomiale pegilata aumenta il tempo di circolazione da minuti a giorni2. Questo tipo di colesterolo-contenere liposoma è abbastanza stabile e questa stabilità determina la farmacocinetica del farmaco incapsulato.
Tuttavia, questa rigidità ha un lato negativo. La capacità citotossica di un composto verso le cellule del tumore è prima valutato in vitro, ed è stato dimostrato che dox è più potente di Dox-NP in citotossici dosaggi3,4. È stato supposto che la stabilità del vettore previene il rilascio e l’assorbimento cellulare del farmaco, e vale la pena di indagare ulteriormente questo fenomeno. Le proprietà intrinseche liposomiale, costruite per durare gli elementi aggressivi nel flusso sanguigno e raggiungere il luogo del tumore intatto, ha provocato la biodisponibilità alterata del componente citotossico (cioè, dox) presso il sito di destinazione (cioè, il tumore nucleo cellulare). Anche se Dox-NP arditamente migliorato la risposta rispetto a forma libera, era ancora di valore clinico, come incapsulamento ha ridotto significativamente gli effetti cardiotossici5. Negli anni successivi, altri composti sono stati incapsulati in nano-vettori6. Inoltre, modificando gli elementi portanti ha provocato il rilascio di farmaci innescata (cioè, al luogo del tumore), ma mantenuto la stabilità nel sangue circolazione7,8. Nonostante anni di indagine ed uso clinico, i destini di intratumoral di nanovettori come Dox-NP non sono ancora del tutto chiaro. In una recente pubblicazione, è stato dimostrato che le nanoparticelle sono preso nel suo complesso mentre il dox rimane intrappolato nei lisosomi9.
L’assorbimento cellulare di un rilascio di nanoparticelle e droga sono processi dinamici che meglio possono essere monitorati usando la formazione immagine di cellule vive. Inoltre, l’istologia classica, in cui le cellule vengono incubate e successivamente fissato, può dare risultati falsi se la fissazione distrugge il carrier liposomiale e introduce artefatti. Il requisito principale per l’imaging di vivere-cella è visualizzazione, preferibilmente mediante fluorescenza, del processo desiderato. Alcuni composti, come dox, hanno un’intrinseca fluorescenza rossa. Inoltre, marcatori fluorescenti possono essere introdotti nel vettore e organelli delle cellule possono essere visualizzati utilizzando marcatori di cellule vive. In questo modo, una matrice di parametri, come l’assorbimento del vettore, rilascio di farmaci e localizzazione cellulare di droga e il vettore può essere imaged e analizzata. Qui, un metodo è descritto in cui il destino intercellulare di dox e Dox-NP in diverse cellule del tumore è seguito in tempo reale. Inoltre, questo metodo può essere facilmente adattato per creare le condizioni ideali per mirati (ad esempio, le nanoparticelle10a carico) e attivato (ad es., ipertermia7) rilascio di farmaci.
Come osservato in passato, la fissazione può distruggere liposomiale nanovettori quasi immediatamente e DXR rilasciato forma questi liposomi distrutti ancora avevano il tempo di entrare nel nucleo, rendendo l’interpretazione dei dati molto difficile e addirittura fuorvianti. Con alcuni aggiustamenti al microscopio, il destino di chemioterapico in cellule viventi e tessuti possa essere investigato ordinariamente per confermare o rovesciare le osservazioni istologiche. Una carta recente ha mostrato l’assorbimento, il rilascio e la localizzazione di DXR in cellule trattate con dox gratis e incapsulato utilizzando cellule vive time-lapse imaging9. Questo lavoro descrive la messa a punto sperimentale più dettagliatamente. Utilizzando questo modello, è possibile visualizzare il trasporto immediato di dox al nucleo, dove si accumula continuamente fino a quando la cellula muore alla fine. Al contrario, quando viene utilizzato Dox-NP, solo piccole quantità di dox rilasciato si trovano nel nucleo. Anche se l’esposizione continua risultati in continuo accumulo di DXR, il segnale fluorescente è molto inferiore nel Dox-NP-contro cellule trattate con dox, che indica una differenza nella concentrazione cellulare e citotossicità successive. Inoltre, utilizzando marcatori di cellule vive, è stato dimostrato che, quando esponendo le cellule a Dox-NP, DXR e il nanocarrier si trovano nel lisosoma. Questo indica che il liposoma completa è preso dalla cella e dimostra il coinvolgimento di un pathway endocitico durante l’assorbimento di queste nanoparticelle. Il DXR nel nucleo è chiaramente da dox rilasciato. Tuttavia, utilizzando questo metodo, come vettore sia il DXR co-localizzano e sembrano essere intrappolate nei lisosomi, è ancora inconcludenti se questo è incapsulato o rilasciato dox. È possibile che la stabilità intrinseca della nanoparticella impedisce il rilascio di dox quando localizzata nel lisosoma.
