Nous présentons ici un protocole pour le suivi des échantillons d’ARN génomique contamination ADN (génomique). La méthode présentée utilise des amorces spécifiques pour la région de l’espaceur interne transcrit (ITS) des gènes ribosomiques d’ADN (ADNr). La méthode est adaptée pour une détection fiable et sensible d’ADN contaminant dans la plupart des eucaryotes et des procaryotes.
Une méthode largement utilisée pour la quantification des modifications de l’expression génique et abondance de la transcription est quantitative PCR en temps réel de transcription inverse (RT-qPCR). Il fournit des résultats précis, sensibles, fiables et reproductibles. Plusieurs facteurs peuvent affecter la sensibilité et la spécificité de la RT-qPCR. L’ADN génomique résiduelle (ADNg) contamination des échantillons d’ARN est l’un d’entre eux. Dans l’analyse de l’expression génique, amplification non spécifique en raison de la contamination de l’ADNg surestime l’abondance des niveaux de transcription et peut affecter les résultats de la RT-qPCR. Généralement, l’ADNg est détecté par qRT-PCR utilisant des amorces paires recuit aux régions intergéniques ou un intron du gène d’intérêt. Malheureusement, les annotations intron/exon ne sont pas encore connues de tous les gènes de vertébrés, bactéries, protistes, champignons, plantes et espèces de métazoaires invertébrés.
Nous présentons ici un protocole pour des échantillons de détection de la contamination de la génomique dans l’ARN à l’aide de l’ADN ribosomique (ADNr)-basé des amorces. La méthode est basée sur les caractéristiques uniques de l’ADNr : leur nature multigénique, séquences hautement conservées et haute fréquence dans le génome. Également comme étude de cas, un ensemble unique d’amorces ont été conçus basés sur la région conservée de l’ADN ribosomique (ADNr) de la famille des Poaceae. L’universalité de ces paires d’amorces a été testée par courbe fonte analyse et agarose électrophorèse sur gel. Bien que notre méthode explique comment ADNr amorces peuvent être appliquées pour le dosage de contamination ADNg dans la famille des Poaceae, il pourrait être facilement utilisé à d’autres espèces procaryote et eucaryote
Explorant la régulation transcriptionnelle d’intéressant des ensembles de gènes ou de réseaux de signalisation est indispensable pour comprendre les mécanismes moléculaires complexes impliqués dans les événements biologiques1. Actuellement, l’analyse qPCR est le plus couramment approche pour gene expression études pouvant cibler (le génome) d’ADN ou ARN (le transcriptome) permettant l’analyse du transcriptome et de méthylome, respectivement. La transcription inverse (RT) suivie de qPCR est largement utilisée pour l’analyse du transcriptome qui mesurent les niveaux d’expression de gène dans divers domaines de la recherche biologique2. Par rapport à d’autres méthodes telles que l’hybridation traditionnelle du Nord, de la détection spécifique des tissus via in situ hybridation, essais de protection de la ribonucléase (RPA) et semi-RT-PCR, la précision, commodité, vitesse et une gamme dynamique de qPCR analyses sont hautement remarquable3,4. Il y a plusieurs facteurs importants qui doivent être considérés pour une quantification fiable des ARN messager (ARNm), y compris la qualité et la quantité d’ARN à partir de matériel. En outre, amplification non spécifique, l’efficacité de la RT-qPCR et l’efficacité de la PCR sont à considérer5,6.
La présence d’ADNg est un problème inhérent au cours de l’extraction de l’ARN, en partie, aux propriétés physiques et chimiques semblables de l’ADN et l’ARN7. En raison de l’identité de séquence génomique et l’ADN complémentaire (ADNc) dérivé des échantillons d’ADN messagère, amplification non spécifiques peut se produire, qui influeront sur l’exactitude des résultats de la RT-qPCR. L’ADNg restant conduira à une surestimation de l’abondance de cibler des ARNm dans gene expression analyse8.
Fondamentalement, l’amplicon non spécifiques pour la plupart découle formation de dimères amorce ou amplification de fond non spécifique en raison de la génomique, qui peuvent être évaluées en utilisant des échantillons de contrôle approprié. Ces échantillons sont aucun contrôle de modèle (NTC), aucun contrôle de la transcriptase inverse (NRT), respectivement. Étant donné que les niveaux de contamination de la génomique dans les échantillons étudiés sont différents et la sensibilité envers ADNg diffère grandement entre les gènes analysés, les contrôles NRT sont requis pour chaque paire d’échantillon/test. Bien que cela augmente considérablement le coût et le travail dans les études de profilage RT-qPCR, ces contrôles sont obligatoire,7,9.
Méthodes alternatives traitant ADNg contamination comprennent l’utilisation de paires d’amorces recuit aux régions intergéniques ou un intron du gène d’intérêt10et l’utilisation des amorces qui encadrent un grand intron ou couvrent une jonction exon-exon, c’est-à-dire les sites de recuit sont absents dans l’ARNm mature de la séquence1,4. Toutefois, les annotations intron/exon pour tous les gènes de nombreux vertébrés, bactéries, protistes, champignons, végétaux et métazoaires invertébrés sont encore connues. En outre, de nombreux organismes eucaryotes ont pseudogènes dérivés des évènements de duplication. En outre, conception d’amorce dans les introns ne garantit pas non-amplification de l’ADNg. Comme la chromatine accessibilité des régions génomiques de la DNase I varie, il est recommandé de concevoir les différentes amorces ciblant différents chromosomes10.
Les génomes des organismes eucaryotes peuvent englober jusqu’à un millier d’exemplaires de l’ADNr de gènes codant pour les sous-unités ribosomiques nécessaires pour la formation des ribosomes. Ces gènes ADNr sont souvent organisées en tableaux unique ou répété en tandem11. Polycistronique rRNA (Figure 1), y compris la grande sous-unité (LSU) et la petite sous-unité (SSU) est transcrits par l’ARN polymérase I (ARN j’ai). Le pre-rRNA qui en résultent est transformés en éliminant les deux régions de l’espaceur interne transcrit ITS1 et ITS2. Comme les produits finaux, trois matures rRNA, 17-18 s (SSU), 5. 8 s et 25-28 s ARNr (LSU) sont généré12. rADN est des représentants typiques d’une famille multigénique avec séquences hautement conservées. Ils se produisent avec une fréquence élevée dans le génome et sont potentiellement présents à plus d’une localisation chromosomique13. Le traitement de l’ARNr et la dégradation des entretoises transcrits sont un processus rapide dans le nucléole. En raison du degré élevé de répétition, le ratio du nombre de copies génomiques et détectables premolecules de RNA non transformées est inférieur par rapport aux séquences d’intron de faibles copies et précurseurs unspliced. Ces caractéristiques font de rADN, bien adapté pour une détection fiable et hautement sensible des ADNg contamination dans la plupart des eucaryotes et des procaryotes3.
Une nouvelle procédure de détection ADNg contamination dans les échantillons d’ARN est décrit ici. On présente un ensemble d’amorces universelles basé sur la séquence de l’ADNr conservée pour des analyses de génomique chez plusieurs espèces de graminées. La spécificité et l’universalité des amorces proposées ont été testés par l’analyse des courbes de fusion utilisant l’ADN comme gabarit. Notre protocole n’est pas seulement applicable aux Poaceae, mais pourrait facilement être adapté à d’autres espèces eucaryotes et procaryotes.
Analyse de l’expression génique par PCR quantitative a été largement appliquée dans ces dernières années. Le principal avantage de cette méthode rapide, rentable et automatisé est son résultat précis et exact. Cependant, gagner des avantages optimaux de ces avantages exige une compréhension claire de la configuration des paramètres utilisés pour l’expérience de qPCR. Pour obtenir un résultat fiable en qPCR analyse d’expression de gène, il est nécessaire éviter l’amplification non spécifique qui résulte de la contamination-dimère d’amorce ou ADNg dans l’échantillon des RNA3,15. Il est prévu que les niveaux de transcription d’ARN vont être surestimés l’ADNg contamination8. Ici, les caractéristiques uniques d’un gène d’ADNr a été jugé pour un dosage de contamination ADNg dans des échantillons d’ARN.
Des propriétés de base de l’ADNr utilisés dans le présent protocole : Les gènes ribosomiques se composent de deux secrétariats professionnels internationaux, à savoir ITS1 et ITS2 et les trois gènes codant ARNr, 17-18, 5. 8 s et 25-28 s sous-unité12. Deux régions ITS ne font pas partie de la séquence codante des sous-unités ribosomiques. Ils sont éliminés par au moins trois activités enzymatiques pour traiter le précurseur à mûrir ARNr : une activité exonucléase endonucléase et hélicase. Comme l’ARN ribosomique est transcrit comme une transcription polycistronique, un produit primaire contenant le SPI est certainement présent. Le traitement est très rapide et se déroule dans le nucléole, et la quantité de molécules précurseurs détectables contenant l’EVI est inférieure au seuil de détection de la méthode de qPCR. Par conséquent, lorsqu’ITS1 ou ITS2 sont amplifiées par ITS flanquant les amorces, aucune amplification ne peut être détectée dans des échantillons d’ARN sauf ADNg contamination est présente. Le nombre des ADNr gènes dans le génome d’organismes eucaryotes était estimé à inclure jusqu’à un millier d’exemplaires, qui est disposé dans des tableaux simples ou tandem sur les chromosomes11. Dans ce protocole, nous proposons une alternative, au lieu de NRT, pour détecter la contamination ADNg, qui est utilisée dans chaque réaction/essai.
Avantages et les limites en ce qui concerne les méthodes existantes : NRT est généralement utilisée pour tester si l’échantillon de RNA préparé est propre ou contaminé par ADNg. Depuis ADNg contamination n’est pas uniformément répartie entre les différents échantillons d’ARN, et la sensibilité de réaction de l’ADNg est considérablement affectée par les gènes analysés, NRT contrôles sont nécessaires pour chaque échantillon/dosage paire7,15. Ceci ajoutera considérablement le coût et le travail lors de la manipulation de plusieurs échantillons simultanément3,9. Autres méthodes alternatives dans la littérature comprennent l’utilisation des amorces spécifiques pour la détection de l’ADNg intron, ou des amorces de conception qui flanquent un intron ou couvrent une jonction exon-exon. Les limitations de ces méthodes proviennent de l’indisponibilité des informations de séquence intron, annotation incomplet de la structure de l’intron/exon et l’absence d’introns dans les gènes ou les pseudogènes d’intérêt1,4,10 . En raison de l’évolution, rADN existe en tant que familles de gènes multigénique et hautement conservée. Elles sont très abondantes dans le génome et présent sur différents chromosomes13. Comparées aux autres gènes codant ou nonconding, le rADN montre la meilleure solution pour la détection de la contamination de l’ADNg. Dans les analyses transcriptomiques comparative, la normalisation de qPCR données par calibrateur ARNr n’est pas recommandée pour certaines questions, telles que des différences de cDNA préparation (polyA amorçage vs hexamère aléatoire d’amorçage), de grandes différences dans l’abondance des ARNm et ARNr , et biogenèse différente qui peut-être générer trompeuse résultats10,16. Cependant, les problèmes que nous venons de parler sont un avantage pour le test de contamination ADNg. Par exemple, en ce qui concerne la plus grande abondance de site ciblage dans le génome et localisation sur des chromosomes différents, amorces ADNr améliorent considérablement la sensibilité de détection de l’ADNg en comparaison avec les méthodes existantes.
