Dette papir præsenterer en protokol til behandling af cryo-EM-billeder ved hjælp af softwarepakken SPHIRE. Den nuværende protokol kan anvendes til næsten alle enkeltpartikel-EM-projekter, der er rettet mod nær-atomopløsning.
SPHIRE (SPARX til højopløsningselektronmikroskopi) er en ny åben, brugervenlig softwarepakke til halvautomatisk behandling af enkeltpartikelelektronkryomikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen, der præsenteres her, beskriver detaljeret, hvordan man opnår en nær-atomopløsningsstruktur startende fra cryo-EM mikrograph-film ved at lede brugerne gennem alle trin i den enkelte partikelstrukturbestemmelsesrørledning. Disse trin styres fra den nye grafiske brugergrænseflade SPHIRE og kræver minimal brugerintervention. Ved anvendelse af denne protokol blev en 3,5 Å struktur af TcdA1, et Tc toxinkompleks fra Photorhabdus luminescens , afledt af kun 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinede tilgang vil hjælpe nybegyndere uden omfattende behandlingserfaring og a priori strukturelle oplysninger for at opnå støjfrie og upartiske atommodeller af deres oprensede makromolekylære komplekser i deres oprindelige tilstand.
Efter udviklingen af direkte elektrondetektorteknologien omformes de bemærkelsesværdige fremskridt i single particle cryo-EM i øjeblikket om strukturel biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi kræver denne teknik kun en lille mængde proteinmateriale uden behov for krystallisation, samtidig med at der stilles færre restriktioner for renhed af prøven og stadig tillader bestemmelse af strukturer ved næratomisk opløsning. Vigtigt kan forskellige sammensætninger eller tilstande nu beregnes adskilt, og strukturbestemmelsen af de forskellige konformationer kan udføres ved hidtil uset detaljeringsniveau. For nylig kunne tæthedskort af udfordrende molekyler fremstilles ved opløsninger, der tillod de novo modelbygning og dermed en dyb forståelse af deres virkemåde 2 , 3 , 4 , 5.
En bred vifte af billedbehandlingsprogrammer er tilgængelige i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfundet (https://en.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste af dem er under kontinuerlig udvikling. Næratomisk opløsning er opnået for proteiner, der udviser forskellige molekylvægte og symmetrier med flere forskellige softwarepakker, herunder EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke kræver et andet niveau af brugerkompetence og giver et andet niveau af brugervejledning, automatisering og udvidelighed. Desuden, mens nogle programmer giver komplette miljøer til at lette alle trin i billedanalyse, er andre designet til at optimere specifikke opgaver, såsom forfining af justeringsparametre fra en kendt rEference struktur. For nylig er der udviklet flere platforme, herunder APPION 12 og SCIPION 13 , der giver en enkeltbehandlingsrørledning, der integrerer tilgange og protokoller fra de forskellige softwarepakker, der er anført ovenfor.
For at bidrage til den nuværende udvikling af cryo-EM blev SPARX genudviklet til en ny stand-alone og komplet platform for enkeltpartikelanalyse, kaldet SPHIRE (SPARX for High-Resolution Electron Microscopy). For at øge tilgængeligheden af teknikken til nye forskere på området og at klare den store mængde data, der produceres af moderne fuldt automatiserede high-end elektronmikroskoper, blev behandlingsrørledningen redesignet og forenklet ved at indføre en nem at bruge Grafisk brugergrænseflade (GUI) og automatisering af de vigtigste trin i arbejdsgangen. Derudover blev nye algoritmer tilsat for at tillade hurtig, reproducerbar og automatiseret strukturbestemmelse fra crYo-EM billeder. Endvidere blev validering ved reproducerbarhed indført for at undgå almindelige artefakter produceret under raffinering og heterogenitetsanalyse.
Selv om programmet blev ændret i vid udstrækning, blev dets værdsatte kerneegenskaber opretholdt: ligefrem åben kildekode, det moderne objektorienterede design og Python-grænseflader til alle grundlæggende funktioner. Således blev det ikke ændret til et sort box-program, der gør det muligt for brugerne at studere og nemt ændre Python-koden, for at oprette yderligere applikationer eller ændre den samlede arbejdsgang. Dette er især nyttigt for ikke-standardiserede cryo-EM projekter.
Her præsenterer vi en protokol for at opnå et nær-atomisk opløsningstæthedskort fra cryo-EM-billeder ved hjælp af GUI fra SPHIRE. Det beskriver i detaljer alle trin, der kræves for at generere et tæthedskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilm og er ikke begrænset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokol har primært til hensigt at lede newcOmers i feltet gennem arbejdsgangen og give vigtige oplysninger om vigtige trin i behandlingen samt nogle af de mulige faldgruber og forhindringer. Mere avancerede funktioner og den teoretiske baggrund bag SPHIRE vil blive beskrevet andetsteds.
Enkeltpartikelkryo-EM har vist en hurtig udvikling i de seneste år og leveret talrige atomopløsningsstrukturer af makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For at understøtte det store antal nybegyndere, der aktuelt kommer ind i feltet, udviklede vi single-particle image analyse platformen SPHIRE og præsenterer her en gennemgangsprotokol for hele workflowen herunder filmjustering, partikelplukning, CTF estimering, indledende model Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, høj opløsning 3D raffinement og lokal opløsning estimering og filtrering.
Den her beskrevne protokol er beregnet som en kort vejledning til 3D-strukturbestemmelse ved anvendelse af cryo-EM mikrografer af proteinet af interesse og ved hjælp af beregningsværktøjer tilvejebragt af SPHIRE's stand-alone GUI.
Hovedtræk i arbejdsgangen er det mestAf procedurerne skal kun køres én gang, da de er afhængige af begrebet validering ved reproducerbarhed 19 og ikke kræver parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanisme er en hovedfordel ved SPHIRE over andre softwarepakker, da resultaterne er tilbøjelige til at være objektive såvel som reproducerbare og vigtigst af alt opnåelige til en acceptabel beregningskostnad. Rørledningen giver desuden et væld af diagnostiske oplysninger for erfarne brugere at foretage yderligere uafhængig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynder bruger, der har mindst elementær teoretisk baggrund i strukturbiologi og elektronmikroskopi, kunne opnå strukturer med nær atomopløsning ved brug af egne data og de automatiske valideringsprocedurer.
At opnå en nær-atomopløsningsstruktur er imidlertid ikke altid ligetil, og resultatet vil højst afhænge af kvaliteten af prøven og input-dataen. For de procedurer, der præsenteres her, antages det, at der er til rådighed et tilstrækkeligt antal ukorrekte råmiljøer af høj kvalitet, med deres gennemsnit, der viser klart synlige homogene og tilfældigt orienterede enkeltpartikler. Generelt er der ingen begrænsninger med hensyn til symmetri, størrelse eller overordnet form af molekylet, men en lavmolekylær vægt kan være en begrænsende faktor, især når proteinet har en featurløs kugleform. Normalt er analyse af større, velordnede partikler med højpunkts-gruppesymmetri mindre krævende. Derfor anbefales det kraftigt for nybegyndere at køre den nuværende protokol først med et velkendetegnet cryo-EM datasæt. Enten SPHIRE-tutorial-dataene (http: /sphire.mpg.de) eller et af EMPIAR-indsendte datasæt (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilm er et godt udgangspunkt .
Ved behandling af egne data er det meget sandsynligt, at nogle datasæt eller nogle af billederne ikke vil tilfredsstille visse kvalifikationerTy kriterier. I denne sammenhæng ud over den automatiske stabilitet og reproducerbarhedskontrol, der udføres af programmet til større trin i arbejdsgangen, anbefales det stadig for brugerne at visuelt inspicere resultaterne ved visse "kontrolpunkter" i protokollen, især hvis den endelige rekonstruktion Er ikke tilfredsstillende.