In questo protocollo, formazione immagine della vivere-cella è dimostrata utilizzando una configurazione specifica al microscopio, con un supporto su misura fase (le specifiche possono essere dato su richiesta). Tuttavia, più manufatti di microscopio confocale offrono una gamma di incubatrici che eseguire imaging di cellule vive. Preservare le condizioni di coltura delle cellule (cioè, temperatura, CO2, pH, umidità e sterilità) è il criterio principale di questi incubatori e richiede alcune prove preliminari per determinare le condizioni adeguate, che è stato approfondito. Programmi di acquisizione automatica dei dati possono anche essere consegnati dalla fabbrica stessa. Un’opzione “Multi posizione” rende possibile all’immagine diverse posizioni nella stessa camera, analisi statistica di raffinazione. Tuttavia, questa opzione nella macro citata in questo manoscritto richiede posizioni fisse di XYZ, da cui si perde la possibilità di correggere per Z-drift. La Z-dimensione di scansione possono essere inclusi in questa macro e usi un fuoco aereo per l’analisi. Tuttavia, questo richiede analisi supplementare, aumentando la possibilità di fototossicità e candeggio.
Come con tutte le misurazioni fluorescente, la sovraesposizione è un problema, soprattutto quando si confrontano due composti con un diverso assorbimento cellulare. L’intensità di fluorescenza non è solo dipendente il segnale intrinseco del composto, ma anche il tasso di assorbimento, la concentrazione e il tempo di esposizione della droga. Come mostrato nella figura 3, il contenuto DXR nucleare di cellule trattate con dox è già visibile, mentre nessun segnale è veduto in cellule Dox-NP-trattate. Solo aumentando il guadagno il DXR in cellule Dox-NP-trattate sono visualizzabili, che conduce alla sovraesposizione in cellule trattate con dox. Inoltre, anche intracellulare, Dox-NP è eterogeneo, che può provocare inevitabile sotto- o sovraesposizione. Soprattutto quando si esamina l’allettamento DXR cellulare, il guadagno è stato ridotto significativamente per distinguere singoli organelli (figure 5B e 5C). Così, le misurazioni rappresentate dalla densità di pixel devono essere corredate di immagini rappresentative per la corretta interpretazione dei risultati.
Fototossicità, sbianca e un rapporto segnale-rumore basso sono anche questioni importanti in microscopia fluorescente, e deve essere stabilito un compromesso tra la qualità dell’immagine e l’acquisizione dell’immagine. Tuttavia, anche quando il programma di installazione di microscopio è ottima, la qualità dell’immagine anche in gran parte è determinata dalla qualità delle cellule e il composto aggiunto. DXR dà un segnale forte e, con le dovute precauzioni, lo sbiancamento non è stato osservato, anche dopo periodi più lunghi (fino a 72 h). Tuttavia, la riduzione del segnale fluorescente può anche essere un risultato di efflusso. Efflusso è un fenomeno importante nella droga resistenza15 e si verifica quando le cellule pompano fuori il farmaco dal sito intracellulare dell’azione. Una diminuzione del segnale fluorescente nel tempo quindi può anche essere un risultato di dox efflusso9. Confrontando il segnale fluorescente di una posizione non analizzati alla fine dell’esperimento con l’ultima immagine della serie time-lapse dimostrerà candeggio (cioè, il segnale sarà più alto in una posizione non analizzati) o efflusso (cioè, entrambi i segnali saranno identici). Sono disponibili in programmi come ImageJ16diverse opzioni correttive (ad es., sfondo, drift, candeggio, ecc.). Inoltre, come l’intensità di fluorescenza aumenta nel tempo, le impostazioni di configurazione possono essere pre-valutate in un esperimento pilota per ridurre la sovraesposizione alla fine del time-lapse (passo 3,21). In alternativa, una camera di imaging con cellule già esposti alla droga per il periodo di tempo desiderato può essere utilizzata per inizializzare le impostazioni. Infine, per questo tipo di analisi, concentrazioni di droga tossica (passo 3,22) dovrebbero essere evitate e prestabiliti utilizzando bio-dosaggi convenzionali.
Le cellule sono continuamente coltivate e mantenute in medium senza rosso fenolo. Rosso fenolo reagisce in parte rossa dello spettro e può essere osservata in organelli cellulari, probabilmente lysosomes, presentando informazioni falsi positivi (punto 1.2). Per consentire il monitoraggio delle singole celle, confluenza di cella non deve superare il 70% (punto 3.1.). La CO2 flusso-velocità (passo 3.5) deve essere regolata in un esperimento di convalida quando si è acquistato l’apparecchio o dopo la manutenzione. Quando la velocità è troppo alta, medio evaporerà. Quando la velocità è troppo bassa, il pH del terreno aumenta, che può influenzare la crescita delle cellule. Come il mezzo è senza le modifiche di indicatore di pH rosso fenolo pH non possono essere osservate e pertanto sono facilmente trascurate. Una volta convalidato il flusso di CO2 , queste impostazioni possono essere utilizzate in tutti gli esperimenti futuri.
Utilizzando il metodo descritto qui, il destino delle nanoparticelle possa facilmente essere studiato usando la formazione immagine della vivere-cella e microscopia time-lapse. In questa procedura, sono state utilizzate commercialmente disponibili nanoparticelle. Tuttavia, il destino di termosensibile17, liposomi cationici10; liposomi arricchiti con catena corta shingolipids18; e nanoparticelle incapsulare altre droghe8,19 inoltre sono stati studiati in questo modo in cellule normali e tumorali.
The authors have nothing to disclose.
Le strutture di microscopia utilizzate sono parte del centro di Imaging ottico di Erasmus, e vorremmo ringraziare il personale dell’OIC per i loro servizi.
DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
Petri dish | Greiner | 664160 | |
Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |