Dette papiret presenterer en protokoll for behandling av kryo-EM-bilder ved hjelp av programvarepakken SPHIRE. Den nåværende protokollen kan brukes for nesten alle single-partikkel-EM-prosjekter som retter seg mot nær-atomoppløsning.
SPHIRE (SPARX for høyoppløselig elektronmikroskopi) er en ny åpen kildekode, brukervennlig programvarepakke for halvautomatisert behandling av enkeltpartikkel-elektronkryo-mikroskopi (cryo-EM) data. Protokollen som presenteres her, beskriver i detalj hvordan man oppnår en nær-atomoppløsningsstruktur som starter fra cryo-EM mikrograph-filmer ved å lede brukerne gjennom alle trinnene i enkeltpartikkelstrukturbestemmelsesrørledningen. Disse trinnene styres fra det nye grafiske brukergrensesnittet SPHIRE og krever minimum brukerintervensjon. Ved bruk av denne protokollen ble en 3,5 Å-struktur av TcdA1, et Tc- toksinkompleks fra Photorhabdus luminescens , avledet fra bare 9500 enkeltpartikler. Denne strømlinjeformede tilnærmingen vil hjelpe nybegynnere uten omfattende behandlingserfaring og a priori strukturell informasjon for å oppnå støyfrie og upartiske atommodeller av deres rensede makromolekylære komplekser i deres opprinnelige tilstand.
Etter utviklingen av direkte elektrondetektorteknologien omformes den bemerkelsesverdige fremdriften i single particle cryo-EM for tiden strukturell biologi 1 . Sammenlignet med røntgenkrystallografi krever denne teknikken kun en liten mengde proteinmateriale uten behov for krystallisering, samtidig som det stilles færre restriksjoner på renhet av prøven og fortsatt tillater bestemmelse av strukturer ved næratomisk oppløsning. Viktig er at forskjellige komposisjoner eller tilstander nå kan beregnes separat og strukturbestemmelse av de forskjellige konformasjoner kan utføres på enestående detaljnivå. Nylig kunne tetthetskart av utfordrende molekyler bli produsert ved oppløsninger som tillater de novo modellbygging og dermed dyp forståelse av deres virkemåte 2 , 3 , 4 , 5.
Et bredt utvalg av programvare for bildebehandling er tilgjengelig i 3DEM (3D Electron Microscopy) -samfunnet (https://no.wikibooks.org/wiki/Software_Tools_For_Molecular_Microscopy), og de fleste av dem er under kontinuerlig utvikling. Nær-atomoppløsning er oppnådd for proteiner som har forskjellige molekylvekter og symmetrier med flere forskjellige programvarepakker, inkludert EMAN2 6 , IMAGIC 7 , FREALIGN 8 , RELION 9 , SPIDER 10 og SPARX 11 . Hver pakke krever et annet nivå av brukerkompetanse og gir et annet nivå av brukerveiledning, automatisering og utvidbarhet. Dessuten, mens noen programmer gir komplette miljøer for å lette alle trinnene i bildeanalyse, er andre designet for å optimalisere bestemte oppgaver, for eksempel forfining av justeringsparametere som starter fra en kjent rEference struktur. I nyere tid har flere plattformer blitt utviklet, inkludert APPION 12 og SCIPION 13 , som gir en enkeltbehandlingsrørledning som integrerer tilnærminger og protokoller fra de forskjellige programvarepakker som er oppført ovenfor.
For å bidra til den nåværende utviklingen av cryo-EM, ble SPARX videreutviklet til en ny frittstående og komplett plattform for enkeltpartikkelanalyse, kalt SPHIRE (SPARX for High Resolution Electron Microscopy). For å øke tilgjengeligheten av teknikken til nye forskere på feltet og å takle den store mengden data produsert av moderne fullautomatiserte high-end elektronmikroskoper, ble prosesseringsrøret redesignet og forenklet ved å introdusere en brukervennlig Grafisk brukergrensesnitt (GUI) og automatisering av de viktigste trinnene i arbeidsflyten. Videre ble nye algoritmer tilsatt for å tillate rask, reproduserbar og automatisert strukturbestemmelse fra crYo-EM bilder. Videre ble validering ved reproduserbarhet introdusert for å unngå vanlige artefakter produsert under raffinering og heterogenitetsanalyse.
Selv om programmet var omfattende endret, ble de verdsatt kjernefunksjonene opprettholdt: rettferdig åpen kildekode, det moderne objektorientert design og Python-grensesnitt for alle grunnleggende funksjoner. Dermed ble det ikke endret til et svart boks program, slik at brukerne kan studere og enkelt endre Python-koden, for å lage flere applikasjoner eller endre den samlede arbeidsflyten. Dette er spesielt nyttig for ikke-standardiserte kryo-EM-prosjekter.
Her presenterer vi en protokoll for å skaffe et nær-atom-oppløsningstetthetskart fra cryo-EM-bilder ved hjelp av SPI-GUI. Det beskriver i detalj alle trinn som kreves for å generere et tetthetskort fra rå cryo-EM direkte detektorfilmer og er ikke begrenset til en bestemt makromolekyltype. Denne protokollen skal primært veilede newcOmers i feltet gjennom arbeidsflyten og gi viktig informasjon om viktige trinn i behandlingen, samt noen av de mulige fallgruvene og hindringene. Mer avanserte funksjoner og den teoretiske bakgrunnen bak SPHIRE vil bli beskrevet andre steder.
Enkeltpartikkel-kryo-EM har vist en rask utvikling i de senere år og levert mange atomoppløsningsstrukturer av makromolekylære komplekser med stor biologisk betydning 25 . For å støtte det store antallet nybegynnere som går inn i feltet, utviklet vi single-particle image analyse plattformen SPHIRE og presenterer her en gjennomgående protokoll for hele arbeidsflyten, inkludert filmjustering, partikkel plukking, CTF estimering, innledende modell Beregning, 2D og 3D heterogenitetsanalyse, 3D-raffinement med høy oppløsning og lokal oppløsning estimering og filtrering.
Protokollen beskrevet her er ment som en kort guide til 3D-strukturbestemmelse ved bruk av cryo-EM mikrografer av proteinet av interesse og ved hjelp av beregningsverktøy som tilbys av det frittstående GUI av SPHIRE.
Hovedtrekk i arbeidsflyten er det mestAv prosedyrene må bare kjøres én gang, siden de stoler på konseptet om validering ved reproduserbarhet 19 og krever ingen parameterjustering. Denne automatiske valideringsmekanismen er en hovedfordel for SPHIRE over andre programvarepakker, siden resultatene pleier å være objektive samt reproduserbare og, viktigst, oppnåelig ved en akseptabel beregningskostnad. Rørledningen gir i tillegg et vell av diagnostisk informasjon for erfarne brukere å gjennomføre ytterligere uavhengig validering og vurdering med egne metoder. Ikke desto mindre skal en nybegynner som har minst elementær teoretisk bakgrunn i strukturell biologi og elektronmikroskopi, kunne oppnå nær-atomoppløsningskonstruksjoner ved å bruke egne data og de automatiserte valideringsprosedyrene.
Imidlertid er det ikke alltid lett å skaffe seg en nær-atomoppløsningskonstruksjon, og resultatet vil høyt avhenge av kvaliteten på prøven og inngangsdataeten. For prosedyrene som presenteres her antas det at et tilstrekkelig antall ujevnede rå EM-filmer av høy kvalitet er tilgjengelige, med gjennomsnitt som viser tydelig merkbare homogene og tilfeldig orienterte enkeltpartikler. Generelt er det ingen begrensninger for molekylets symmetri, størrelse eller overordnede form, men en lavmolekylvekt kan være en begrensende faktor, spesielt når proteinet har en featurløs kuleform. Vanligvis er analyse av større, velordnede partikler med høypunkts-gruppesymmetri mindre krevende. Derfor anbefales det sterkt for nybegynnere å kjøre dagens protokoll først med et godt karakterisert cryo-EM datasett. Enten SPHIRE opplæringsdataene (http: /sphire.mpg.de) eller et av EMPIAR-innsendte datasettene (https://www.ebi.ac.uk/pdbe/emdb/empiar/) med råfilmer er et godt utgangspunkt .
Når du behandler egne data, er det svært sannsynlig at enkelte datasett eller noen av bildene ikke tilfredsstiller visse kvalifikasjonerTy kriterier. I tillegg til dette, i tillegg til de automatiserte stabilitets- og reproduserbarhetskontrollene som utføres av programmet for de viktigste trinnene i arbeidsflyten, anbefales det fortsatt at brukerne visuelt inspiserer resultatene ved bestemte "kontrollpunkter" i protokollen, spesielt hvis den endelige rekonstruksjonen Er ikke tilfredsstillende.
Den første visuelle inspeksjonen kan gjøres på mikrografnivået etter filmjusteringen (protokoll trinn 2 ) og CTF estimeringen (protokoll trinn 3 ). De resulterende bevegelseskorrigerte gjennomsnitt skal vise klart merkbare og velskilte partikler, og deres effektspekter skal vise tydelige, isotrope Thon-ringer. Den romlige frekvensen som de er synlige, definerer i de fleste tilfeller den høyeste oppløsningen som strukturen i utgangspunktet kan bestemmes til slutt. Eksempler på et bevegelseskorrigert gjennomsnitt av tilstrekkelig kvalitet og dens strømspektrum er vist i avsnittet & #34; Representative resultater. "Outlier bilder som kan ha en negativ innvirkning på sluttresultatet, kan fjernes ved hjelp av SPHIREs GUI-verktøy for drift og CTF (http://sphire.mpg.de/wiki/doku.php).
Med hensyn til partikkelscreening er det avgjørende trinnet i SPHIRE-rørledningen 2D-klassifiseringen ved bruk av ISAC (protokoll trinn 5.2) . Her skal brukeren kontrollere at de reproduserbare 2D-klassens gjennomsnitt identifiseres automatisk ved at programmet vedtar en rekke retninger som er tilstrekkelig til å kvasjevikt dekke vinkelrommet. Hvis kvaliteten på klassenes gjennomsnitt ikke er tilfredsstillende (støyende og / eller uskarpe bilder) og / eller antall reproduserbare klasse gjennomsnitt er svært lav, bør du vurdere å forbedre automatisk plukkingskvalitet, optimalisere datasettbilder eller prøvepreparering. I de fleste tilfeller er det ikke mulig å beregne en pålitelig rekonstruksjon fra et datasett som ikke gir gode 2D klasse gjennomsnitt. Eksempler på høy kvalitet 2D klasse aveRaser er vist i avsnittet "Representative resultater".
Det kreves minst 100 klassemidlere for å oppnå en pålitelig innledende 3D-modell ved hjelp av RVIPER på en automatisk måte (protokoll trinn 6.1 ). For dette trinnet bør brukeren velge gjennomsnittet med høyeste kvalitet og inkludere så mange forskjellige orienteringer av partikkelen som mulig. Kvaliteten på den innledende modellen er kritisk for suksessen til den etterfølgende 3D-raffinement med høy oppløsning.
I andre programvarepakker utføres noen ganger 3D-klassifisering for å fjerne "dårlige" partikler 8 , 9 . Imidlertid i SPHIRE elimineres de fleste av disse partiklene automatisk allerede under 2D-klassifisering ved bruk av ISAC. Det anbefales derfor å utføre det beregningsintensive trinnet med 3D-sortering bare hvis rekonstruksjonen og 3D-variabilitetsanalysen indikerer heterogenitet av datasettet.
Viktigst av alt, må brukeren nøye inspisere de resulterende 3D-volumene nøye (Protokoll trinn 9.3 ), og bekrefte at egenskapene til den aktuelle tettheten stemmer godt overens med den nominelle oppløsningen. Ved en oppløsning på <9 Å blir stangliknende tettheter tilsvarende a-helixer synlige. Ved en oppløsning <4.5 Å, er tettheter som tilsvarer tråder i β-ark, normalt godt separert og omfangsrike aminosyrer blir synlige. Et kart med høy oppløsning (<3 Å) skal vise tydelig merkbare sidekjeder, slik at byggingen av en nøyaktig atommodell kan bygges.
Resultatene som er oppnådd hittil, viser at ved hjelp av SPHIREs automatiserte reproduksjonsprøver og minimal visuell inspeksjon, er foreliggende protokoll generelt anvendelig for alle typer enkeltpartikkel-kryo-EM-prosjekter. Representative resultater fra hvert behandlingstrinn er vist for rekonstruksjon av TcdA1-toksinet avPhotorhabdus luminescens 21 , som har blitt løst til nær-atomoppløsning. Tetthetskart av tilsvarende kvalitet kan brukes til å konstruere pålitelige atommodeller ved hjelp av de novo ryggradssporing samt gjensidig eller real-space-raffinering, og derved gi et solidt strukturelt rammeverk for forståelse av komplekse molekylære mekanismer.
TILTAK KODER:
Koordinatene for EM-strukturen og de ubehandlede filmene er deponert i Electron Microscopy Data Bank og Electron Microscopy Pilot Image Archive under tiltaksnummer EMD-3645 og EMPIAR-10089.
The authors have nothing to disclose.
Vi takker D. Roderer for å gi oss TcdA1 mikrografer. Vi takker Steve Ludtke for hans løpende støtte til EMAN2-infrastrukturen. Dette arbeidet ble støttet av midler fra Max Planck Society (til SR) og Det europeiske råd under EUs syvende rammeprogram (FP7 / 2007-2013) (stipend nr. 615984) (til SR) og tilskudd fra National Institutes of Helse R01 GM60635 til PAP).
SPHIRE | Max Planck Institute of Molecular Physiology- Dortmund and Houston Medical School, Houston, Texas | http://sphire.mpg.de | |
UCSF Chimera | University of California, San Francisco | http://www.cgl.ucsf.edu/chimera/ | |
Unblur | Janelia Farm Research Campus, Ashburn | http://grigoriefflab.janelia.org/unblur | |
Coot | MRC Laboratory of Molecular Biology, Cambridge | http://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | |
EMAN2 | Baylor College of Medicine, Houston | http://blake.bcm.edu/emanwiki/EMAN2 | |
Computing Cluster with 1824 cores | Max Planck Institute of Molecular Physiology | Linux Cluster with 76 nodes, each with 2 Processors Xeon E5-2670v3 12C 2.30 GHz and 128 Gb RAM | |
TITAN KRIOS electron microscope | FEI | 300 kV, Cs correction, XFEG | |
Falcon II direct electron detector | FEI | ||
EPU (automated data acquisition software) | FEI | https://www.fei.com/software/epu/ |