Polyvalence des ADNr basée sur d’autres organismes : rADN est une famille de gènes bien étudiés dans la plupart des organismes. La méthode proposée d’ADNr représente un système simple, économique et très sensible pour les tests de contamination ADNg qui peut être facilement adaptée à d’autres organismes eucaryotes et procaryotes (Protocole N° 2 – 5). Une étude de cas, nous avons démontré ici l’utilité de cette méthode dans certaines espèces de Poceae (Figure 4 et Figure 5). Les amorces utilisées montrent un taux élevé de transférabilité à d’autres espèces de Poceae en raison de la structure hautement conservée de sous-unités ADNr entre les espèces. Cette question devient encore plus importante lorsque suffisamment d’informations séquence génomique n’est pas disponible pour la conception d’amorce. Ainsi, ITS flanquante amorces d’une espèce peuvent être utilisés dans une espèce apparentée. En outre, les 5, 8 s-amorces de F/R ont été cueillies fondée sur un motif conservé qui montre la similitude élevée dans la plupart de plantes à fleurs14. Bien que les techniques de séquençage à haut débit en permanence augmentent le nombre de génomes connus, l’annotation de l’exon-intron de la plupart des organismes n’est pas terminée, et donc il n’est souvent pas possible de concevoir des amorces pour traverser une frontière exon-exon. Notre méthode explique comment axée sur l’ADNr amorces peuvent être appliquées pour le dosage de contamination ADNg qPCR analyse des procaryotes et des eucaryotes dans le but d’éliminer chers contrôles NRT dans chaque combinaison d’essai/amorces.
The authors have nothing to disclose.
Cette recherche a été financée par la génétique et l’Institut de biotechnologie agricole de Tabaristan (GABIT) Sari agricoles et l’Université des ressources naturelles (SANRU). Le groupe de recherche junior Abiotic Stress génomique a été financé par IZN (Centre interdisciplinaire de recherche sur les cultures végétales, Halle (Saale), Allemagne. Nous remercions Rhonda Meyer pour une lecture critique du manuscrit.
Maxima SYBR Green / ROX qPCR Master Mix (2X) | Thermo Scientific | K0221 | |
TissueLyser II | QIAGEN | 85300 | |
RevertAid H Minus First Strand cDNA Synthesis Kit | Thermo Scientific | K1631 | |
GeneRuler 100 bp Plus DNA Ladder | Thermo Scientific | SM0321 | |
96 well WHT/CLR | Bio-Rad | HSP9601 | |
Microseal B film | Bio-Rad | MJ-0558 | |
Low tube strip CLR | Bio-Rad | TLS0801 | |
Flat cap strips | Bio-Rad | TCS0803 | |
NanoDrop 2000 | Peqlab | ND-2000 | |
RNaseZAP | Ambion | 9780 | |
Centrifuge | Eppendorf | 5810 R | |
Agilent RNA 6000 Nano Kit | Agilent Technologies | 5067-1511 | |
2100 Electrophoresis Bioanalyzer | Agilent Technologies | G2939AA | |
RNase A, DNase and Protease-free | Thermo Scientific | EN0531 | |
DNase I, RNase-free | Thermo Scientific | EN0523 | |
TRIZOL Reagent | Ambion | 15596026 | |
CFX96 Touch Real-Time PCR Detection System | BIO RAD | 1855195 | |
PCR tube, 0.2 mL, RNase-free | Stratagene | Z376426 | |
Guanidine thiocyanate for molecular biology | Sigma-Aldrich | G9277 | |
Agarose – Nucleic Acid Electrophoresis | Sigma-Aldrich | A9414 | |
Boric Acid for molecular biology | AppliChem | A2940 | |
bromophenol blue | AppliChem | A2331 | |
ethidium bromide | AppliChem | A1151 | |
Gel documentation system | BIO RAD | Gel Doc 2000 |