Live-celle imaging er et kraftfuldt værktøj til at visualisere dynamiske processer. Undersøgelse af faste celler giver kun statiske billeder, som kan føre til fejlfortolkninger og forvirring om processen. Dette arbejde præsenterer en metode til at studere optagelse, drug frigivelse og intracellulære lokalisering af liposomal nanopartikler i levende celler.
Konventionelle Billeddannende teknikker kan give detaljerede oplysninger om cellulære processer. Men disse oplysninger er baseret på statiske billeder i en ellers dynamisk system, og successive faser er let overset eller misforstået. Live-celle imaging og time-lapse mikroskopi, hvor levende celler kan følges timer eller endda dage i en mere eller mindre konstant mode, er derfor meget informativ. Protokollen beskrevet her giver mulighed for undersøgelse af kemoterapeutiske nanopartikler skæbne efter leveringen af doxorubicin (dox) i levende celler. DOX er en intercalating agent, der skal frigives fra sin nanocarrier bliver biologisk aktive. Trods sin kliniske registrering for mere end to årtier, er dets optagelse, fordeling og stof frigivelse stadig ikke fuldt forstået. Denne artikel undersøger den hypotese, at lipid-baserede nanopartikler er taget op af tumorcellerne og er langsomt nedbrydes. Frigivne dox er derefter omplantes til kernen. For at forhindre fiksering artefakter, kan live-celle imaging og time-lapse mikroskopi, beskrevet i denne eksperimentelle procedure, anvendes.
Evnen til at følge en biologisk proces, såsom celle-celle interaktioner, inter- og intracellulære transport, cytotoksiske sammensatte optagelse og protein-protein interaktion mellem enkelt molekyler i levende celler og væv, har vundet stor interesse i seneste årti, da det giver den ekstra dimension i “realtid.” I dette manuskript er en metode til at følge gratis dox og dox indarbejdet i nanopartikler (Dox-NP) intracellulære skæbne beskrevet.
Nanopartikler har været anvendt i årtier til behandling af visse kræftformer. DOX-NP er blevet godkendt til behandling af AIDS-relaterede Kaposis sarkom, avanceret æggestokkene og bryst kræft og myelomatose1. Det var en af de første liposomal nanopartikler udviklet og introduceret i de kliniske omgivelser. Fri form, dox, ryddes langt fra blodcirkulationen, begrænse dens evne til at nå tumor sitet i tilstrækkelige mængder. Desuden er behandling ledsaget af alvorlige og begrænsning af dosis side-effekter, såsom stomatitis og hjertesvigt. Når indkapslet i pegyleret liposomal nanopartikler øger omsætning tid fra minutter til dage2. Denne type af kolesterol-holdige Liposom er ganske stabil og denne stabilitet bestemmer farmakokinetik af indkapslede stof.
Denne stivhed har imidlertid en bagside. Cytotoksiske evnen af et sammensat mod tumorceller er første evalueres i in vitro, og det har vist sig at dox er mere potent end Dox-NP i cytotoksiske undersøgelser,3,4. Det var den hypotese, at stabiliteten af luftfartsselskabet forhindrer frigivelse og cellulære optagelse af stoffet, og det er værd at undersøge fænomenet yderligere. De iboende liposomal egenskaber, bygget til at vare de aggressive elementer i blodet og at nå tumor site intakt, resulterede i nedsat biotilgængeligheden af komponenten cytotoksisk (dvs., dox) på mål-webstedet (dvs. tumor cellekerne). Selv om Dox-NP blev hardily forbedret reaktion i forhold til fri form, var det stadig af klinisk værdi, som indkapsling betydeligt reduceret kardiotoksiske virkning5. I de følgende år, blev andre forbindelser indkapslet i nano-luftfartsselskaber6. Også, redigering medbringerne resulterede i udløste drug release (dvs. ved tumor site) men opretholdt stabilitet i blod omløb7,8. Trods års undersøgelse og klinisk brug er intratumoral skæbner af nanocarriers som Dox-NP stadig ikke helt klart. I en nylig publikation, blev det vist, at en nanopartikel taget som helhed, mens dox er stadig fanget i lysosomer9.
Cellulære optagelse af en nanopartikel og narkotika udgivelse er dynamiske processer, der kan bedst overvåges ved hjælp af live-celle billeddannelse. Desuden klassisk histologi, i hvilke celler er udruget og herefter fast, kan give falsk resultater hvis fiksering ødelægger liposomal transportøren og introducerer artefakter. Det vigtigste krav for live-celle imaging er visualisering, fortrinsvis af fluorescens, den ønskede proces. Visse forbindelser, som dox, har en iboende røde fluorescens. Også, fluorescerende markører kan indføres i flyselskabet, og celle organeller kan visualiseres ved hjælp af live-celle markører. På denne måde, kan en række parametre, som optagelsen af transportøren, drug frigivelse og cellulære lokalisering af transportøren og narkotika, afbildet og analyseret. Her, er en metode beskrevet hvor dox og Dox-NP i flere tumorceller intercellulære skæbne er fulgt i realtid. Denne metode kan også være let tilpasses til at skabe de ideelle betingelser for målrettet (f.eks. opkrævet nanopartikler10) og udløst (fx hypertermi7) stof frigivelse.
Som bemærket tidligere, fiksering kan ødelægge liposomal nanocarriers næsten øjeblikkeligt og DXR udgivet form disse ødelagte Liposomer stadig havde tid til at indtaste kernen, at gøre fortolkningen af data meget vanskeligt og endda vildledende. Med nogle mikroskopiske justeringer, kan den kemoterapeutiske skæbne i levende celler og væv undersøges rutinemæssigt for at bekræfte eller vælte histologiske observationer. Et nyligt papir viste optagelse, udgivelse og lokalisering af DXR i celler behandles med frie og indkapslede dox ved hjælp af live-celle time-lapse imaging9. Den eksperimentelle opsætningen nærmere beskrives dette arbejde. Med denne model, er det muligt at visualisere den umiddelbare transport af dox til kernen, hvor det løbende ophobes indtil cellen dør til sidst. Derimod når Dox-NP er brugt, er kun små mængder af frigivne dox fundet i kernen. Selv om kontinuerlig eksponering resulterer i løbende DXR oprustning, den fluorescerende signal er meget lavere i Dox-NP-versus dox-behandlede celler, der angiver en forskel i cellulære koncentration og efterfølgende cytotoksicitet. Desuden ved hjælp af live-celle markører, var det vist, at når udsætter celler til Dox-NP, DXR og nanocarrier er placeret i lysosomet. Dette angiver, at den komplette Liposom er taget op af cellen og demonstrerer inddragelse af en endocytic pathway under optagelsen af disse nanopartikler. DXR i kernen er klart fra frigivne dox. Men ved hjælp af denne metode, som både DXR og transportør Co lokalisere og synes at være fanget i lysosomer, det er stadig usikkert om det er indkapslet eller udgivet dox. Det er muligt, at den iboende stabilitet af nanopartikel forhindrer dox release når lokaliseret i lysosomet.
I denne protokol demonstreres live-celle imaging ved hjælp af en specifik mikroskopiske opsætning, med en specialfremstillet fase indehaveren (specifikationerne kan gives på anmodning). Dog tilbyder mest Konfokal mikroskop fremstiller en vifte af væksthuse, der udfører live-celle billeddannelse. Bevare celle kultur betingelser (dvs., temperatur, CO2, pH, fugtighed og sterilitet) er det vigtigste kriterium for disse væksthuse og kræver nogle indledende test for at fastlægge de rette betingelser, som er yderligere forklaret. Automatiseret data erhvervelse programmer kan også leveres af de samme fremstiller. En “Multi placering” valgmulighed gør det muligt at billedet flere positioner i den samme afdeling, raffinering statistisk analyse. Denne indstilling i den makro, der er nævnt i dette manuskript kræver imidlertid fast XYZ holdninger, hvorved muligheden for at korrigere for Z-drift er tabt. Scanning Z-dimension kan medtages i denne makro og bruger en fokus flyet til analyse. Det kræver dog ekstra scanning, hvilket øger muligheden for fototoksicitet og blegning.