Den første visuelle inspektion kan udføres på mikrografniveau efter filmjusteringen ( protokol trin 2 ) og CTF estimationen ( protokol trin 3 ). De resulterende bevægelseskorrigerede middelværdier bør vise klart synlige og velafskilte enkeltpartikler, og deres effektspektre skal vise klart synlige, isotrope Thon-ringe. Den rumlige frekvens, som de er synlige, definerer i de fleste tilfælde den højeste opløsning, som strukturen i princippet i sidste ende kan bestemmes af. Eksempler på et bevægelseskorrigeret gennemsnit af tilstrækkelig kvalitet og dens effektspektrum er vist i afsnittet & #34; Repræsentative resultater. "Outlier-billeder, der kan have en negativ indvirkning på det endelige resultat, kan fjernes ved hjælp af SPHIREs GUI-værktøjer til drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
Med hensyn til partikel screening er det afgørende trin i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifikationen ved brug af ISAC ( protokol trin 5.2) . Her skal brugeren kontrollere, at de reproducerbare 2D-klassemiddeldata identificeres automatisk ved hjælp af programmet, idet der vedtages en række orienteringer, der er tilstrækkelige til at dække vinkelrummet på lige fod. Hvis kvaliteten af klassens gennemsnit ikke er tilfredsstillende (støjende og / eller uskarpe billeder) og / eller antallet af reproducerbare klasse gennemsnit er meget lavt, overveje at forbedre automatisk plukningskvalitet, optimere datasæt billeddannelse eller prøve forberedelse. I de fleste tilfælde er det ikke muligt at beregne en pålidelig rekonstruktion fra et datasæt, der ikke giver gode 2D klasse gennemsnit. Eksempler på høj kvalitet 2D klasse aveRaser vises i afsnittet "repræsentative resultater".
Mindst 100 klasse gennemsnit er påkrævet for at opnå en pålidelig indledende 3D model ved hjælp af RVIPER på en automatiseret måde ( Protokol trin 6.1 ). For dette trin skal brugeren vælge gennemsnitene med højeste kvalitet og inddrage så mange forskellige orienteringer af partiklen som muligt. Kvaliteten af den oprindelige model er afgørende for succesen med den efterfølgende højopløsnings 3D-raffinement.
I andre softwarepakker udføres der undertiden 3D-klassificering for at fjerne "dårlige" partikler 8 , 9 . I SPHIRE elimineres de fleste af disse partikler automatisk allerede under 2D-klassificering ved brug af ISAC. Det anbefales derfor at udføre det beregningsintensive trin med 3D sortering, hvis rekonstruktionen og 3D variabilitetsanalysen angiver datasætets heterogenitet.
Vigtigst bør brugeren omhyggeligt inspicere de resulterende 3D-mængder omhyggeligt ( protokol trin 9.3 ) og bekræfte, at funktionerne i den pågældende densitet stemmer overens med den nominelle opløsning. Ved en opløsning på <9 Å bliver stanglignende densiteter svarende til a-helixer synlige. Ved en opløsning <4.5 Å er densiteter svarende til tråde i β-ark normalt godt adskilte og omfangsrige aminosyrer bliver synlige. Et kort med høj opløsning (<3 Å) skal vise tydelige sporbare sidekæder, hvilket gør det muligt at opbygge en nøjagtig atommodel.
Resultater opnået til dato viser, at den foreliggende protokol ved anvendelse af SPHIREs automatiske reproducerbarhedsprøver og minimal visuelle inspektioner generelt er anvendelig for enhver type enkeltpartikel-cryo-EM-projekt. Repræsentative resultater af hvert behandlingstrin vises for rekonstruktionen af TcdA1-toksinet afPhotorhabdus luminescens 21 , som er blevet løst til nær-atomopløsning. Tæthedskort af tilsvarende kvalitet kan bruges til at konstruere pålidelige atommodeller ved hjælp af de novo backbone-sporing samt gensidig eller reel rumforfining og således tilvejebringe en solid strukturel ramme for forståelsen af komplekse molekylære mekanismer.
ACCESSION CODES:
Koordinaterne til EM-strukturen og de ubehandlede film er blevet deponeret i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltrædelsesnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker D. Roderer for at give os TcdA1 mikrografier. Vi takker Steve Ludtke for hans løbende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbejde blev støttet af midler fra Max Planck Society (til SR) og Det Europæiske Råd under EU's syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (tilskud nr. 615984) (til SR) og tilskud fra National Institutes of Sundhed R01 GM60635 til PAP).
SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
Falcon II direct electron detector | FEI | ||
EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |