Live-cell bildbehandling är ett kraftfullt verktyg för att visualisera dynamiska processer. Undersökningen av fasta celler ger bara statiska bilder, vilket kan leda till feltolkningar och förvirring om processen. Detta arbete presenterar en metod för att studera upptag, läkemedelsfrisättning och intracellulära lokalisering av liposomalt nanopartiklar i levande celler.
Konventionella avbildningstekniker kan ge detaljerad information om cellulära processer. Dock denna information bygger på statiska bilder i ett annars dynamiska system och successiva faser är enkelt glöms bort eller misstolkas. Live-cell imaging och time-lapse mikroskopi, där levande celler kan följas för timmar eller dagar i en mer eller mindre kontinuerlig mode, är därför mycket informativ. Protokollet beskrivs här tillåter för utredning av kemoterapeutiska nanopartiklar öde efter leverans av doxorubicin (dox) i levande celler. DOX är ett intercalating medel som måste släppas ut från dess nanocarrier att bli biologiskt aktiva. Trots dess kliniska registrering för mer än två decennier, är dess upptag, nedbrytning och läkemedelsfrisättning fortfarande inte helt klarlagt. Denna artikel utforskar hypotesen att lipid-baserade nanopartiklar tas upp av tumörcellerna och har långsamt försämrats. Släppta dox är sedan flyttad till kärnan. För att förhindra fixering artefakter, kan live-cell imaging och time-lapse mikroskopi, beskrivs här experimentella, tillämpas.
Förmågan att följa en biologisk process, såsom cell-cell interaktioner, inter- och intracellulära transport, cytotoxiska sammansatta upptag och protein-protein interaktioner av enstaka molekyler i levande celler och vävnader, har fått stort intresse under senaste decenniet, eftersom det ger en extra dimension av ”realtid”. I detta manuskript beskrivs en metod för att följa intracellulära öde gratis dox och dox införlivas i nanopartiklar (Dox-NP).
Nanopartiklar har använts i decennier för att behandla vissa cancerformer. DOX-NP har godkänts för behandling av AIDS-relaterat Kaposis sarkom, avancerade cystor och bröstcancer, och multipelt myelom1. Det var en av de första liposomalt nanopartiklar utvecklades och infördes i den kliniska inställningen. Fri form, dox, rensas kraftigt från blodcirkulationen, begränsar dess förmåga att nå webbplatsen tumören i tillräckliga mängder. Dessutom åtföljs behandling av svår och dosbegränsande biverkningar, såsom stomatit och hjärtsvikt. När inkapslade i pegylerat liposomalt nanopartiklar ökar cirkulationen tiden från minuter till dagar2. Denna typ av kolesterol-innehållande Liposom är ganska stabil och denna stabilitet avgör farmakokinetiken för inkapslade drogen.
Denna styvhet har dock en baksida. En förening mot tumörceller cytotoxiska förmåga är första utvärderades in vitro-och det har visats att dox är mer potent än Dox-NP i cytotoxiska analyser3,4. Det antogs att bäraren stabilitet förhindrar frisläppande och cellernas upptag av läkemedlet, och det är värt att undersöka fenomenet ytterligare. Liposomalt egenskaper, byggt att hålla aggressiva elementen i blodet och att nå webbplatsen tumören intakt, resulterade i försämrad biotillgängligheten av cytotoxiska komponenten (dvs dox) på målwebbplatsen (dvs tumören cellkärnan). Även Dox-NP förbättrades hardily svar jämfört med fri form, var det fortfarande av kliniskt värde, eftersom inkapsling reducerade signifikant den kardiotoxiska effekter5. Under de följande åren, var andra föreningar inkapslad i nano-bärare6. Även ändra bärarna medförde utlöst läkemedelsfrisättning (dvs. på webbplatsen tumören) men underhålls stabilitet i blodcirkulationen7,8. Trots år av utredning och klinisk användning är nanocarriers som Dox-NP intratumoral öden fortfarande inte helt klart. I en senaste publikation visades det att nanopartikelportföljen tas upp som helhet medan dox förblir instängda i lysosomer9.
Cellernas upptag av en nanopartikel och drog release är dynamiska processer som bäst kan övervakas med hjälp av live-cell imaging. Övrigt klassiskt histologi, där celler inkuberas och därefter fast, kan ge falska resultat om fixering förstör liposomalt transportören och introducerar artefakter. Det viktigaste kravet för live-cell imaging är visualisering, helst genom fluorescens, av önskad processen. Vissa föreningar, liksom dox, har en inneboende röd fluorescens. Även fluorescerande markörer kan införas i flygbolaget och cell organeller kan visualiseras med hjälp av live-cells markörer. På detta sätt kan en rad parametrar, såsom upptag av transportören, läkemedelsfrisättning och cellulär lokalisering av transportören och drog, avbildas och analyseras. Här beskrivs en metod där intercellulära öde dox och Dox-NP i flera tumörceller följs i realtid. Denna metod kan också enkelt anpassas att skapa idealiska förutsättningar för riktade (t.ex. debiteras nanopartiklar10) och utlöst (t.ex. hypertermi7) läkemedelsfrisättning.
Som påpekat tidigare, fixering kan förstöra liposomalt nanocarriers nästan omedelbart och DXR släppt form dessa förstörda liposomer fortfarande hade tid att ange kärnan, vilket gör tolkningen av data mycket svårt och även vilseledande. Med några mikroskopiska justeringar, kan kemoterapeutiska ödet i levande celler och vävnader rutinmässigt undersökas för att bekräfta eller störta histologiska observationer. En nyligen papper visade det upptag, release och lokalisering av DXR i celler behandlas med gratis och inkapslade dox använder live-cell time-lapse imaging9. Detta arbete beskriver den experimentellt ställa in mer i detalj. Med denna modell, är det möjligt att visualisera omedelbar transport av dox till kärnan, där det kontinuerligt ackumuleras tills cellen dör så småningom. När Dox-NP används, finns däremot endast små mängder släppt dox i kärnan. Även om kontinuerlig exponering resulterar i kontinuerlig DXR uppbyggd, fluorescerande signalen är mycket lägre i Dox-NP-kontra dox-behandlade celler, som visar en skillnad i cellulära koncentrationen och efterföljande cytotoxicitet. Dessutom med hjälp av live-cells markörer, visades det att, när utsätta celler till Dox-NP, DXR och nanocarrier ligger i lysosomen. Detta indikerar att den komplett Liposom tas upp av cellen och visar ett endocytic väg medverkan under upptaget av dessa nanopartiklar. DXR i kärnan är tydligt från släppta dox. Dock är använder denna metod, som både DXR och carrier Co lokalisera och verkar vara anhållna i lysosomer, det fortfarande osäkert om detta är inkapslat eller släppt dox. Det är möjligt att nanopartikelportföljen inneboende stabilitet förhindrar dox release när lokaliserad i lysosomen.
I detta protokoll demonstreras live-cell imaging med en specifik mikroskopiska setup, med skräddarsydda scenen hållare (specifikationerna kan ges på begäran). Mest confocal Mikroskop tillverkar erbjuder dock ett utbud av inkubatorer som utför live-cell imaging. Bevara cell odlingsbetingelser (dvs temperatur, CO2, pH, luftfuktighet och sterilitet) är det viktigaste kriteriet av dessa inkubatorer och kräver vissa preliminära tester för att fastställa lämpliga villkor, som förklaras närmare. Automatiserad data förvärv program kan också levereras av samma tillverkar. En ”Multi läge” alternativet gör det möjligt att bild flera positioner i samma kammare, raffinering statistisk analys. Det här alternativet i makrot nämns i detta manuskript kräver dock fasta XYZ positioner, som möjligheten att korrigera för Z-drift är förlorad. Skanna den Z-dimensionen kan inkluderas i detta makro och använder fokus planet för analys. Detta kräver dock extra scanning, ökar möjligheten att fototoxicitet och blekning.
Som med alla fluorescerande mätningar, är överexponering ett problem, särskilt när man jämför två föreningar med en olika cellernas upptag. Fluorescerande intensiteten är inte bara beroende på inneboende signalen av föreningen, utan även på andelen upptag, koncentrationen och drog exponeringstiden. Som visas i figur 3, är nukleära DXR innehållet i dox-behandlade celler redan synliga, medan ingen signal ses i Dox-NP-behandlade celler. Endast genom att öka känsligheten kan DXR i Dox-NP-behandlade celler visualiseras, leder till överexponering i dox-behandlade celler. Dessutom även intracellulärt, Dox-NP är heterogent fördelat, vilket kan resultera i oundvikliga under- eller överexponering. Särskilt när du undersöker cellulära DXR entrapment, minskade vinsten betydligt för att särskilja enskilda organeller (siffror 5B och 5 C). Således åtföljas de mätningar som representeras av pixeltätheten av de representativa bilderna för korrekt tolkning av resultaten.
Fototoxicitet, blekning och en låg signal-brus-förhållande är också viktiga frågor i fluorescerande mikroskopi, och en kompromiss mellan kvaliteten på bilden och bilden förvärvet måste fastställas. Även när Mikroskop installationen är optimal, avgörs bildkvaliteten också till stor del dock av kvaliteten på cellerna och lade till föreningen. DXR ger en stark signal, och med de lämpliga försiktighetsåtgärderna, blekning inte observerades även efter längre perioder (upp till 72 h). Minskning av fluorescerande signalen kan dock också vara ett resultat av efflux. Efflux är ett viktigt fenomen i drogen motstånd15 och uppstår när celler pumpa ut läkemedlet från intracellulära platsen för åtgärden. En minskning av fluorescerande signalen över tid kan därför också vara ett resultat av dox efflux9. Jämföra fluorescerande signalera av en icke-skannas läge i slutet av experimentet med den sista bilden från time-lapse-serien kommer att demonstrera blekning (dvs signalen kommer att vara högre i det icke-skannas läget) eller efflux (dvs båda signaler kommer att vara identiska). Det finns flera correctional alternativ (t.ex. bakgrund, vindavdrift, blekning, etc.) i program som liknar ImageJ16. Som fluorescerande intensiteten ökar över tiden, kan konfigurationsinställningarna också pre utvärderades i ett pilotprojekt experiment för att minimera överexponering i slutet av det time-lapse (steget 3.21). En tänkbar kammare med celler redan utsätts för läkemedlet för önskad tidsperiod kan alternativt användas för att initiera inställningar. Slutligen för denna typ av analys, giftiga läkemedelskoncentrationen (steg 3.22) bör undvikas och förutbestämd använder konventionella bio-analyser.
Celler odlade kontinuerligt och underhålls i medium utan fenolrött. Fenolrött fluorescerar i den röda delen av spektrat och kan observeras i cellernas organeller, troligen lysosomer, presentera falskt positiva information (steg 1.2). För att möjliggöra övervakning av enskilda celler, bör cell sammanflödet inte överstiga 70% (steg 3.1.). CO2 flöde-hastighet (steg 3.5) behöver regleras i ett validering experiment när utrustningen köps eller efter underhåll. När hastigheten är för hög, kommer att medium avdunsta. När hastigheten är låg, kommer att pH av medium öka, vilket kan påverka cellernas tillväxt. Som medium är utan de indikatorn fenolrött pH-förändringarna i pH inte kan observeras och därför förbises lätt. När CO2 flödet valideras, kan dessa inställningar användas i alla framtida experiment.
Med metoden som beskrivs här, kan öde av nanopartiklar lätt undersökas med hjälp av live-cell imaging och time-lapse mikroskopi. I den här proceduren användes kommersiellt tillgängliga nanopartiklar. Men ödet för värmekänslig17, katjoniska liposomer10; liposomer berikad med kortkedjade shingolipids18; och nanopartiklar encapsulating andra droger8,19 undersöktes också på detta sätt i tumören och normala celler.
The authors have nothing to disclose.
De mikroskopi utrymmen som används är en del av stadens Erasmus optisk Imaging, och vi vill tacka Personalen på OIC för sina tjänster.
DMEM (no phenol-red) | Sigma | D1145 | Supplemented with 1 mM L-glutamine and 10 % FCS |
Trypsin-versene (EDTA) | Lonza | BE17-161E | |
Fetal calf serum | Sigma | F7524 | Heat inactivate for 30 min at 55 ºC |
L-Glutamin | Lonza | BE17-605E | |
Gelatin from bovine skin | Sigma | G9391 | Make a 0,1% solution in PBS, sterile |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma | D8537 | |
Stericup 0,22 µm filter – 500 ml | Millipore | SCGPU05RE | |
Trypan-blue | Sigma | T8154 | |
Cells: Lewis lung carcimoma | ATCC | CRL-1642 | |
Cells: B16BL6 | Dr. P. Brouckaert, Ghent University | donated | Ref.10 |
Cells: BLM and 1F6 | Dr. van Muijen, University of Nijmegen | donated | Ref.11 |
Petri dish | Greiner | 664160 | |
Doxorubicin | Actavis | mentioned as dox in the manuscript | |
Doxil/Caelyx | Janssen-Cilag | mentioned as Dox-NP in the manuscript | |
Syringe filter 0.2 µm | VWR international | 10462200 | |
Lysotracker-green DND-26 | Invitrogen | L7526 | mentioned as lyosomal marker (LM)-green in manuscript |
Lysotracker-red DND-99 | Invitrogen | L7528 | mentioned as lyosomal marker (LM)-red in manuscript |
Attofluor cell ring | Invitrogen | A7816 | |
Cover glass 25 mm #1 | Thermo scientific | CB00250RA1 | |
Stage holder + sealing lid | Custom made | ||
ZEISS LSM 510 microscope | Zeiss | ||
Software LSM 510 version 3.2 SP2 | Zeiss | ||
Image J | NIH | https://imagej.nih.gov/ij/index.html |