Som med alle fluorescerende målinger, er overeksponering et problem, især når man sammenligner to forbindelser med en forskellige cellulære optagelse. Den fluorescerende intensitet er ikke kun afhængige af den iboende signal af sammensat, men også efter satsen for udbredelse, koncentration og stof eksponeringstid. Som vist i figur 3, er nukleare DXR indholdet af dox-behandlede celler allerede synlige, mens intet signal er set i Dox-NP-behandlede celler. Kun ved at øge gevinsten kan DXR i Dox-NP-behandlede celler visualiseres, fører til overeksponering i dox-behandlede celler. Desuden selv intracellulært Dox-NP er uensartet fordelt, hvilket kan resultere i uundgåelige under- eller overeksponering. Især når at undersøge de cellulære DXR fastklemning, blev gevinsten reduceret betydeligt for at skelne mellem enkelte organeller (tal 5B og 5 C). Således skal målingerne repræsenteret ved pixeltæthed ledsages af de repræsentative billeder til den rette fortolkning af resultaterne.
Fototoksicitet, blegning og et lavt signal / støj-forhold er også vigtige spørgsmål i fluorescerende mikroskopi, og et kompromis mellem seriøs i billedet og image erhvervelse skal fastsættes. Selv når opsætningen mikroskop er optimal, er billedkvaliteten dog også i vid udstrækning bestemt af kvaliteten af cellerne og det ekstra stof. DXR giver et stærkt signal, og med de rette forholdsregler, blegning blev ikke observeret, selv efter længere perioder (op til 72 timer). Reduktion af de fluorescerende signal kan dog også være et resultat af efflux. Efflux er et vigtigt fænomen i drug resistance15 og opstår, når celler pumpe ud stof fra den intracellulære site af handling. Et fald på fluorescerende signalet over tid kan derfor også være et resultat af dox efflux9. Sammenligne det fluorescerende signal om en ikke-scannede placering i slutningen af forsøget med det sidste billede fra time-lapse serien vil demonstrere blegning (dvs. signalet vil være højere i de ikke-scannede placering) eller efflux (dvs. både signaler vil være identiske). Flere correctional indstillinger (f.eks. baggrund, drift, blegning, etc.) er tilgængelige i programmer som ImageJ16. Også, som fluorescerende intensiteten stiger over tid, konfigurationsindstillingerne kan være pre evalueres i en pilot eksperiment at minimere overeksponering for enden af den time-lapse (trin 3,21). Alternativt, en billeddannelse kammer med celler allerede udsat for stoffet i den ønskede tidsperiode kan bruges til at initialisere indstillingerne. Endelig, for denne form for analyse, giftige stof koncentrationer (trin 3.22) bør undgås og fastlagt på forhånd ved hjælp af konventionelle bio-assays.
Celler er løbende kulturperler og vedligeholdes i medium uden phenol rød. Phenol rød fluorescerer i den røde del af spektret og kan observeres i cellulære organeller, mest sandsynligt lysosomer, præsentation af falsk-positive oplysninger (trin 1.2). For at muliggøre overvågning af individuelle celler, bør celle sammenløbet ikke overstige 70% (trin 3.1.). CO2 flow-hastighed (trin 3.5) skal reguleres i en validering eksperiment når udstyret er købt eller efter vedligeholdelse. Når hastigheden er for høj, vil medium fordampe. Når hastigheden er for lav, vil medium pH stige, som kan påvirke cellevækst. Som mediet uden er phenol rød pH indikator ændringer i pH ikke kan iagttages og er derfor let overset. CO2 flow er blevet godkendt, kan disse indstillinger bruges i alle fremtidige eksperimenter.
Ved hjælp af metoden beskrevet her, kan skæbne af nanopartikler nemt undersøges ved hjælp af live-celle imaging og time-lapse mikroskopi. I denne procedure brugt kommercielt tilgængelige nanopartikler. Men skæbnen, thermosensitive17, kationiske Liposomer10; Liposomer beriget med kortkædede shingolipids18; og nanopartikler indkapsling af andre narkotika,8,19 blev også undersøgt på denne måde i tumor og normale celler.
The authors have nothing to disclose.
Mikroskopi faciliteter bruges er en del af Erasmus-optisk Imaging Center, og vi vil gerne takke personalet OIC for deres tjenester.
DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
Petri dish | Greiner | 664160 | |
Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |